Relatório cromatografia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DA BAHIA 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AMBIENTAIS E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL 
QUÍMICA ORGÂNICA EXPERIMENTAL 
PROFª.: DRª. KATYÚSCYA VELOSO LEÃO 
ESTUDANTE: DANILO GUIMARÃES DO REGO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório 01 – Cromatografia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Barreiras 
Maio de 2014 
1. Introdução 
Os diversos métodos de separação cromatográficos têm sido aplicados em milhares de 
laboratórios no mundo para decifrar os números e complexos problemas da química, da 
bioquímica, das ciências ambientais, etc. Esses métodos cromatográficos variam desde os de 
extrema simplicidade, que podem ser facilmente manipulados até os de alta sofisticação. 
A cromatografia pode ser classificada pelo tipo de interação entre a fase móvel e a 
estacionária, pela natureza das fases ou quanto ao fluxo da fase móvel empregada. Quanto ao 
fenômeno principal responsável pela separação é possível classificar o tipo como: adsorção, 
partição, troca iônica e exclusão. Quanto ao estado físico da fase móvel empregado a 
cromatografia é classificada em gasosa e liquida. A seguir uma breve descrição de alguns 
métodos cromatográficos: 
1.1. Cromatografia em camada fina 
A cromatografia em camada fina (TLC) e a cromatografia em camada fina de elevada 
performance (HPTLC) são freqüentemente referidas como métodos de Cromatografia Planar. 
Trata-se de uma técnica de separação clássica, internacionalmente estabelecida e distinguida 
pela sua flexibilidade, fiabilidade e rentabilidade. A cromatografia em camada fina oferece: 
Enorme flexibilidade; Método de separação econômico sem ser preciso recorrer a 
instrumentos sofisticados (apenas para a TLC); Possibilidade de processar amostras múltiplas 
(até 72) em simultâneo em condições semelhantes; Transparência e avaliação visual 
simultânea de todas as amostras e componentes das amostras; Preparação de amostras 
simplificada devido à utilização apenas da fase estacionária. 
1.2. Cromatografia em coluna 
A cromatografia em coluna é uma técnica usada para a separação e purificação de muitos 
compostos, em um volume maior que os utilizados na cromatografia planar. Essa técnica 
fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas. Adiciona-se à 
coluna de vidro o adsorvente (fase estacionária), geralmente alumina ou sílica gel, e a mistura 
a ser analisada é aplicada na parte superior da coluna. O eluente é passado através da coluna 
por gravidade. A coluna de vidro a ser utilizada deverá conter uma válvula para controle de 
fluxo de solvente. 
 
1.3. Cromatografia em papel 
 
Ou PC, do inglês "paper chromatography". É uma técnica de partição, utilizam dois líquidos, ou 
misturas de líquidos, um atuando como fase móvel (eluente) e outro, suportado sobre papel, 
atuando como fase estacionária. Ocorre a retenção das substâncias devido às diferentes 
afinidades para com as fases estacionária e móvel. Utiliza-se papel normal ou papel de filtro 
(mais utilizado) como suporte da fase estacionária. 
Exemplificando: a mistura é aplicada no papel e mergulhada na mistura das fases líquida e 
estacionária. A tira de papel de suporte é colocada em um cuba contendo o eluente. Esta fase 
móvel (solvente) sobe por capilaridade e arrasta a substância pela qual tem mais afinidade, 
separando-a das substâncias com maior afinidade pela fase estacionária. Como a maioria das 
substâncias separadas são incolores, utiliza-se um revelador. As manchas podem ser reveladas 
por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, 
fluorescências, radioatividade, etc. 
 
1.4. Cromatografia gasosa 
A fase móvel é um gás inerte, normalmente nitrogênio, hélio ou hidrogênio. Se a fase 
estacionária é um líquido temos a cromatografia gás-líquido ou cromatografia de partição, se a 
fase estacionária é um sólido temos a cromatografia gás-sólido ou cromatografia de adsorção. 
Em qualquer dos casos a coluna pode ser de empacotamento ou capilar aberta de sílica 
fundida. Deve-se conhecer a resolução e a eficiência da coluna para a amostra a ser analisada. 
RESOLUÇÃO de uma coluna é sua capacidade de separar satisfatoriamente dois picos 
adjacentes. 
EFICIÊNCIA de uma coluna é definida como sua capacidade de produzir picos estreitos e 
agudos. 
Na cromatografia gasosa existem diferentes detectores que devem ser selecionados de acordo 
com a mistura a ser separada. 
 
1.5. Cromatografia de Exclusão por Tamanho 
 
Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) é o modo dominante de separação para 
polímeros. Ela é baseada na discriminação dos componentes individuais da amostra pelos 
poros do material empacotado. Moléculas grandes não podem, ou podem apenas 
parcialmente penetrar nos poros, enquanto moléculas menores podem acessar a maioria dos 
menores poros. Dessa forma, moléculas maiores eluem primeiro, moléculas menores eluem 
depois e moléculas que conseguem acessar todos os poros eluem por último da coluna. 
SEC é geralmente chamada de cromatografia por filtração em gel quando trabalha com 
polímeros solúveis em água, enquanto cromatografia por permeação em gel é preferida ao se 
trabalhar com polímeros solúveis em solventes orgânicos. 
 
1.6. Cromatografia líquida de alta eficiência 
 
É uma técnica cromatográfica. Se distingue por usar a fase móvel à alta pressão (daí o 
"pressure" da sigla em inglês). O uso de pressões elevadas permite uma redução no diâmetro 
das partículas da fase estacionária, localizada no interior da coluna cromatográfica. O uso de 
partículas menores (na ordem de 5,0 µm) no recheio da coluna resulta em uma área 
superficial, o sítio de adsorção, maior (geralmente da ordem de centenas de metros quadrados 
por grama de fase estacionária), o que promove uma separação mais eficiente dos 
componentes da amostra. Essa "miniaturização" das partículas da coluna permite o uso de 
colunas menores, volumes menores de amostras e um gasto menor de fase móvel. Assim 
sendo, em cromatografia líquida de alta eficiência trabalha-se na faixa dos microlitros (µL). 
O advento dessa técnica analítica só foi possível graças à produção de cromatográficos líquidos 
totalmente automatizados (embora mesmo hoje ainda exista cromatográficos que não 
oferecem opção de injeção automática de amostragem). Nesses cromatográficos as bombas 
de fase móvel permitem o trabalho geralmente na faixa média de 2.500 psi. Hoje em dia são 
oferecidos, também as máquinas da chamada CLUE - Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência 
(Em inglês, UPLC), que trabalham com partículas de colunas ainda menores (até 0,01 µm) e 
pressões ultra-elevadas (da ordem de 15.000 psi). 
 
2. Objetivos 
O presente experimento tem por objetivo usar técnicas cromatográficas para separar dois 
compostos de uma solução e por meio deste entender um pouco acerca desta que é uma das 
técnicas de separação e identificação de substancias que tem fundamental importância em 
química Orgânica. 
3. Procedimento Experimental 
Usamos a cromatografia em coluna para separar os compostos de uma solução preparada de 
azul de metileno e alaranjado de metila. Inicialmente para o preparo desta solução, foi pesado 
5 mg de azul de metileno e 5 mg de alaranjado de metila, ambos dissolvidos em 20 ml de 
etanol. Para o preparo da coluna cromatográfica foi colocada uma quantidade mínima de 
algodão com o auxilio de uma haste flexível afim de não escoar a fase estacionária. Fizemos 
duas colunas cromatográficas, uma utilizando sílica gel (SiO2) como fase estacionária e a outra 
usando alumina (Al2O3). Ambas ocuparam um terço da coluna cromatográfica, e foram 
solubilizados com etanol. A preparação da coluna foi finalizada depois que a sílica gel decantou 
e o etanol escoou até ficar à um centímetro acimada sílica decantada. O mesmo 
procedimento foi feito para a alumina como fase estacionária. Em seguida, a solução de azul 
de metileno e alaranjado de metila foi distribuída no topo da coluna de sílica, então foi feita a 
eluição do etanol nas paredes internas da coluna para não causar distúrbios ou agitação. 
Depois que todo Alaranjado de metila foi eluido pelo etanol e retirado pela torneira, tentou-se 
eluir o azul de metileno com uma solução de água e ácido acético, como este não eluiu, foi 
usado ácido acético puro, e somente assim o azul de metileno pôde ser eluído. O mesmo 
procedimento foi repetido para a coluna cromatográfica de alumina, o Azul de metileno saiu 
primeiro com a eluição do etanol e o Alaranjado de metila sem dificuldade saiu depois com 
uma solução de água e acido acético. 
 
4. Resultados e Discussões 
Na coluna de Sílica gel, a eluição com o etanol arrastou primeiramente o Alaranjado de metila 
juntamente com o álcool até o final da coluna, isso aconteceu devido à sílica gel ter um caráter 
ácido e o Alaranjado de metila também é um ácido. Como pode ser observado na estrutura 
abaixo, de forma que elas não interagem entre si, assim fazendo com que o Alaranjado de 
metila seja arrastado para fora da coluna pelo álcool etílico. 
O azul de metileno é uma base, como é possível observar na estrutura abaixo, de forma que 
interage fortemente com a sílica gel que como se sabe possui caráter ácido. Desta forma o 
Azul de metileno se mantém preso à fase estacionária. Como o ácido acético é um ácido fraco 
sua interação com o azul de metileno é desfavorecida em níveis energéticos se comparada á 
sílica gel, assim foi necessário uma concentração muito alta de ácido acético para que o azul de 
metileno pudesse se desprender da fase estacionária, o que ainda assim ocorreu de forma 
lenta. 
Para a coluna em que foi utilizada a alumina como fase estacionária saiu primeiramente o Azul 
de metileno eluído com o etanol, pois a alumina tem caráter básico e assim não houve 
interação entre o Azul de metileno e a alumina, então ele pôde ser retirado mais facilmente. O 
Alaranjado de metila é um ácido e a alumina tem caráter básico por causa disso houve uma 
forte interação entre eles e isso fez com que o Alaranjado de metila ficasse retido por mais 
tempo na coluna e só saiu depois da eluição com água e com acido acético. 
 
Figura 1: Alaranjado de metila 
 
Figura 2: Azul de metileno 
 
5. Conclusão 
Foi observado que quanto mais fortemente o soluto foi absorvido mais lentamente ele se 
deslocou na coluna, a velocidade da saída dos líquidos também demonstrou dependência da 
compactação da coluna (introdução de ar na coluna). 
Os corantes foram arrastados de acordo com suas afinidades com a fase estacionária de forma 
que a alumina por ter caráter básico reteve o Alaranjado de metila que tem caráter acido e 
interage fortemente com a coluna ao contrário do Azul de metileno que sai facilmente por ser 
uma base e não interagir com a alumina. Analisando para a sílica gel a ordem de saída inverteu 
por causa de seu caráter ácido. 
 
6. Referências bibliográficas 
Guia prático de química orgânica, V. 1: técnicas e procedimentos: aprendendo a fazer./ Ayres 
Guimarães Dias, Marco Antonio da Costa, Pedro Ivo Canesso Guimarães – Rio de Janeiro: 
Interciência, 2004. 
Fundamentos de Cromatografia: Carol H. Collins, Gilberto L. Braga e Peirina S. Bonato – 
Campinas, SP: Editora da Unicamp, 2006. 
Cromatografia: princípios básicos e técnicas afins/ Francisco Radler de Aquino Neto, Denise da 
Silva e Souza Nunes – Rio de Janeiro: Interciência, 2003. 
7. Questões 
1) Cite os principais tipos de forças que fazem com que os componentes de uma mistura 
sejam adsorvidos pelas partículas do sólido. 
R: Os principais tipos de forças de interação que fazem com que os componentes de uma 
mistura sejam adsorvidos pelas partículas do sólido são: formação de sais > coordenação > 
pontes de hidrogênio > Van der Waals. 
2) Cite as características do solvente para lavar ou arrastar os compostos adsorvidos na 
coluna cromatográfica. 
R: A capacidade do solvente em arrastar ou lavar um composto adsorvido na coluna depende 
quase diretamente da polaridade do solvente com relação ao composto. 
3) Fale sobre o princípio básico que envolve a técnica de cromatografia. 
R: A cromatografia é definida como a separação de dois ou mais compostos diferentes por 
distribuição entre fases, uma das quais é estacionária e a outra, móvel. Esta técnica é utilizada 
para analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura. 
4) Por que se deve colocar papel filtro na parede da cuba cromatográfica? 
R: Para saturar a atmosfera no interior da cuba com o solvente, se não for feito isso o solvente 
que sobe pelo papel irá se evaporar para saturar a atmosfera e equilibrar o sistema 
liquido/gasoso, se isso acontecer, essa evaporação irá interferir no processo de eluição 
podendo produzir variações nos resultados de Rf. 
5) Se os componentes da mistura, após a corrida cromatográfica, apresentam manchas 
incolores, qual o processo empregado para visualizar estas manchas na placa 
cromatográfica? 
R: A placa deve ser revelada, um método bastante comum é o uso de vapores de iodo, que 
reage com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor café ou amarela, outros 
reagentes utilizados na visualização são: nitrato de prata (derivados halogenados), 2,4-
dinitrofenilidrazina (para acetonas e aldeídos), verde de bromocresol (para ácidos), ninhidrina 
(para aminoácidos), etc. 
6) O que é e como é calculado o Rf? 
R: É um parâmetro frequentemente usado na cromatografia de camada fina, que é dado em 
função do tipo de suporte (fase fixa) empregada e o eluente, é definido como a razão entre a 
distância percorrida pela mancha do componente e a distancia percorrida pelo eluente. 
7) Quais os usos mais importantes da cromatografia de camada delgada? 
R: Ela é usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma 
mistura comparando-os com padrões, acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento 
dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma 
mistura. 
8) A alumina, ou óxido de alumínio, tem ação básica e interage fortemente com espécies 
ácidas; por sua vez, a sílica gel interage com espécies básicas devido a natureza ácida 
do óxido de silício. Baseado nessas informações, explique o comportamento distinto 
dos dois corantes empregados quando se usa alumina ou sílica como fase fixa. A 
estrutura dos dois produtos está apresentada abaixo: 
 
R: O azul de metileno, por ser um sal e ser mais polar tem maiores interações com a sílica do 
que o alaranjado de metila, sendo melhor adsorvido por ela.