GUIA TP3 BACTERIAS

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Comisión A 13/9 – Comisión B 20/9 TP 3: Bacterias y tinción de gram 
 
OBJETIVOS GENERALES: 
 
 Reconocer los distintos tipos de desarrollo bacteriano en medios sólidos. 
 Relacionar la composición de un medio de cultivo, así como sus propiedades fisicoquímicas con el propósito 
del mismo. 
 Comparar el desarrollo bacteriano proveniente de superficies limpias y sucias en un medio de cultivo 
seleccionado (Agar Chocolate). 
 Identificar microscópicamente morfologías bacterianas mediante la utilización de técnicas de coloración. 
 Reconocer representantes de bacterias de via de ingreso respiratorio, digestivo o que afectan la piel. 
BIBLIOGRAFIA DE CONSULTA: 
Wojciek P. (2015) Ross Histología: Texto y Atlas. Correlación con biología molecular y celular. 7ma Edición. P. 
Wojciek editor. Editorial The Point. 
 
Murray, PR.; Rosenthal, KS; Pfaüfer M. (2014). Microbiología Médica. 7ma Edición Elsevier. Madrid, España. 
 
INTRODUCCION 
Las bacterias son microorganismos procariotas que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros (por lo general entre 0,5 y 
5 μm de longitud). La envoltura celular bacteriana comprende la membrana citoplasmática y la pared celular más una membrana 
externa, en el caso que esta exista. La mayoría de las envolturas celulares bacterianas caen en dos categorías importantes: Gram-
positiva y Gram-negativa. Estas se distinguen por su reacción a la tinción de Gram. La pared celular bacteriana se diferencia de 
la del resto de los organismos por la presencia de peptidoglicano (heteropolímero alternante de poli-N-acetilglucosamina y ácido 
N-acetilmurámico) y está situada inmediatamente a continuación de la membrana citoplásmica. Aunque todas las membranas 
celulares bacterianas contienen peptidoglicano (siendo excepciones algunos parásitos intracelulares, por ejemplo, Mycoplasma), 
no todas las membranas celulares tienen la misma estructura. Esto se refleja notablemente en la clasificación Gram-positiva y 
Gram-negativa de las bacterias. Las micobacterias tienen una envoltura celular que no es típicamente Gram-positiva ni Gram-
negativa. 
 
La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular. Básicamente, se diferencian según 
su forma en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral). Las bacterias 
pueden mantenerse unidas unas con otras después de la división celular, pero conservando siempre la independencia celular. Si 
el plano de división es único, podemos encontrar diplococos o cocos en cadena. Si los planos de división son muchos, los cocos 
pueden agruparse en tétradas o en racimos. Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden 
ser redondeados o rectos; pueden estar aislados, o en cadenas. La morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio 
óptico y permite realizar una caracterización preliminar antes de llevar a cabo la identificación bacteriana. 
En microbiología clínica, las metodologías para lograr un 
diagnóstico rápido, sensible y específico de los agentes 
causales de las enfermedades infecciosas han 
experimentado una revolucionaria transformación en los 
últimos años. La aplicación de técnicas microbiológicas 
convencionales, que requieren el crecimiento de los 
microorganismos para su posterior análisis fenotípico y 
bioquímico, ha pasado a ser complementada con la 
aplicación de métodos moleculares de diagnóstico. Entre 
estos métodos, la reacción en cadena de la polimerasa 
(PCR) que amplifica y detecta un determinado gen, 
específico para una determinada bacteria, ha aportado un 
gran valor diagnóstico en aquellas infecciones 
clínicamente atribuibles a diferentes agentes. 
 
 
ACTIVIDAD 1 Guía de estudio 
 
1. ¿A qué se le llama medio de cultivo? y ¿Para qué se utiliza? 
2. ¿Qué es el agar? ¿Cuál es su función? 
3. Indique la clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado físico y la utilidad de cada uno de 
ellos. 
 
ACTIVIDAD 2 Crecimiento bacteriano y fúngico en agar chocolate 
 
Tras dos semanas de cultivo se observarán las placas de Agar Chocolate sembradas. Cada comisión observará todas las 
placas sembradas ese día y tomará muestras de las propias. 
Respondan: 
1. ¿Qué diferencias pueden observar en la placa 1 
entre la zona tocada con el dedo limpio y 
aquella tocada con dedo sucio? 
 
2. Viendo la diferencia entre las dos mitades, 
¿Podría ser peligroso no lavarse las manos antes 
de comer? 
 
 
 
3. ¿Qué se observa en la placa 2? 
 
4. ¿Por qué se han cultivado a Temperatura ambiente y no a 100ºC? 
 
 
 
 
5. Describan las colonias 
formadas en cada placa. 
Consideren las siguientes 
características: color, 
espesor, forma, textura. 
 
6. Elijan una colonia, fijen 
en portaobjetos y tiñan 
con coloración de Gram. 
 
 
7. Observen al microscopio 
y describan morfología de 
los microorganismos. 
 
 
Tinción de Gram: 
Fundamento 
Las bacterias se tiñen diferencialmente por diferencias físicas y químicas en sus paredes celulares. Estas paredes en las 
Gram + son gruesas y químicamente simples, compuestas principalmente de proteínas y mucopeptidos (peptidoglicano 
o mureína). 
El alcohol causa la deshidratación de la pared celular Gram + reduciendo la perdida de sustancias tales como el cristal 
violeta. La pared en las Gram – es fina y compleja conteniendo proteínas, mucopeptidos y lípidos. Cuando es tratada 
con alcohol se disuelven los lípidos y la coloración primaria es eliminada. Si la integridad de la pared celular está dañada 
o si se decolora en exceso pueden aparecer Gram – las Gram +. 
 
Materiales: 
 
● Palillos de escarbadientes 
● Portaobjetos de vidrio 
● Colorantes para tinción de Gram 
● Aceite de inmersión 
● Solución fisiológica estéril (SFE) 
● Guantes 
● Encendedor 
● Colonias de bacterias 
 
Procedimiento 
1) Colocarse los guantes, tomar un palillo de escarbadientes sin usar y raspar suavemente una colonia 
bacteriana para levantar material con el mismo. 
2) Colocar una gota de SFE sobre un portaobjetos y extender la colonia sobre el portaobjetos suavemente de 
manera que quede uniformemente extendido. 
3) Fijar el extendido a la llama de un encendedor, pasando lentamente el preparado ubicado hacia arriba por 
la llama entre 3 y 4 veces. 
4) Teñir por el método de Gram: 
1. Cubrir la preparación con la solución de cristal violeta. Dejar actuar 20 segundos. 
2. Lavar con agua y cubrir la preparación con la solución de Lugol. Dejar actuar durante 30 
segundos. 
3. Decolorar manteniendo inclinado el preparado y vertiendo sobre él la solución del decolorante. 
Este es el paso más delicado de la coloración. Se debe mantener goteando despacio sobre la 
preparación hasta que no arrastre más colorante por 10 segundos. 
4. Lavar de inmediato con agua y cubrir con la solución de safranina. Dejar actuar durante 20 
segundos. 
5. Lavar con bastante agua y dejar escurrir en posición vertical. Puede también secarse entre dos 
hojas de papel de filtro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Actividad 3 Observación de bacterias al microscopio óptico 
Observar al microscopio los diferentes agentes completando las fichas. 
A) Mycobacterium tuberculosis: 
a) Señalar sus características morfológicas y clasificación. 
b) Mencionar el tipo de tinción utilizada para visualizar el microorganismo ¿Por qué no se tiene con Gram? 
 
 
A)Membrana plasmática, B) 
peptidoglicanos, C) Arabinogalactano, D) 
Lipoarabinomanano con cabeza de 
mananos, E) proteínas, F) Ácidos 
micólicos, G) Glucolípidos, P) Moléculas 
de fosfato. 
c) Colocar el tejido u órgano en donde lo está observando. 
d) Recordar el mecanismo de patogenicidad del agente y las vías de entrada. 
 
Observación al microscopio óptico de preparado definitivo de pulmón con tuberculosis teñido con Hematoxilina- 
eosina. Se observa parénquima pulmonarcon histoarquitectura distorsionada por la presencia de marcado infiltrado 
inflamatorio que en sectores conforma granulomas constituidos por necrosis caseosa central rodeada de infiltrado 
inflamatorio compuesto principalmente por linfocitos e histiocitos con presencia de algunas células multinucleadas de 
tipo Langhans. También se ven granulomas sin necrosis central. 
 
 
 
 
 
B) Helicobacter pylori: 
a) Señalar sus características morfológicas y clasificación. 
b) Mencionar el tipo de tinciones son utilizadas para visualizar el microorganismo ¿Por qué no se utiliza la 
tinción de Gram? 
c) Colocar el tejido u órgano en donde lo está observando. 
d) Recordar el mecanismo de patogenicidad del agente y las vías de entrada. 
 
Observen el tejido Epitelial cilíndrico de la mucosa gástrica con tinción Giemsa. El mismo se halla recubierto por mucus. 
Con mayor aumento (100x) observe al agente H.elicobacter pylori, bacteria Gram negativa, de forma sutil como 
pequeños bacilos curvos en la superficie mucosa fundamentalmente del antro gástrico mezclados en el mucus 
superficial. Los bacilos tienen una gruesa vaina lipídica, de ahí que son débilmente teñidos con el colorante Gram, razón 
por la cuál es probable utilizar coloración Giemsa o Warthin Starry (tinción a base de nitrato de plata, tiñe a la bacteria 
de negro porque la plata precipita en la membrana plasmática y la hace notoria). 
 
C) Staphylococcus aureus 
a) Señalar sus características morfológicas y clasificación. 
b) Mencionar el tipo de tinciones son utilizadas para visualizar el microorganismo ¿Por qué no se utiliza la 
tinción de Gram? 
c) Colocar el tejido u órgano en donde lo está observando. 
d) Recordar el mecanismo de patogenicidad del agente y las vías de entrada. 
 
 
 
 
Mecanismo de infección del agente: Staphylococcus aureus es un coco grampositivo, catalasa positivo que suele 
disponerse en racimos. Esos racimos están cubiertos por una cápsula externa de polisacáridos que protege a las bacterias 
de la fagocitosis. La estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas está constituida por peptidoglucanos, 
proteínas catalizadoras ligadoras de penicilina, ácidos teicoicos y lipoteicoicos, y las proteínas de adhesión a la 
superficie. La cápsula le confiere resistencia a la respuesta inmune porque cubre a las bacterias de las opsoninas (Ig G 
y C3), además la capa de limo extracelular protege de la fagocitosis, y la proteína A bacteriana se liga a las 
inmunoglobulinas evitando la eliminación inmunitaria. Este estafilococo infecta heridas cutáneas entre otras 
enfermedades (ántrax, foliculitis, forúnculos, impétigo, endocarditis, neumonía, empiema, osteomielitis, intoxicaciones 
alimentarias, etc). 
Actividad 4 Observación muestras hospitalarias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anexo 
DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO CLÍNICO… ¿CUÁL ES SU PROPÓSITO? 
Su principal propósito es optimizar la asistencia que se presta al paciente. Para alcanzar este objetivo es esencial 
comunicar, lo antes posible los resultados obtenidos al médico responsable, para que pueda tomar la decisión más 
adecuada que es necesario aplicar en el paciente. 
El diagnóstico etiológico directo de las enfermedades infecciosas pretende demostrar la presencia del microorganismo 
causal en productos patológicos obtenidos del paciente e incluye, entre otros procedimientos, el cultivo, el cual persigue 
el aislamiento del microorganismo causante de la infección. 
Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identificación, es decir, a clasificarlo dentro de un 
grupo o taxón ya establecido, con el que tenga la mayor semejanza. La complejidad de este proceso depende del nivel 
de precisión o discriminación que se pretende conseguir. 
OBJETIVOS Y UTILIDAD DE LAS TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN 
La identificación de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infección es uno de los instrumentos principales del 
diagnóstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas. Diferenciar un microorganismo patógeno per se, 
potencialmente patógeno o contaminante, y deducir sus posibles mecanismos de resistencia, facilita el tratamiento de la 
enfermedad infecciosa con la mayor eficiencia posible. También permite establecer una política de antibióticos 
coherente y apropiada lo que traerá consigo una menor generación de resistencias en los microorganismos. 
Para poder ser clínicamente útil, la identificación de un microorganismo debe ser lo más rápida posible. La economía y 
la práctica dictan el uso de un número mínimo de pruebas diagnósticas. 
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA 
La taxonomía bacteriana tiene como objetivo la construcción de sistemas que permitan clasificar a las bacterias. Dentro 
de la clasificación taxonómica, las categorías y definiciones más utilizadas son familia (un grupo de géneros 
relacionados entre sí), género (un grupo de especies relacionadas entre sí), especie (un grupo de cepas relacionadas 
entre sí), tipo (grupos de cepas interrelacionados dentro de las especies; por ejemplo, biotipo, determinado por 
características metabólicas , morfológicas y bioquimicas, y serotipo, mediante la identificación de antígenos 
bacterianos) y cepa (aislamiento concreto de una especie en particular). Para la identificación de una bacteria se debe 
obtener un cultivo puro de dicho microorganismo. 
Ejemplo: 
 Enterobacteriaceae Yersinia entercolítica 4 03 
 Familia género especie biotipo serotipo 
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS COLONIAS: 
Las bacterias en el medio de cultivo incrementan su número durante el periodo de incubación, luego del cual se vuelve 
turbio debido al crecimiento bacteriano si el medio es liquido o se originarán colonias en un medio sólido. Una colonia 
es una estructura macroscópica de características determinadas que se desarrolla en medios de cultivo solidificados y 
está constituida por una población microbiana de varios millones de individuos procedentes de sucesivas divisiones 
celulares a partir de una célula parental. En medio liquido las células se hallas dispersas, y en consecuencia no hay 
formación de colonias. Las pruebas de identificación se deben hacer siempre con colonias únicas procedentes de 
cultivos puros. 
Después de un examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar, se deben apreciar las principales 
características de las colonias: tamaño, forma, grado de elevación, borde, color, superficie, densidad, consistencia y olor 
La morfología de las colonias es fundamental en la identificación preliminar y para la diferenciación de los 
microorganismos. Para la observación morfológica es preferible examinar colonias de cultivos frescos crecidas en 
medios no selectivos. En este paso de la identificación es muy importante el aislamiento de las bacterias en cultivo puro 
ya que esta debería estar compuesta por un solo tipo de microorganismos y procedería de una única célula. Las colonias 
de una única especie, cuando crecen en medios específicos y bajo condiciones idóneas se describen por sus 
características de tamaño, forma, consistencia, y a veces por su color. El tamaño de las colonias bacterianas es 
generalmente uniforme entre una misma especie. Por ejemplo, las colonias de estreptococos tienen un tamaño más 
pequeño que las de los estafilococos y las enterobacterias. La forma está determinada por los bordes y el grosor de la 
colonia. El borde puede ser liso o rugoso e irregular; la colonia, abultada o plana. La textura de la colonia es también 
importante. Puede variar desde seca a viscosa, con superficie lisa o granular. Algunos microorganismos producen una 
colonia pigmentada, lo que puede ser de ayuda en el proceso de identificación (ejemplo: Pseudomonas aeruginosa 
(pigmento verde), Serratia marcescens (pigmento rojo) aunque en una misma especie puede haber cepas no 
pigmentadas. 
 
 
 
 
 
MEDIOS DE CULTIVO 
 
Enlos medios de cultivo las bacterias se multiplican y es necesario esperar al menos 18-24 horas para visualizarlas. En 
términos generales todas las bacterias tienen unos requerimientos nutricionales imprescindibles para su crecimiento. 
Necesitan una fuente de energía, una de carbono, una fuente de nitrógeno, algunas sales, oligoelementos y agua. Todos 
los medios de cultivo han de cumplir como mínimo con estos requisitos, pero en muchas ocasiones se necesitan además 
otras sustancias adicionales como vitaminas, factores o aminoácidos esenciales. En los medios líquidos las sustancias 
nutritivas se encuentran disueltas. Los medios sólidos suelen consistir en una base de agar, polímero de origen vegetal 
que se mantiene en fase liquida a altas temperaturas y que forma un gel al enfriarse, mantiene una alta humedad y 
contiene los elementos nutricionales necesarios. El cultivo sobre medios sólidos permite disponer fácilmente de las 
colonias bacterianas. Por otro lado, en medios líquidos, el crecimiento suele ser mayor porque la disponibilidad de 
nutrientes también es mayor. El uso de uno u otro tipo de medios depende del tipo de muestra y del patógeno que se 
busca. Según su capacidad para permitir el crecimiento microbiano se clasifican en medios básicos o generales, de 
enriquecimiento, selectivos y diferenciales. 
 
 
 
a) Medios básicos: son medios ricos en nutrientes que permiten el crecimiento de la gran mayoría de las bacterias. Uno 
de los medios más utilizados en los laboratorios es el agar sangre. 
b) Medios de enriquecimiento: están desarrollados para recuperar bacterias exigentes en sus requerimientos 
nutricionales. Se utilizan para bacterias que no crecen en medios básicos. 
c) Medios selectivos: contienen sustancias como cloruro sódico a dosis elevadas, citrato sódico, cristal violeta, sales 
biliares o antibióticos y antisépticos que fomentan el crecimiento de algunas bacterias y evitan el de otras. Son de gran 
utilidad para el aislamiento bacteriano a partir de una población bacteriana mixta. 
d) Medios diferenciales: se utilizan para poner de manifiesto características distintivas de las colonias. Son medios que 
distinguen entre distintos grupos bacterianos en función casi siempre del color de sus colonias. Por ejemplo, el agar 
MacConkey es un medio sólido que permite el crecimiento de bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores 
de lactosa. Los primeros adoptan una coloración rosada que la diferencia de los segundos. Los medios diferenciales, 
además, pueden poner de manifiesto mezclas y contaminaciones en los cultivos. 
e) Medios cromogénicos: en éstos se incorporan sustancias cromogénicas para detectar distintas enzimas producidas 
por los microorganismos. Cuando la bacteria produce el enzima, hidroliza el sustrato y se libera un compuesto 
cromogénico que adquiere un color intenso, dando color a la colonia. 
La capacidad de la morfología colonial para hacer una identificación presuntiva permite: 
• Realizar un diagnóstico presuntivo rápido en un momento de necesidad crítica basado en el juicio razonado del 
microbiólogo. 
• Incrementar la calidad de los cuidados del paciente a través de la comunicación rápida de los resultados, aumentando 
el coste-efectividad de las pruebas microbiológicas (diferenciación de patógenos potenciales de la flora normal). 
 
Tinciones rápidas 
El examen de las muestras debe iniciarse con la inspección visual ordinaria y proceder al examen microscópico para 
visualizar el patógeno o determinar la ausencia del mismo. 
Las muestras pueden prepararse de diferentes formas para hacer a los microorganismos más fácilmente visibles y 
mostrar sus características estructurales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos elementos, como 
motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, detección de parásitos o protozoos o visualización de estructuras fúngicas; 
por otra parte, las tinciones microbiológicas permiten observar a los microorganismos en función de la capacidad de 
los mismos para retener, o no, determinados colorantes. 
Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos, siendo las más usadas las tinciones diferenciales, que 
permiten distinguir a los microorganismos por alguna de sus características tintoriales 
 
• Tinción de Gram: es de gran importancia en Microbiología, ya que permite hacer diferenciaciones taxonómicas, 
separando dos grandes grupos de bacterias (gram-positivas, de color violeta azulado, y gram-negativas, de color rojo-
rosado), según se comporten ante esta tinción. Esta técnica es, casi siempre, la primera prueba que se lleva a cabo en la 
identificación de un microorganismo causante de una enfermedad, aislado de un paciente. Con sólo un microscopio y 
un par de colorante podemos averiguar si un organismo es Gram positivo o Gram negativo, su morfología celular y su 
agrupación típica. Esto, a veces, es suficiente para determinar con qué tipo de bacteria estamos trabajando. El tratamiento 
 
 
 
de una infección depende de que el agente sea Gram positivo o Gram negativo, ya que algunos antibióticos actúan sólo 
sobre los primeros, y otros sobre los segundos. La penicilina, por ejemplo, es más efectiva contra bacterias Gram 
positivas; mientras que la estreptomicina y la tetraciclina actúan sobre ambas. 
• Tinción ácido-alcohol resistente: Actualmente se utiliza una modificación de la técnica de Ehrlich que recibe el 
nombre de tinción de Ziehl-Neelsen. Esta tinción sirve para teñir bacterias del género Mycobacterium, el resto de las 
bacterias se tiñen de azul por el colorante de contraste. M. tuberculosis, causante de la tuberculosis y M leprae, causante 
de la lepra, se identifican mediante esta tinción. Las micobacterias son ácido-alcohol resistentes porque poseen en sus 
cubiertas lípidos de ácidos grasos complejos que forman en su pared celular un material de tipo céreo resistente a la 
decoloración se basa en que ciertos microorganismos no pierden la coloración por una mezcla de ácido y alcohol si han 
sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos ácido-alcohol 
 
PRUEBAS BIOQUÍMICAS 
Luego de haber realizado una identificación bacteriana preliminar mediante la observación de las características de las 
colonias o la morfología celular por medio de las técnicas de coloración de Gram, la caracterización final de un 
aislamiento bacteriano desconocido en género y especie, se logra usualmente mediante la detección de ciertos sistemas 
enzimáticos exclusivos de cada especie. En el laboratorio, dichos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una 
pequeña porción de una colonia aislada a una serie de medios de cultivo que contienen sustratos específicos e indicadores 
químicos que detectan cambios de pH o la presencia de subproductos específicos. Algunas de estas pruebas bioquímicas 
son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta 
unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa 
de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que 
determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que 
contienen el sustrato a metabolizar. No obstante, algunas de estas pruebas pueden realizarse de forma rápida tras 
incubación de unas 2-6h; en general, se trata de reacciones enzimáticas cromogénicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
	Murray, PR.; Rosenthal, KS; Pfaüfer M. (2014). Microbiología Médica. 7ma Edición Elsevier. Madrid, España.
	ACTIVIDAD 1 Guía de estudio
	ACTIVIDAD 2 Crecimiento bacteriano y fúngico en agar chocolate
	Observación al microscopio óptico de preparado definitivo de pulmón con tuberculosis teñido con Hematoxilina- eosina. Se observa parénquima pulmonar con histoarquitectura distorsionada por la presencia de marcadoinfiltrado inflamatorio que en sectore...