Reacoes antigeno anticorpo

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INTERAÇÕES 
ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico
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RESPOSTA DE ANTICORPOS
 Especificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.
 Quantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.
 Isotipo
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente). 
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados.
 Afinidade
Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.
 Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.
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Avidez x Afinidade
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INTERAÇÕES
 Reações reversíveis.
 Ligações não covalentes:
Pontes de hidrogênio
Interações hidrofóbicas
Interações de Van der Waals
Ligações iônicas
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MÉTODOS
Reagentes não marcados
Reação de precipitação
Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados
RIA
ELISA 
Imunofluorescência
Western Blotting
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MÉTODOS
PRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla 
- Imunodifusão radial 
- Imunoeletroforese
AGLUTINAÇÃO
- Aglutinação direta e indireta
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA 
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
Western Blotting
APLICAÇÕES
- Pesquisa 
- Diagnóstico
- Soroepidemiologia
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PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
 Precipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.
 Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes. 
 As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado. 
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REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
Interação entre Ac e Ag solúvel 
Ac precisa ser bivalente
Ag precisa ser bi ou polivalente
A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag 	VALÊNCIA
 
PRECIPITADO
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É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: 
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TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
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As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: 
Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
IMUNODIFUSÃO DUPLA
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Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. 
O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.
IMUNODIFUSÃO RADIAL
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Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. 
As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. 
Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. 
Ag e Ac formam arcos de precipitação.
IMUNOELETROFORESE
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REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ac + Ag multivalente particulado 
Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo)
Pó-zona: excesso de Ac
Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão)
Agregação visível de 
partículas = Eritrócitos, 
bactérias, fungos e látex
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2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
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3) Controle negativo:
4) Mistura-se:
AGLUTINAÇÃO DIRETA
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5) Leitura do resultado:
AGLUTINAÇÃO DIRETA
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AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: 
 As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.
 O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.
 Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.
Aglutinação Positiva
	 Negativa
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
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Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs);
DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
Não aglutinam os eritrócitos;
Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais;
Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes no soro materno. 
Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.
TESTE DE COOMBS
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IMUNOENSAIOS
Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)
Tipos:
RIA
ELISA
IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
WESTERN BLOTTING
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IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) 
Princípio da técnica: 
 
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. 
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. 
A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência). 
 Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.
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Microscópio de fluorescência com epiluminação
 luz UV atinge o ma- 
 terial examinado
fluorescência emitida 
chega ao observador
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TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
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IFA direta:
Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
IFA indireta:
Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
 
É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade. 
 
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
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IMAGENS
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CITOMETRIA DE FLUXO 
Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser.
Separa as células por fluorescência ativada.
Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.
É um teste qualitativo e quantitativo.
APLICAÇÕES
Tipo de linfócitos;
Quantidade, tamanho, granulosidade;
Isolamento de populações celulares;
HIV
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Ensaio Imunoadsorvente 
Ligado à Enzima - ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. 
O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). 
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. 
Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura. 
Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
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TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
PLACA UTILIZADA
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 ELISA Indireto
 ELISA Direto ou Sanduíche 
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 Aplicações do ELISA:
 Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa
 Vantagens:
 Teste de alta sensibilidade
 Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
 Seguros e de baixo custo
 ELISA Competitivo
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RADIOIMUNOENSAIO -
RIA 
Marcações:
I125: emite raios gama
H3: raios beta 
Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
 proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
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WESTERN BLOTTING
Eletroforese de proteínas.
Identifica antígenos ou anticorpos. 
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WESTERN BLOTTING 
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WESTERN BLOTTING 
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