Setor de Hematologia

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SETOR HEMATOLOGIA
AMOSTRAS EM HEMATOLOGIA:
A - Tubo roxo / anticoagulante EDTA (ácido etilenodiaminotetracético):
 1) Aplicação em Hematologia:
 Hemograma, contagem de plaquetas, VHS, teste afoiçamento, pesquisa de hemácias em Rouleaux, reticulócitos.
 2) Fase pré analítica: 
 Verificar identificação ( nome do paciente legível e em conformidade com o pedido. Dúvidas não devem existir sobre as análises a serem feitas na amostra.Volume da amostra deve ser superior a 1ml para que parâmetros hematológicos não sejam alterados.
 Os critérios para rejeição da amostra: Volume inferior a 1ml, hemólise acentuada, presença de coágulos, ausência de identificação, tempo maior que 24 horas sem refrigeração para hemograma, falta de jejum de 12 horas para VHS.
 Critérios para cadastro em livro de erros pré analíticos e relato ao clínico: Lipemia, icterícia e hemólise acentuadas, VHS sem preenchimento até 3 horas após coleta, hemograma após 24 horas sem refrigeração.
OBS: Lipemia, icterícia ( Sangue deve ser sedimentado espontaneamente e o plasma aspirado. Volume igual de salina é adicionado à amostra eliminando interferentes das dosagens.
 3) Fases analíticas e pós analíticas: 
 Verificar em POP os exames desejados.
B- Tubo azul/ anticoagulante Citrato
 1) Aplicação em hematologia: 
 Testes de coagulação, contagem de plaquetas e hemograma completo (2ª escolha).
 2) Fase pré analítica: 
 Verificar identificação(nome do paciente legível e em conformidade com pedido médico). Dúvidas não devem existir sobre as análises a serem feitas na amostra.
 Critérios para rejeição da amostra: Amostra coagulada, volume inferior a 3ml de sangue, amostras a temperatura ambiente por mais de 6 horas para tempos de coagulação.
 Critérios para cadastro em livro de erros pré analíticos e relato ao clínico: Amostra a temperatura ambiente de 4 a 6 horas para testes de coagulação, lipemia, icterícia , hemólise acentuadas.
 Obs: Para hemograma completo e contagem de plaquetas, levar em consideração diluição de 10% pelo volume do anticoagulante.
 3) Fases analíticas e pós analíticas: 
 Verificar em POP os exames desejados.
C - Anticoagulante heparina
 1)Aplicação em hematologia:
 Série vermelha, contagem específica de leucócitos, morfologia eritrocitária em esfregaço.
 2) Fase pré analítica: 
 Verificar identificação (nome do paciente legível e em conformidade com o pedido médico). Dúvidas não devem existir sobre as análises a serem feitas na amostra. Proporção anticoagulante/sangue deve ser ideal (tubo ou seringa apenas rinsados com heparina). 
 Critérios para rejeição da amostra: Amostra coagulada, pedidos de contagem de plaquetas e leucometria global, volume abaixo de 1 ml de sangue.
 Critérios para cadastro em livro de erros pré analíticos e relato ao clínico: Lipemia, hemólise e icterícia acentuadas.
 3) Fases analíticas e pós analíticas: 
Verificar em POP os exames desejados.
VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO
 1) Considerações gerais:
 Exame consideravelmente inespecífico. 
 O VHS depende da interação de forças físicas que se opõem. A queda dos glóbulos vermelhos provoca deslocamento do meio para cima, o que resulta em duas forças opostas. 
 No sangue de pessoas normais as forças para baixo e para cima são quase iguais ocorrendo assentamento mínimo. Quando a concentração de hemácias é menor que o normal as próprias hemácias provocam menor retardo da sedimentação.
 Fator importante no estado patológico ( tamanho da partícula em sedimentação. Quanto maior o volume da partícula menor a área superficial relativa.
 Ex: Rouleaux (Agregados de grande volume, área superficial relativamente pequena acelerando VHS.
 Carga negativa das hemácias é função dos grupos de ácido siálico na membrana celular. Essa carga pode ser atenuada pelo efeito dielétrico das proteínas no plasma circulante, especialmente macromoléculas assimétricas como o fibrinogênio e g-globulina. A adição de fibrinogênio e proteínas de fase aguda como alfa 2 e gama 1 macroglobulinas no plasma normal leva a uma sedimentação aumentada.
 Na prática clínica o VHS aumentado pode muito bem ser considerado como sinal de doença, até que o médico esteja completamente convencido de que o paciente não possui patologia.
 De outro modo, VHS normal não significa que o paciente está bem (Ex; Algumas neoplasias no fígado, cirrose).
 Medições seriadas de VHS pode ser um referencial de avaliaçãodo tratamento de uma doença reconhecida, particularmente em relação à tuberculose, cardite reumática, artrite reumatoíde, linfoma Hodgkin.
Fases do VHS:
Sedimentação inicial: Consiste na queda individual dos eritrócitos antes de agregação.
Sedimentação máxima: Consiste na formação dos agregados globulares os quais mais depressa se depositarão quanto maiores e mais numerosos. Inicia após 20 minutos de duração do exame.
Sedimentação constante: Os agregados globulares atingem por unidade de tempo um período de queda constante, a qual entra em declínio no período final a medida que os glóbulos acumulam no final da pipeta.
 2) Fase pré analítica:
 Verificar identificação ( nome do paciente legível e em conformidade com o pedido.
 Volume da amostra deve ser superior a 2,0ml em tubo com anticoagulante EDTA.
 Critérios para rejeição da amostra: Volume inferior a 2ml, presença de coágulos, paciente sem jejum de 12 horas.
 Critérios para cadastro em livro de erros pré-analíticos e relato ao clínico: Lipemia, icterícia e hemólise acentuadas. Exame sem preenchimento da pipeta até 3 horas após coleta, mulheres menstruadas ou em fase gestacional, excesso de anticoagulante.
 3) Técnica:
Método ( método de Westergreen.
 Material ( Sangue total colhido com EDTA, aparelho de Westergreen, marcador de tempo. O aparelho é composto por pipetas de westergreen graduadas de 0 à 200 mm de comprimento, com 2,5 mm de diâmetro interno e capacidade de mais ou menos 1ml. Suporte próprio, contendo rolhas de borracha embutidas na base, onde se apoiam as extremidades inferiores das pipetas, as quais se mantêm em posição rigorosamente vertical.
 Homogeinizar o sangue e aspirá-lo com pipeta de Westergreen até a marca zero. Levar para o suporte e colocar em posição rigorosamente vertical marcando o tempo.
 Fazer a leitura em mm ao nível da coluna dos glóbulos que se separam do plasma. Na escala graduada cada traço é igual a 1mm.
 Valor de referência ( Primeira hora: 0 à 10 mm.
 Segunda hora: 0 à 20 mm.
 Atualmente a tendência é se fazer apenas a leitura da primeira hora.
 4) Fase analítica:
 Fatores intrínsecos ou sanguíneos ( Fibrinogênio, globulinas, colesterol sanguíneo aumentam VHS.
 Acidose e albumina retardam o VHS.
 Quanto maior a concentração de hemácias menor é o valor do VHS (macrócitos sedimentam rapidamente e micrócitos lentamente; esferocitose sedimenta com mais rapidez e falciformes sedimentam lentamente por não formarem agregados).
5) Fase pós analítica:
 Fatores extrínsecos ou técnicos ( Falseiam o resultado. Estase venosa, sangue mal homogenizado, falha na determinação do tempo da prova, temperatura da sala, comprimento, calibre e inclinação da pipeta. 
CONTAGEM DE PLAQUETAS
 As plaquetas são formadas na medula óssea e destruídas pelo Sistema Monocítico Fagocitário, principalmente no baço. Seu ciclo vital é de cerca de 10 dias.
 Podem estar aumentadas após hemorragias, infecções crônicas, câcer metastático, esplenectomia. Podem estar diminuidas (trombocitopenia) por deficiência na produção ou distribuição, aumento na destruição ou por diluição maciça do sangue.
 Obs: Plaquetasfalsamente baixas: Aglutininas plaquetárias à frio, contato de plaquetas com superfícies estranhas (membranas de diálise, cateteres), plaquetas gigantes, satelitismo plaquetário, lipemia, pseudotrombocitopenia EDTA-induzida.
 Plaquetas falsamente altas: Microesferócitos, fragmentos de células leucêmicas, corpos de Pappenheimer.
Técnica: Método de Maspes e Jamra, abaixo descrito.
 Coletar o sangue com EDTA e fazer hematócrito. Num tubo de hemólise colocar +-2ml de sangue e deixar repousar para o plasma separar espontaneamente. Diluir 0,02ml do plasma em 1ml de líquido diluidor.
 Preencher câmara de Neubauer e deixar em repouso por alguns minutos.
 Contar os retículos da área central.
Cálculo: Plaquetas/mm3 = N x 5 x (100-Htc)
 
Valores normais: 200.000 a 400.000 plaquetas/mm3
Interferências: Tempo de sedimentação, tempo gasto na contagem, erros de diluição.
PESQUISA DA CÉLULA LE
Introdução:
As células “LE” foram descritas por Hargraves e cols. Em 1948. Sua pesquisa é positiva na maioria (70 - 80%) dos pacientes com Lupus Eritematoso Sistêmico. Em alguns casos de artrite Reumatóide e, raramente, em outras patologias, como Púrpura Trombocitopênica, Periarterite Nodosa, Escleroderma, Dermatomiosite, Febre Reumática pode ser positiva.
O plasma de alguns pacientes com LES contém um Anticorpo IgG, chamado fator “LE” (FAN – Fator Antinuclear), que reage com nucleoproteína dos núcleos chamado fator leucócitos. A nucleoproteína modificada pela presença do Anticorpo é fagocitada por neutrófilos, ou, ocasionalmente, pelos monócitos. Os fagócitos com material nuclear ingerido constituem a célula “LE”. A formação de células “LE” requer a presença , no plasma , do fator “LE”, de leucócitos mortos (ou lesados) e de leucócitos vivos capazes de exerce a fagocitose.
A célula “LE” encerra, assim, dois núcleos. O núcleo do fagócito acha-se comprimido na periferia da célula. A maior parte da região citoplasmática é ocupada pela massa nuclear transformada. Na célula “LE”, a estrutura da cromatina normal é substituída por massa arredondada, homogênea, de coloração rósea, de tamanho variável, mas usualmente maior do que a hemácia.
Técnicas:
As técnicas de pesquisa das células “LE” distinguem-se em diretas e indiretas. Nas técnicas diretas, todos os elementos provêm do próprio doente; nas indiretas, o soro provém do paciente e os leucócitos de outra pessoa. Os métodos indiretos de pesquisa não são mais utilizados.
1. Direta de Zimmer e Hargraves:
(Colher mais ou menos 8 ml de sangue em um tubo; deixar coagular e incubar a 37ºC, por 30’.
(Fragmentar o coágulo com bastão de vidro, filtrar em gaze para remoção dos coágulos e centrifugar osoro contendo as células contendo as células a 2.000 rpm, durante 5minutos.
(Aspirar a parte superior do sobrenadante, transferir o restante para tubo de Htc(Wintrobe) e centrfugar a 2.000 rpm, durante 5minuto.
(Aspirar todo sobrenadante e transferir o depósito de células brancas pra lâminas;preparar esfregaços,corar pelos métodos panópticos e pesquisar as células “LE”.
2. Direta de Zinkham e Conley: 
(Colher mais ou menos 10ml de sangue e colocar em vidro de penicilina, contendo três gotas de solução de heparina a 1% e algumas pérolas de vidro.
(Agitar o vidro, para fragmentação do coágulo, durante 30 minutos; filtrar em gaze e transferir o filtrado para tubos de Htc.
(Centrifugar por 30 minutos mais ou menos 3.000rpm;
(Aspirar o plasma e desprezar; aspirar a camada de leucócitos;
(Fazer várias lâminas com esta camada de leucócitos; corar e examinar.
Célula “LE”:
A célula “LE” aparece como uma massa hialina amorfa, de cor vermelho-púrpura (rósea) ou levemente basófila, englobada por um ou mais neutrófilos em atitude fagocitária. O núcleo do neutrófilo encontra-se deslocado para a extremidade oposta à massa fagocitária.
Resultado:
Positivo ou negativo.
Interpretação:
O fenômeno da célula “LE” pode ser demonstrado na maioria dos pacientes com Lupus Eritematoso Sistêmico, mas não é essencial para o seu diagnóstico.
As células “LE” também têm sido relatadas na Artrite Reumatóide e outras doenças doColágeno, Reações Medicamentosas, etc.
ATENÇÃO: Nucleofagocitose
Fagócitos com núcleos ingeridos inalterados podem causar confusão, mas a cor azul mais escura e a persistência da configuração cromatínica nessas inclusões permite diferenciar essas “tart cells” da célula “LE”.
INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL DA COAGULAÇÃO
Tempo de sangria (TS):
É o tempo necessário para a cessação de hemorragia, ocasionada por pequena incisão, de dimensões padronizadas, praticada artificialmente.
Existem dois métodos para fazer o TS: método de IVY e o de DUKE. Devido a sua simplicidade o de Duke é o método comumente usado na rotina.
Método de Duke:
Fazer assepsia da polpa digital ou lóbulo da orelha e com a lanceta fazer uma incisão de + 3mm e acionar o cronômetro. Com um papel de filtro absorver a gota formada a cada 30 segundos. Quando cessar o fluxo sanguíneo, parar o cronômetro; o tempo gasto é o TS.
Valores normais: 1 a 3 minutos
Interpretação:
Depende da formação de um trombo plaquetário estável no local da incisão, avaliando a eficiência da fase vascular que depende do número e funcionalidade das plaquetas, estando alargado nas capilaropatiias, trombocitopenias e nas disfunções plaquetárias, não distinguindo-as entre si.
Interferências:
Escolha do local de lancetagem
Lancetagem incorreta
Observação do sangramento de forma incorreta
Alertar para o uso de Aspirina: alarga o TS
Tempo de coagulação (TC):
É o período que o sangue extraído consome para coagular-se completamente.
Método de Lee e White:
Coleta-se o sangue do paciente por punção venosa, acionando-se o cronômetro logo que o sangue começar a fluir na agulha. Em tubos de ensaio 13 x 100mm, colocar 1mL de sangue. Manter os tubos à 37oC e de 1 em 1 minuto inclinar para verificar se houve coagulação. Quando o sangue coagular por completo, parar o cronômetro anotando o tempo gasto, que será o TC.
Valores normais: 5 à 10 minutos.
Interpretação: 
O TC é inversamente proporcional a concentração dos fatores da coagulação. Na prática, estudamos só os fatores da via intrínseca, uma vez que o fator XII é ativado por qualquer superfície eletronegativa e o fator VII (via extrínseca) não é ativado na ausência da tromboplastina tecidual.
É um, método pouco sensível, sendo necessário que todos os fatores estejam em concentrações abaixo de 30% para o TC alargar.
Interferências:
Diâmetro e qualidade do tubo
Quantidade de sangue no tubo
Temperatura
Cronometragem
Deve ser feito em duplicata
Retração do coágulo (RC):
Normalmente, após a coagulçaõ completa do sangue, o coágulo começa a se retrair, deslocando-se gradualmente das paredes do tubo e separando-se nitidamente do soro.
É o resultado da contração das plaquetas ativadas nas quais os largos pseudópodos juntos aos pontos de contato mútuos se retraem sob o efeito de uma proteína contrátil plaquetária, a trombostenina.
Retração do coágulo qualitativa:
Colocar o tubo em que se fez o tempo de coagulação do banho-maria a 37oC e observar de hora em hora até 24 horas se o coágulo se retrai. A retração pode ser: completa, incompleta ou nula.
Sofre interferências quando se tem um hematócrito muito alto (poliglobulias) ou VHS acelerado. Em casos de plaquetopenia acompanhada por anemia, a RC ocorre normalmente.
Interpretação:
É comumente deficiente quando a contagem plaquetária for abaixo de 50.000 / UL e na Tromboestenia. No entanto é normal na maioria dos distúrbios da função plaquetária.
Interferências:
Sofre interferências quando se tem um hematócrito muito alto (poliglobulias) ou VHS acelerado. Em casos de plaquetopenia acompanhada por anemia, a RC ocorre normalmente.
Prova de resistência capilar (PL):
Consiste em determinara resistência capilar sob condições de anóxia e pressão aumentada artificialmente pelo manguito do aparelho de pressão, por 5 minutos, na pressão arterial média.
Cessar a pressão e observar o aparecimento de petéquias em uma área de 5 cm2.
Valores normais: até 5 petéquias
Interpretação:
A exposição de capilares a uma pressão interna maior que o normal pode levar ao rompimento com extravasamento sanguíneo e aparecimento de petéquias. A formação das mesmas será tanto maior quanto mais baixo o número de plaquetas e as alterações nas paredes dos capilares.
Interferência:
Pessoas negras
Manchas na pele
Contagem de plaquetas:
Numerosos métodos propostos dividem-se em diretos e indiretos.
Diretos: 
Contagem no microscópio após diluição da amostra ou utilizando um contador ótico ou elétrico. O principal é o de Maspes e Jamra, abaixo descrito.
Coletar o sangue com EDTA e fazer um hematócrito. Num tubo de hemólise colocar + 2mL de sangue e deixar repousar para o plasma separar espontaneamente. Diluir 0,02mL do plasma em 1mL do líquido diluidor. Colocar na câmara de Neaubauer e deixar em repouso por alguns minutos. Contar os retículos da área central.
Cálculo: Plaquetas/mm3 = N x 5 x (100 – Htc)
Valores normais: 200.000 a 400.000 plaquetas/mm3
Interferências:
Tempo de sedimentação
Tempo gasto na contagem
Erros de diluição
Interpretação:
As plaquetas são formadas na medula óssea e destruídas pelo Sistema Monocítico Fagocitário, principalmente no baço. Seu ciclo vital é de cerca de 10 dias.
As plaquetas podem estar aumentadas (trobocitose): após hemorragias, em infecções crônicas, câncer metastático, após esplenectomia, etc; ou podem estar diminuídas (trombocitopenia): por deficiência na produção ou distribuição, por aumento na destruição ou por diluição maciça do sangue.
OBS: Artefatos comuns nas contagens plaquetárias automatizadas:
Plaquetas falsamente baixas:
Aglutininas plaquetárias à frio
Quantidades anormais de proteínas plasmáticas (Paraproteínas)
Contato de plaquetas com superfícies estranhas (membranas de diálise, cateteres)
Plaquetas gigantes
Satelitismo plaquetário
Lipemia
Agregação plaquetária Edta – induzidas
Plaquetas falsamente altas:
Microesferócitos
Fragmento de células leucêmicas
Corpos de Pappenheimer.
PESQUISA DE PSEUDOTROMBOCITOPENIA
Fase pré analítica: Resultados de contagem de plaquetas abaixo de 100000 sem histórico anterior conhecido em sangue coletado com EDTA (amostra em volume adequado). Análise inicial macroscópica avaliando erro de procedimento em coleta (amostra coagulada).
Fase analítica: Examinar lâmina pesquisando macroplaquetas, agregados plaquetários e checar CELL DIN. 
( Agregados plaquetários em lâmina colocar sangue em banho maria a 37ºC por 30 minutos (crioglobulinas).
( Passar novamente no aparelho e fazer novo esfregaço para análise. 
( Persistindo os valores anteriormente medidos deve ser feita nova coleta do paciente em CITRATO e EDTA. Essa coleta deve ser feita também se satelitismo for verificado. 
( Passar imediatamente as duas amostras no aparelho.
( Repetir após 4 horas nas 2 amostras.
Fase pós analítica: Comparar resultados entre os diferentes anticoagulantes para caracterizaralterações de contagem associadas ao EDTA ( resultado positivo para pseudotrombocitopenia.
Tempo de Protrombina (TP):
Análise de um plasma citratado ou oxalatado rico em fosfolípide plaquetário ao qual adicionamos tromboplastina ou similar e cálcio, avaliando asssim a via extrínseca da coagulação. Portanto, avaliamos os fatores VII, X, II e fibrinogênio.
O TP tem sido largamente aceito como um meio de monitorar paciente em terapia oral de anticoagulantes. O mecanismo de ação desses medicamentos é por inibição da vitamina K, interferindo portanto nos fatores dependentes dessa vitamina, que são II, VII, IX e X. Esse fato explica o alargamento nas valores de TP em pacientes fazendo uso desse tipo de medicação. O papel da vitamina K é fixar um segundo grupo carboxílico sobre os ácidos glutâmicos situados na extremidade desses fatores. Sem o grupo carboxílico essas proteínas não poderão fixar-se à superfície fosfolipídica e são funcionalmente menos eficazes.
Valores normais: 10 a 13 segundos.
 Atividade de Protrombina (AP): 
É a interseção de testemunho e paciente. Trata-se de um cálculo relacionado à porcentagem do tempo de protrombina. Normalmente gira acima de 70%. Na anticoagulação gira em torno de 30%. Quando está abaixo de 30% é risco hemorrágico.
Relação Normatizada Internacional (RNI):
Usa-se tromboplastina com ISI (índice de sensibilidade da tromboplastina) que é determinado pelo fabricante. Sabendo o ISI e o TP calculamos o RNI. O valor normal é em torno de 1,00. Quanto mais largo o TP maior será o RNI.
Tempo de Tromboplastina Parcial (TTP):
Consiste na análise de um plasma citratado ou oxalatado ao qual adicionamos um substituto do fosfolípede plaquetário e cálcio, avaliando assim, a via intrínseca da coagulação. Portanto avaliaremos os fatores XII, XI, IX, VIII, X, V, II e fibrinogênio.
O TTP é também utilizado para monitorar paciente em terapia com heparina. Esse anticoagulante tem como mecanismo de ação estimular a antitrombina III (cofator heparínico). Essa por sua vez irá inibir a trombina e os fatores Xá, Iia, Ixa, XIIa e Xia. Esse fato explica o alargamento no TTP em pacientes fazendo uso de heparina como anticoagulante.
Valores normais: 30 a 45 segundos
Tempo de Trombina (TT):
É a adição de trombina no plasma citratado ou oxalatado. Consiste na avaliação, basicamente da última etapa da coagulação, ou seja, análise de fibrinogênio.
Valores normais: 9 a 11 segundos.
Avaliação Clínica de Pacientes com Sangramento
Avaliar as queixas do paciente, saber se a anomalia é nos vasos , plaquetas ou processo de coagulação.
Obtenção do passado do paciente hereditário ou adquirido.
 
Manifestações da Hemostasia Alterada 
 2 Grupos
Observação distúrbios da coagulação Observados distúrbios vasculares e plaquetas.
 
 
 Doenças purpúreas
Sangramento Cutâneo e em tecidos moles.
Petéquias: são características das púrpuras e raríssimamente de fatores da coagulação. 
Hematomas de larga extensão: distúrbios da coagulação (comumente atingem o membro todo).
Hemartrose: atenta para diagnóstico de Hemofilia A ou B.
Sangramento traumático: pesquisar sangramentos anteriores extrações de dentes, cirurgias, etc.
Geralmente púrpuras sangramento imediato que responde às medidas de contração imediata como tamponamento.
Geralmente distúrbios de coagulação as plaquetas inicialmente formam o trombo plaquetário e quando ocorre ação plasmina sangramento(s) que ocorre minutos ou horas após contido o sangramento.
Outras Manifestações de Sangramento
Sangramento espontâneo por orifícios corporais Menorragia, Metrorragia, Hematúria, Hematenese, Melena ,Epistaxe e Sangramento gengival ocorrem tanto nas doenças purpúricas quanto nos distúrbios e geralmente são erroneamente atribuídas à lesões comuns locais.
Pequenas e múltiplas hemorragias retinianas são comuns em pacientes com púrpuras.
Sangramentos ou Tramboemlismo em regiões de função nervosa L. I .D.
Cura demorada de ferimentos e cicatrização anormal sugere Hemofilia, Afibrinogenemia Hereditária ou Desfibrinogênemia.
História de Exposição à Drogas
Cresce a cada ano a lista de drogas que causam trambocitopenia , púrpura vascular ou aplasia de medula , devendo tomar cuidado para não superenfatizar o questionamento aopaciente.
Aspirina: prejudica a função plaquetária (Antiagregante).
Ingestão de drogas que potencializam ou antagonizam os efeitos dos anticoagulantes orais derivados do Coumarin . Os resultados de vários testes de coagulação são anormais em uma larga porcentagem - hospital (Heparinal). 
 
 
 TTP prolongado.
Métodos Laboratoriais para o Estudo da Hemostasia e Coagulação
Teste da Fase Vascular e Plaquetária 
Tempo de Sangramento:
Depende da formação de um trombo plaquetário estável no local de incisão, avaliando a eficiência da fase vascular. O incômodo é que não distingui defeitos vasculares, Trombocitopenia e disfunção plaquetária.
Pode ser extremamente alargado Von Willebran e Hemofilia.
Alertar para o uso de Aspirina alarga pouco o tempo de sangramento.
Contagem Plaquetária:
Pode ser realizada por diluição e observação microscópica , métodos semi – automatizados é muito importante a confirmação da contagem de plaqueta em esfregaço bem preparado, observado por microscopista experiente.
Artefatos Comuns nas Contagens Plaquetárias Automatizadas.
Plaquetas Falsamente Baixas:
Aglutininas plaquetárias à frio.
Quantidades anormais de proteínas plasmáticas (Paraproteinemias).
Contato de plaquetas com superfícies estranhas (membranas de diálises, cateteres).
 Plaquetas gigantes.
Satelitismo plaquetário.
Lipemia.
Agregação plaquetária Edta – induzidas (grumos de plaquetas contados como hemácias).
Plaquetas Falsamente Altas:
Microesferócitos.
Fragmentos de células leucêmicas e esquizócitos.
Corpos de Pappenheimer.
Contagem manual atenta e microscopia bem realizada podem solucionar os problemas acima.
Testes de agregação plaquetária: 
Pode ocorrer contagem normal de plaquetas, tempos de coagulação normal e tempo de sangramento alargado
 Pesquisar as funções plaquetárias.
Agregação Plaquetária 
Realizada por meio de agregômetros ( são nefelômetros modificados que permitem a medida de alterações na densidade óptica de uma suspensão plaquetária sob condições de temperatura e agitações contínuas ). A maioria dos instrumentos medem uma combinação de dispersão e absorsão de luz(Cretração).
Retração do Coágulo:
É comumente deficiente quando a contagem plaquetária for abaixo de 50.000 / UL e na Tromboestenia.
No entanto é normal na maioria dos distúrbios da função plaquetária.
Testes Para Fator 3 Plaquetário (PF – 3)
Tem relação íntima com a membrana plaquetária e embora tenha – se testado vários métodos , todas as técnicas são imperfeitas.
Basicamente misturam – se as plaquetas in vitro com superfícies estranhas ou agregantes plaquetários.
Mais usado para liberação do Fator 3 Plaquetário: é o CAOLIM.
O Caolin é plasmárico em plaquetas , são incubados misturados de vez em quando e a mistura é então Recalcificada.
O tempo de coagulação dessa mistura é proporcional à quantidade de PF – 3 tornado disponível pelo Caolin.
Testes da Fase Coagulação 
Devido à falta de padronização de técnicas e reagentes , a amplitude normal de valores de quase todos os testes varia dependendo da técnica empregada , e o clínico deve estar a par da amplitude de valores normais para o método específico utilizado em cada laboratório.
Execução meticulosa dos testes é mais importante do que a própria técnica empregada.
Amostras sanguíneas obtidas por punções venosas traumáticas ou a partir de cateteres permanentes são inadequados para os estudos de coagulação.
Uma coleta insuficiente de amostra sanguínea é uma causa muito mais comum de resultados imprecisos do que um erro técnico.
O íon extraído não penetra no eritrócito , logo a concentração do citrato no plasma e anormalmente alta quando coletamos um sangue com HTC(Hematócrito) alto com as concentrações usuais de citrato que levaria ao falso alargamento do TTP. 
 Adequar a concentração de citrato em nova coleta. 
Tempo de Tramboplastina Parcial:
Mistura de: plasma + substituto plaquetário(cérebro de coelho cloroformizado) é recalcificado.
A fibrina só é formada normalmente se os fatores via intr + via extrínseca estiverem em concentrações normais.
Neste teste os substitutos plaquetários são fornecidos em excesso não influenciado as plaquetas remanescentes no plasma .
Entretanto os substitutos plaquetários são somente e não são capazes de ativar a via extrínseca que requer Tramboplastina Tecidual completa ( Fator tecidual) e portanto não podemos avaliar Fator VII.
O PPT é mais sensível as deficiências dos fatores VIII e IX do que as deficiências dos fatores XI e XII ou fatores necanisto extrínseco , porém o teste detecta deficiências dos fatores plasmáticos se estiverem [] abaixo 15% à 30% do vetor normal Detecta distúrbios moderados da coagulação.
TTP também é prolongado por Heparina, inibidores específicos de qualquer um dos fatores essenciais e inibidores do tipo Lúpus.
TTP reduzido pode significar:
Estados de Hipercoagulação;
Altos níveis de fatores essenciais (VIII mais comum) para mascarar deficiências de outros fatores.
Recém – Natos devido à anormalidades na fase de contatos do mecanismo intrínseco(Isto é normal acontecer).
TTPa No método original a atuação de contato era feita pelas paredes do tubo de vidro.Na TTPa é adicionado ativador de contato como ácido elágico ou silicatos (Cellite ou Caolin ) e ocorre melhor atuação, conseqüentemente a melhora do método.
Tempo de Protombina Plasmática
Requer Tramboplastina Tecidual e fator VII , em adição aos fatores X e V, Protrombina e Fibrinogênio.
plasma é recalcificado na presença de excesso de fatores teciduais.Este teste não requer ativação de contato e desvia o mecanismo intrínseco.
LEUCOMETRIA GLOBAL
É a contagem do número de leucócitos por mm3
Material necessário:
Pipeta automática de 20(l;
Sangue total;
Líquido diluidor de leucócitos (Turk);
Câmara de Neaubauer;
Microscópio.
Técnica:
Em um vidro coloque 0,4 ml do diluidor de leucócitos;
Dilua o sangue no líquido de Turk;
Encha a câmara e conte os quatro retículos laterais;
A soma leucócitos contados nos retículos multiplicada por 50 será o valor da leucometria global.
Valor normal:
5.000 a 10.000/mm3
TESTE DE AFOIÇAMENTO
O fenômeno de afoiçamento pode ser demonstrado privando-se os eritrócitos de oxigênio por selagem de uma lâmina colocada sobre uma gota de sangue fresco aplicada sobre a presença de HbS nas células.
Material necessário:
sangue total;
lâminas;
lamínulas;
parafina.
Técnica:
Coloque uma gota de sangue total sobre uma lâmina. Cubra com uma lamínula e sele com parafina. Deixe por 24 horas em temperatura ambiente e, após este tempo, examine ao microscópio.
Resultado:
positivo ou negativo.
OBS.: se quiser acelerar o afoiçamento, pode-se usar um agente redutor como o metabissulfito de sódio em solução aquosa a 2%. Neste caso, use 1 ou 2 gotas de metabissulfito e 1 gota de sangue total. A técnica de preparação é a mesma anterior.
CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA
MACROTÉCNICA:
Sem incubação
Material e soluções:
duas séries de 14 tubos de ensaio;
heparina – use na concentração de 0,1 a 0,2 mg/dl sangue;
água destilada recente;
solução salina a 1%;
espectrofotômetro.
Técnica:
prepare as diluições de acordo com a tabela seguinte:
	Tubos N(
	NaCl a 1% - ml
	Água destilada
	Concentração de NaCl
	1
	10,0
	0,0
	1,00
	2
	8,5
	1,5
	0,85
	3
	7,5
	2,5
	0,75
	4
	6,5
	3,5
	0,65
	5
	6,0
	4,0
	0,606
	5,5
	4,5
	0,55
	7
	5,0
	5,0
	0,50
	8
	4,5
	5,5
	0,45
	9
	4,0
	6,0
	0,40
	10
	3,5
	6,5
	0,35
	11
	3,0
	7,0
	0,30
	12
	2,0
	8,0
	0,20
	13
	1,0
	9,0
	0,10
	14
	0,0
	10,0
	0,00
Misture bem as diluições por inversão dos tubos;
Transfira 5 ml de cada diluição para a segunda série de 14 tubos, numerados de 1 a 14, que será utilizada para a prova de controle, com sangue de indivíduo normal;
Adicione 0,05 ml de sangue do paciente, heparinizado, em cada um dos 14 tubos. Proceda do mesmo modo com o sangue de indivíduo normal, heparinizado, para a prova de controle, Juntando 0,05 ml em cada um dos 14 tubos da segunda série de diluições;
Misture bem as diluições por inversão cuidadosa dos tubos;
Deixe os tubos em repouso, à temperatura ambiente, durante 10 minutos;
Agite os tubos de novo, suavemente, e centrifugue-os a 2.000 rpm durante 5 minutos;
Transfira com cuidado, sem dissolver o depósito, todos os sobrenadantes, um de cada vez, para a cubeta e determine as absorbâncias em 550 nm. Acerte o zero com o sobrenadante do tubo 1, que representa o branco ou 0% de hemólise. O sobrenadante do tubo 14 representa o padrão ou 100% de hemólise;
Calcule a porcentagem de hemólise para cada sobrenadante, aplicando a fórmula:
Hemólise = 		D.O. sobrenadante X 100
					D.O. sobrenadante tubo 14
Expresse o resultado da prova em gráfico, representando as porcentagens de hemólise em ordenada ou eixo vertical e as porcentagens de NaCl em abscissa ou eixo horizontal, indicando a porcentagem de NaCl em que ocorre:
hemólise inicial;
hemólise completa;
50% de hemólise.
Normalmente a hemólise começa a partir da solução de NaCl a 0,45% e é completa na solução a 0,30%;
Resultados normais para este método:
	Tubos n(
	Concentração de NaCl%
	Hemólise
	1
	1,00
	0
	2
	0,85
	0
	3
	0,75
	0
	4
	0,65
	0
	5
	0,60
	0
	6
	0,55
	0
	7
	0,50
	0 a 5
	8
	0,45
	0 a 45
	9
	0,40
	50 a 90
	10
	0,35
	90 a 99
	11
	0,30
	97 a 100
	12
	0,20
	100
	13
	0,10
	100
	14
	0,00
	100
Com Incubação
Materiais e soluções:
Sangue do paciente e de indivíduo normal, ambos heparinizados em condições estéreis, colocados em frascos esterilizados e arrolhados, a fim de evitar contaminação bacteriana (que pode provocar hemólise) e incubados a 37(C durante 24 horas;
Prepare duas séries de 17 tubos de acordo com a tabela:
	Tubos n(
	NaCl a 1% - ml
	Água destilada - ml
	Concentração de NaCl - %
	1
	10,0
	0,0
	1,00
	2
	9,0
	1,0
	0,90
	3
	8,5
	1,5
	0,85
	4
	8,0
	2,0
	0,80
	5
	7,5
	2,5
	0,75
	6
	7,0
	3,0
	0,70
	7
	6,5
	3,5
	0,65
	8
	6,0
	4,0
	0,60
	9
	5,5
	4,5
	0,55
	10
	5,0
	5,0
	0,50
	11
	4,5
	5,5
	0,45
	12
	4,0
	6,0
	0,40
	13
	3,5
	6,5
	0,35
	14
	3,0
	7,0
	0,30
	15
	2,5
	7,5
	0,25
	16
	2,0
	8,0
	0,20
	17
	1,0
	9,0
	0,10
Proceda como no método sem incubação.
Resultados normais:
	Tubos n(
	Concentração de NaCl - %
	Hemólise - %
	1
	1,00
	0
	2
	0,90
	0
	3
	0,85
	0
	4
	0,80
	0
	5
	0,75
	0
	6
	0,70
	0 a 5
	7
	0,65
	0 a 10
	8
	0,60
	0 a 40
	9
	0,55
	15 a 70
	10
	0,50
	40 a 85
	11
	0,45
	55 a 95
	12
	0,40
	65 a 100
	13
	0,35
	75 a 100
	14
	0,30
	85 a 100
	15
	0,25
	90 a 100
	16
	0,20
	95 a 100
	17
	0,10
	100
MICROTÉCNICA:
	N( tubo
	Gts de NaCl a 0,85%
	Gts de água
	Gts de sangue
	Conc. NaCl - %
	1
	18
	-
	1
	0,85
	2
	17
	1
	1
	0,80
	3
	16
	2
	1
	0,75
	4
	15
	3
	1
	0,70
	5
	14
	4
	1
	0,65
	6
	13
	5
	1
	0,60
	7
	12
	6
	1
	0,55
	8
	11
	7
	1
	0,50
	9
	10
	8
	1
	0,45
	10
	9
	9
	1
	0,40
	11
	8
	10
	1
	0,35
	12
	7
	11
	1
	0,30
	13
	6
	12
	1
	0,25
	14
	5
	13
	1
	0,20
	15
	4
	14
	1
	0,15
	16
	3
	15
	1
	0,10
	17
	2
	16
	1
	0,05
	18
	1
	17
	1
	0,00
Deixe incubar por 5 minutos à temperatura ambiente. Centrifugue por 5 minutos à 1.500 rpm;
Faça a leitura anotando a concentração de NaCl no tubo onde iniciou a hemólise e onde ocorreu a hemólise total (sem depósito no fundo).
Valor normal:
HI em concentrações de 0,44 a 0,42%;
HF em concentrações de 0,34 a 0,32%
MÉTODO DE DACIE
Material necessário:
28 tubos de ensaio (13 x 100 mm) numerados de 1 até 14 (1P,2P,3P, / ,1T,2T,3T).
2 pipetas de 100 ml.
Cloreto de Sódio P. A .
Espátula, balança de precisão e papel vegetal ;
2 Ertemeyer de 250 ml;
Centrífuga ;
Fotocolorímetro;
Plasma, sangue do paciente e testemunho heparinados.
Preparo da Solução NaCl à 1%
Pesar 2 gr. de NaCl P.A. e transferir para 1 Ertenemeyer de 250 ml. 
Completar com H2O destilada para 200 ml.
Mexer até completar dissolução.
Técnica:
Preparar as dissoluções, em concentrações decrescentes da solução de NaCl à 1% na série de 14 tubos numerados,conforme abaixo:
	Tubos
	NaCl à 1% ml.
	
	H2O destilado ml.
	[NaCl] %
	1
	10
	
	0,0
	1,00
	2
	8,5
	
	1,5
	0,85
	3
	7,5
	
	2,5
	0,75
	4
	6,5
	
	3,5
	0,65
	5
	6,0
	
	4,0
	0,60
	6
	5,5
	
	4,5
	0,55
	7
	5,0
	
	5,0
	0,50
	8
	4,5
	
	5,5
	0,45
	9
	4,0
	
	6,0
	0,40
	10
	3,5
	
	6,5
	0,35
	11
	3,0
	
	7,0
	0,30
	12
	2,0
	
	8,0
	0,20
	13
	1,0
	
	9,0
	0,10
	14
	0,0
	
	10,0
	0,00
Misturar as diluições por inversão dos tubos.
Transferir 5ml das diluições para os respectivos tubos do testemunho ( ou prova confro).
Adicionar 50 UL de sangue heparinizado para cada um dos tubos. Proceder da mesma forma para o indivíduo normal.
Misturar bem as diluições , por inversão cuidadosa dos tubos.
Deixar os tubos em repouso por 30 min. à TºC ambiente.
Agitar suavemente os tubos e centrifugá-los a 2000 RPM por 5 minutos.
Ler a absorbância de todos os tubos acatando o branco com o sobrenadante do 1º tubo que representa 0% de hemólise .
Sobrenadante do último tubo representa 100% de hemólise. Utilize comprimento de ordem de 550 nm ou filtro verde.
Cálculos 
Calcular % de hemólise para cada sobrenadante da seguinte forma:
Expressar o resultado da prova em gráfico , representando as % de Hemólise no eixo vertical e as [NaCl] no eixo horizontal , indicando a %¨de Hemólise que ocorre.
Hemólise Inicial.
Hemólise completa .
50 % de Hemólise.
Normalmente a Hemólise começa à partir de sol. NaCl a 0,45 % e é completa na solução 0,30 %.
TESTE DA SACAROSE PARA HEMOGLOBINÚRIA PAROXÍSTICA NOTURNA
Princípio:
A sacarose a 10% criará um ambiente isotônico com poder iônico baixo em que as hemácias ficam recobertas com complemento e, consequentemente, irá ocorrer a lise das hemácias.
Reagentes:
Solução de sacarose a 10% em água.
Método:
Em dois tubos de ensaio, coloque 9 ml de solução de sacarose a 10%;
Adicione 1 ml de sangue colhido com anticoagulante (oxalato ou citrato);
Deixe em repouso por 30 minutos (um tubo à temperatura ambiente e outro a 37(C);
Centrifugue em baixa rotação por 2 minutos.
Interpretação:
A população de células sensíveis na HPN será lisada dando uma coloração vermelha na solução de sacarose, enquanto as outras hemácias permanecem intactas.
OBS.: na coleta de sangue não se usa EDTA, pois o mesmo bloqueia a ativação do complemento.
	Na HPN a hemólise frequentemente aumenta à noite, pois a retenção de CO2 durante o sono leva a uma leve queda do pH do plasma, o que facilita a ativação do complemento.
COLORAÇÃO PELO SUDAN
Reagentes:
Álcool a 70% (100 ml de álcool absoluto + 30 ml de água)
Formol a 40%
Reativo Sudan Negro: 
Sudan Black: 300 mg em 100 ml de solução alcoólica 70%
Solução saturada: deixe num béquer
Técnica:
em um copo de Coplin, coloque 5 ml de formol e deixea lâmina em seu interior por 10 minutos;
lave e seque a lâmina;
transfira a lâmina para outro frasco contendo o reativo de Sudan. Aguarde 60 minutos. Após este tempo, transfira a lâmina colocando e retirando em 10 passagens em outro frasco de Coplin contendo álcool a 70%.
lave e contracore pelo método de Leishman;
leve ao microscópio e examine.
OBS.: a série granulocítica é Sudan Negro positiva, o mesmo não acontecendo com a série linfocítica.
	Faça sempre o controle positivo de um esfregaço granulocítico.
TESTE DE HAM
Princípio:
As células vermelhas do paciente são respostas à ação de um soro de paciente normal ou de seu próprio soro, acidificado, num pH ótimo para lise (6,5 – 7,0) a 34(C.
As células vermelhas do paciente podem ser obtidas de sangue com EDTA, citratado, oxalatado, heparinizado ou desfibrinado, e as células podem ser estocadas por até 2 a 3 semanas em ACD ou solução de Alsever, em frasco estéril.
O soro do paciente é melhor obtido por desfibrinação, porque se o sangue coagular a 37(C ou à temperatura ambiente, ele será lisado (no caso do paciente possuir HPN).
O soro normal deverá ser obtido de preferência de modo similar (por desfibrinação), mas também poderá ser utilizado soro obtido de coagulação espontânea ou a 37(C.
Os soros devem ser frescos, ou seja, obtidos até poucas horas após a coleta. Seu potencial hemolítico é mantido por vários meses a -70(C; porém, a 4(C e a -20(C, ele se deteriora em poucos dias.
Método:
Distribua 0,5 ml de soro normal fresco e ABO compatível com o sangue do paciente em 6 tubos de vidro (75X12 mm). Coloque 2 tubos (3 e 6) a 56(C por 10 a 30 minutos para inativar o complemento. Mantenha os outros 2 pares de tubos à TA e adicione 0,05 ml de HCl 0,2M em dois dos quatro tubos. Adicione ácido também nos tubos com soro inativado. Deixe os tubos em BM a 37(C.
Enquanto os tubos estão no BM, lave as hemácias do paciente e as do controle 2 vezes com salina 0,9^e prepare suspensões a 50%. Adicione 0,05 ml da suspensão de hemácias em salina aos tubos contendo soro fresco não acidificado, soro fresco acidificado e soro inativado acidificado, respectivamente. Misture os conteúdos cuidadosamente e deixe os tubos a 37(C. centrifugue os tubos a 1000 rpm por 2 minutos depois de aproximadamente 1 hora.
Adicione 0,05 ml de cada suspensão de hemácias a 0,55 ml de água para preparar o padrão para a determinação quantitativa subsequente da lise e conserve 0,5 ml de soro para ser utilizado como branco.
Para a determinação da hemólise, distribua 0,3 ml do sobrenadante dos testes e controles (o soro (branco) e a suspensão de hemácias lisadas equivalem a 0% e 100%, respectivamente) em 5 ml de amônia 0,4 ml/l ou reagente de Drablin.
Meça as absorbâncias em espectrofotômetro a 540 nm.
Interpretação:
Se o paciente possuir HPN, as hemácias sofrerão lise incompleta no soro acidificado, pouca ou nenhuma hemólise será evidenciada no soro não acidificado e nenhuma lise ocorrerá no soro inativado acidificado.
O controle normal não sofrerá lise em nenhum dos 3 tubos.
Em HPN, obtém-se usualmente 10 a 50% de lise, quando a lise é medida como hemácia liberada. Excepcionalmente, pode ser tão grande quanto 80% ou tão pequena como 5%.
As hemácias de um paciente transfundido sofrerão menos lise do que antes da transfusão, porque as hemácias normais transfundidas, apesar de circularem no paciente, comportam-se normalmente.
OBS.: a sensibilidade do teste de Ham pode ser melhorada através da adição de Mg para aumentar a ativação do complemento.
Significado:
Um teste de soro acidificado positivo, comparado com os próprios controles, diagnostica a HPN.
Um outro distúrbio que também pode dar positividade neste teste é uma anemia diseritropoiética congênita rara (CDA tipo II ou HEMPAS). Entretanto, ao contrário da HPN, as hemácias na HEMPAS sofrerão lise em proporção abaixo de 30% do soro normal. Além disso, elas sofrerão lise no soro acidificado e o teste de sacarose será negativo.
O aquecimento a 56(C inativa o sistema lítico e, se houver lise no soro inativado, o teste não poderá ser considerado positivo.
	
	Teste (ml)
	Controles (ml)
	Reagentes
	 1 2 3
	 4 5 6 
	Soro normal fresco
	 0,5 0,5 -
	 0,5 0,5 -
	Soro normal inativado pelo calor (56(C)
	 - - 0,5
	 - - 0,5
	HCl 0,2 M
	 - 0,05 0,05
	 - 0,05 0,05
	Hm. 50% do paciente
	0,05 0,05 0,05
	 - - -
	Hm. A 50% normal
	 - - -
	0,05 0,05 0,05
	MgCl2
	0,01 0,01 0,01
	0,01 0,01 0,01
	Lise (teste positivo)
	traços +++ -
 (2%) (30%)
	 - - -
	
PEROXIDASE
Reagentes:
solução de benzidina:
Etanol em água a 30% ............................................100 ml
Dicloridrato de benzidina ........................................ 0,3 g
Água oxigenada ...................................................... 0,7 ml
água oxigenada a 5 %: misturar partes iguais de água oxigenada e água destilada (H2O2 a 10%);
solução de sulfato de cobre a 0,5%;
solução de safranina a 1%;
solução fixadora:
Formol 38% ............................................................ 10 ml
Etanol ..................................................................... 90 ml
Técnica:
fixe o esfregaço com a solução 5 por cinco minutos cronometrados;
lave e esgote bem;
aplique a solução 3 durante 30 segundos;
verta fora e não lave;
aplique a solução 1 durante dois minutos;
contracore com a solução de safranina (4) por dois minutos;
lave e deixe secar. Examine em objetiva de imersão.
Fundamento:
A presença de uma enzima oxidativa no citoplasma das células mielóides fornece um meio adicional para diferenciá-las de outros elementos. Na técnica utilizada, a enzima produz oxidação e precipitação da benzidina pelo peróxido de hidrogênio. As células da série granulocítica são peroxidase positiva, em contraste com os linfócitos, células plasmáticas e eritrócitos, que são peroxidase negativa.
Peroxidase positiva: grânulos de peroxidase no citoplasma corados em azul; o núcleo é contracorado em laranja.
OBS.: não usar reagentes velhos. O esfregaço, quando não corado de imediato, deve ser protegido da luz.
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS
Técnica:
colha 5,0 ml de sangue com anticoagulante (EDTA ou heparina). Se o hemolisado não puder ser preparado no mesmo dia, guarde sob refrigeração a 4(C. Não congele o sangue.
preparo do hemolisado:
centrifugue o sangue a 1500 rpm por 5 minutos;
remova o plasma;
lave as hemácias por 2 ou 3 vezes com salina, centrifugando nas mesmas condições acima e desprezando o sobrenadante;
ao volume final de hemácias lavadas, adicione volume igual de água destilada e homogeneize;
adicione um volume de clorofórmio idêntico ao do hemolisado antes formado e agite vigorosamente;
centrifugue a 2000 rpm por 15 minutos;
retire o sobrenadante (= hemolisado) e transfira para frasco limpo;
o hemolisado deve apresentar concentração ideal para eletroforese de 4 a 6 g/dl. Após dosar a concentração inicial de hemoglobina do hemolisado, use a seguinte fórmula, no casso de ser necessário fazer a diluição:
Y ml X g/dl = Y' ml X g/dl
Exemplo:
hemolisado inicial > 15 g/dl
hemolisado necessário = 2 ml a 5 g/dl
	Y X 15 = 2 X 5
	Y = 0,67ml do hemolisado inicial + 1,33 ml de água destilada
este hemolisado pode ser conservado por longo tempo, desde que congelado;
Para a eletroforese propriamente dita, necessita-se de um padrão comprovadamente normal.
Tampão Tris-borato 0,025 m pH = 8,4
Voltagem:300 volts por 30 minutos
Corante: Ponceau S por 10 minutos
Descorante: Ácido Acético a 5%
Eluente: Ácido Acético a 80%
Quantificação: através de eluição
Use 3 ml de ácido acético a 80% para eluição de todas as frações
Leitura: 520 nm
Cálculo: % fração = D.O. fração X 100
	D.O. de todas as frações
Transparentização:
Caso necessário, siga a seguinte técnica:
mergulhe as fitas de acetato de celulose, descoradas e clareadas, em metanol por 1 ou 2 minutos;
remova-as para uma vasilha contendo ácido acético, metanol e glicerina, na proporção 14:85:1 por 1 minuto;
coloque as fitas em superfície de vidro e leve à estufa por 5 a 10 minutos até total transparentização.
Valores normais:
HbA1 = acima de 95%
HbA2 = abaixo de 3 %
HbF = ao nascimento: 75%
	6 meses: ± 5%
	adulto: abaixo de 2,5%
Multiplicar cada uma das absorbâncias pelo Fc e anotar as % de Hemólise.