AULA BETALACTAMASES

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BETA-LACTAMASES
Msc. Isabela Fortaleza
Natal - 2021
HELLO!
Eu sou a Isabela Fortaleza
Biomédica habilitada em Microbiologia e Análises Clínicas
Preceptora de Microbiologia/UnP
Mestre em Ciências Biológicas/ PPgCB – UFRN
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BETA-LACTÂMICOS 
A diva dos antimicrobianos 
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Fármacos antibacterianos
ETEBU; ARIKEKPAR, 2016.
BETA-LACTÂMICOS
MACROLÍDEOS
QUINOLONAS 
AMINOGLICOSÍDEOS
SULFONAMIDAS 
GLICOPEPTÍDEOS 
TETRACICLINAS
OXAZOLINAS 
São comumente classificados pela estrutura molecular, mecanismo de ação e espectro de atividade. 
There are several ways of classifying antibiotics but the most common classification schemes are based on their molecular structures, mode of action and spectrum of activity (Calderon and Sabundayo, 2007). Others include route of administration (injectable, oral and topical). Antibiotics within the same structural class will generally show similar pattern of effectiveness, toxicity and allergicpotential side effects. Some common classes of antibiotics based on chemical or molecular structures include Beta-lactams, Macrolides, Tetracyclines, Quinolones, Aminoglycosides, Sulphonamides, Glycopeptides and Oxazolidinones (van Hoek et al., 2011; Frank and Tacconelli, 2012; Adzitey, 2015).
MACROLÍDEOS: Azitromicina, claritromicina, eritromicina 
Beta-lactâmicos
Mais utilizada 
Excelente histórico 
“Sub-classes”
PENICILINAS MONOBACTÂMICOS 
CEFALOSPORINAS CARBAPENÊMICOS 
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(Williams, 1999)
As penicilinas, que podem ser:
Naturais (penicilina V, penicilina G Procaína, penicilina G Benzatina e penicilina G Cristalina);
Semissintéticas (oxacilina, amoxicilina, ampicilina, ticarcilina e piperacilina);
As cefalosporinas são os betalactâmicos os que apresentam maior número de moléculas semi-sintéticas para tratamento, inclusive de infecções hospitalares e também comunitárias. Elas são divididas em gerações:
1ª geração (cefalotina, cefazolina, cefalexina e cefadroxila);
2ª geração (cefuroxima, cefaclor e ceproxila);
3ª geração (cefotaxima, ceftriaxone e ceftazidima);
4ª geração (cefepime);
5ª geração (ceftarolina).
As cefamicinas: o protótipo é a cefoxetina;
Os carbapenêmicos: Imipenem, Meropenem, Ertapenem e o Panipenem;
Os monobactâmicos: o protótipo é o azetreonam;
O clavulanato, com mínimo espectro de atividade, mas usado como inativador de betalactamase, enzima produzida por bactérias para resistirem a ação dos antibióticos betalactâmicos.
RESISTÊNCIA BACTERIANA 
Nem tudo são flores…
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A resistência bacteriana é a capacidade das bactérias em sobreviver e se multiplicar na presença de um ou mais antibióticos, mantendo, assim, uma infecção. 
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“
CDC, 2017.
any environmental microorganisms (mainly bacteria and fungi) naturally produce antibiotics, which give them a selective growth advantage over other environmental species. These microorganisms possess genes encoding antibiotic resistance mechanisms to the antibiotics they produce. They can transmit these resistance genes to their offspring (vertical transmission) [4]. Microorganisms that do not produce antibiotics may also naturally harbour antibiotic resistance genes or acquire them de novo. In bacteria, there are many genetic exchanges between individuals of the same or different species (horizontal transmission). The spread of antimicrobial resistance between bacteria living in the environment is probably very old (several billion years) and continues today [5]. These resistances can be transmitted from environmental bacteria to those that colonize humans and animals. Examples include the recent emergence of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) of the CTX-M type or a new mechanism for resistance to fluoroquinolones (qnr genes) 
DIMINUIÇÃO DA PERMEABILIDADE 
SISTEMAS DE EFLUXO
ALTERAÇÃO DO SÍTIO DE AÇÃO/REDUÇÃO DA AFINIDADE
INATIVAÇÃO ENZIMÁTICA
SUPERPRODUÇÃO DO ALVO OU DESVIO ENZIMÁTICO
MIMETISMO DO ALVO
Mecanismos de Resistência 
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(Lumen learning, 2017)
BETA-LACTAMASES
O balde de água fria
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Beta-lactamases 
Hidrólise do anel beta-lactâmico 
Beta-lactamases 
Mais de 32 famílias e mais de 2400 variantes de beta-lactamases
Cefamicinases (AmpC)
Cefalosporinases 
Beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
Carbapenemases 
Beta-lactamases 
 As enzimas são denominadas por suas propriedades bioquímicas e moleculares e por características como a cidade onde foi isolada e nome do paciente 
TEM  Temoneira Betalactamase 
SHV  Sulfhydryl reagent variable
CTX-M  Cefotaxima active – Munich
Classificação das beta-lactamases 
Classificação:
Ambler  Estrutura molecular da enzima em 4 classes: A,B, C e D.
Classes A, C e D: Serina – beta-lactamases 
Classe B: Metalo-beta-lactamases 
Bush, Jacoby e Medeiros  Grupos com subdivisões a partir do substrato da enzima e de inibição por inibidores de β-lactamases. 
CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS
Adaptado de Andrade e Darini, 2017.
Cloxacilina Ac. Clavulânico Ác. Fenil borônico
Classificação
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IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL DAS β-LACTAMASES
O guia 
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Identificação laboratorial de resistência bacteriana
As técnicas mais utilizadas e preconizadas por estas organizações são:
Teste de disco-difusão em ágar (Kirby-Bauer)
Concentração inibitória mínima (MIC ou CIM)
Teste de gradiente de concentração (Etest®)
Provas fenotípicas: ESBL, MβL, Teste de Inibição dos carbapêmicos, Testes rápidos
Biologia Molecular
Teste de sensibilidade por disco-difusão 
 Prepara-se um inóculo com a bactéria de interesse à 0,5 MacFarland semeado por distensão em ágar Müller-Hinton. Adiciona-se os antibióticos, determinados pelo CLSI ou BrCAST para a bactéria de interesse. Após 18 horas de incubação a 37 °C, observa-se a formação dos halos de inibição e detrminam-se os diâmetros em mm. A interpretação deverá ser feita de acordo com o estabelecido pelo CLSI ou BrCAST.
Fonte: ANVISA, 2008.
Teste de sensibilidade por Macrodiluição em tubos
O teste consiste na preparação de diluições seriadas de antimicrobianos em meio caldo Müller-Hinton semeado com a bactéria teste. Após incubação por 18 horas à 35°C, observa-se se há crescimento bacteriano. O primeiro tubo que não demonstrar crescimento, denota a concentração inibitória mínima (MIC ou CIM). 
Fonte: ANVISA, 2008.
Teste de sensibilidade por Microdiluição em placa
Esta técnica é semelhante à macrodiluição em tubos, no entanto, o teste é feito em uma placa de microtitulação de 96 poços. 
A vantagem é que até 12 antimicrobianos podem ser testados de uma só vez.
Algumas placas são comercializadas já contendo o antimicrobiano liofilizado ou congelado. 
SensiTest Colistin
Fonte: Launch Diagnostics
Fonte: Santos, 2015.
Etest® ou Teste do Episilômetro
O Etest® é um teste comercial no qual uma fita plástica que é impregnada com diferentes concentrações de antibiótico.
O inóculo e a incubação são as mesmas da disco-difusão.
A CIM do microrganismo testado é determinada no local onde a linha de inibição intersecta a fita.
Fonte: ANVISA, 2008
PROVA ESBL
Um disco de amoxacilina/ácido clavulânico (30 μg) no centro da placa. Ao seu redor são colocados discos de ceftriaxona (30 μg), ceftazidima (30 μg), cefepime (30 μg) e aztreonam (30 μg) a 20mm de distância. A placa é incubada a 35º por 16 a 18 horas. 
O teste é considerado positivo quando há distorções nos halos ou zonas fantasma entre o disco contendo o inibidor de β-lactamase e os discos contendo substrato. 
Fonte: LEM/DMP - UFRN
Isso ocorre pois o ácido clavulânico é capaz de inibir essas enzimas, permitindo que os outros beta lactâmicos ao seu redor atuem.
Testes de inativação dos carbapenêmicos
É um método de triagem fenotípica econômico e altamente robusto, capaz de detectar de maneira confiável atividade de carbapenemases, não somente de metalo-betalactamases, mas de serino-beta-lactamases. 
SCHOUS et al., 2014.
Teste de metalo -β- lactamase
Resistência aos carbapenêmicos  teste de triagem para metalo -β- lactamase(teste do EDTA). 
Em uma placa de ágar Mueller-Hinton, à temperatura ambiente, semeia-se a suspensão bacteriana e coloca-se um disco de carbapenêmico de forma paralela a outro disco de carbapenêmico embebido em 10 μL de EDTA. Se houver aumento do halo de inibição de, aproximadamente, 5mm no disco com EDTA em relação ao disco sem a substância, trata-se de uma cepa produtora de metalo-beta-lactamase.
Quando um inóculo demonstra resistência aos carbapenêmicos no ATB, é necessário fazer o teste de triagem para metalo -β- lactamase (teste do EDTA). Em uma placa de ágar Mueller-Hinton, à temperatura ambiente, semeia-se a suspensão bacteriana e coloca-se um disco de carbapenêmico de forma paralela a outro disco de carbapenêmico embebidos em 10 μL de EDTA. Se houver aumento do halo de inibição de, aproximadamente, 5mm no disco com EDTA em relação ao disco sem a substância, trata-se de uma cepa produtora de metalo-beta-lactamase.
Teste de inativação dos carbapenêmicos
mCIM  Método de Inativação de Carbapenêmico modificado
eCIM  EDTA - Método de Inativação de Carbapenêmico modificado
TESTE RÁPIDO
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TESTE RÁPIDO CARBA-NP
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BIOLOGIA MOLECULAR
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Uso de ferramentas moleculares, especialmente PCR, para detectar a presença de genes produtores de betalactamases.
FIM
Dúvidas?
isabela.bomfim@unp.br
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MUITO OBRIGADA
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