ED Metabolismo Glicólise, Ciclo de Krebs e Fosforilação Oxidativa

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UNIVESIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
POLO AVANÇADO DE XERÉM
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – BIOTECNOLOGIA
NANOTECNOLOGIA
Questões sobre: glicólise, Ciclo de Krebs, Fosforilação Oxidativa
O que é metabolismo? Defina catabolismo e anabolismo.
O metabolismo é uma atividade celular altamente coordenada no qual muitos sistemas multienzimáticos (vias metabólicas) atuam de forma cooperativa para obter energia química, converter moléculas dos nutrientes em moléculas com características próprias de cada célula, polimerizar precursores monoméricos em macromoléculas e/ou sintetizar e degradar biomoléculas necessárias a funções celulares especializadas. O metabolismo, o somatório de todas as transformações químicas que ocorrem em determinada célula ou organismo, ocorre por meio de uma série de reações catalisadas enzimaticamente, as quais constituem as vias metabólicas. O catabolismo refere-se às reações que convertem energia para as formas biologicamente utilizáveis, como ATP, GTP e NADH. Já o anabolismo refere-se às reações que necessitam de energia para ocorrerem, como por exemplo a síntese de glicose, lipídeos, DNA, proteínas.
Em qual local da célula ocorre a glicólise? Quais são os pontos de controle da atividade da glicólise? Identifique as enzimas e efetores positivos e negativos.
A glicólise ocorre no citoplasma da célula e possui três pontos de regulação principais:
O primeiro ponto de controle é a fosforilação da glicose catalisada pela hexoquinase, formando a glicose 6-fosfato. A fosforilação da glicose impede que esta saia da célula novamente. Ao adicionar um grupo fosfato à glicose, ela se torna uma molécula carregada negativamente e é impossível atravessar passivamente a membrana celular, mantendo-a aprisionada dentro da célula. A hexoquinase apresenta quatro isoenzimas (I à IV) que se diferenciam pela localização tecidual e regulação enzimática. A hexoquinase II, altamente expressa no músculo, possui alta afinidade por glicose (50 % saturada com 0,1 mM glicose) e é inibida pelo produto (efetor negativo: glicose 6-fosfato). Já hexoquinase IV (glicoquinase) é predominantemente expressa no fígado e possui uma afinidade pela glicose menor que a hexoquinase II (50 % saturada com 10 mM glicose); é inibida pela ligação de uma proteína reguladora (nuclear) específica do fígado (inibição aumentada na presença de frutose 6-fosfato, um efetor alostérico negativo). A glicose compete com a frutose 6-fosfato pela interação com a exoquinase IV; a hexoquinase IV não é inibida pelo produto (glicose 6-fosfao). Hexoquinase I (cérebro e rins), II (músculo) e III (diversos tecidos) possuem características similares.
O segundo ponto de controle é a transformação frutose 6-fosfato em frutose 1,6-bisfosfato catalisada pela enzima fosfofrutoquinase 1 (PFK-1). Esta é inibida alostericamente por altas concentrações de ATP (indica que a carga energética está alta na célula e, portanto, não é necessário que ocorra mais glicólise). A alta concentração de citrato (intermediário do Ciclo de Krebs) também inibe a atividade da
fosfofrutoquinase por indicar que os precursores de biossíntese estão em abundância, não sendo mais necessária a degradação de glicose para este fim. ADP e AMP são efetores positivos, assim como a frutose 2,6- bifosfato, que se liga ao sítio alostérico da PFK-1, aumentando a afinidade da enzima pelo substrato (frutose 6-fosfato) e reduzindo sua afinidade pelos inibidores alostéricos ATP e citrato. O terceiro ponto de controle é a formação de piruvato a partir de fosfoenolpiruvato, reação catalisada
pela enzima piruvato quinase. Esta enzima é regulada negativamente por altas concentrações de ATP, acetil-CoA e ácidos graxos de cadeia longa, e ativada por frutose 1,6-bisfosfato. Quando a concentração de glicose baixa de glicose provoca a liberação de glucagon, a proteína quinase dependente de AMPc (PKA) fosforila a FORMA L (hepática) da piruvato quinase, inativando-a. Isso diminui a velocidade de
utilização da glicose como combustível pelo fígado e permite sua exportação para o cérebro e demais órgãos.
Sabe-se que o Km da hexoquinase é 0,1 mM e da glicoquinase é 10 mM por seu substrato (glicose). O Km é inversamente proporcional à afinidade da enzima pelo substrato (quanto maior o Km, menor a afinidade da enzima pelo substrato e vice-versa). Sabendo que, normalmente, a concentração de glicose na corrente sanguínea é 4 mM, discuta qual das duas enzimas funciona sempre em sua velocidade máxima. Diga também qual delas só funciona bem em altas concentrações de glicose. Indique o tecido predominante de cada isoenzimas.
A hexoquinase é predominante no músculo, cérebro, rins e diversos outros tecidos (isoenzimas I, II e III) possui alta afinidade por glicose – em concentração de 0,1 mM de glicose ela está com 50 % de saturação. Como a glicose que entra nos miócitos a partir do sangue (onde a concentração dela é em torno de 4 mM) produz uma concentração intracelular suficientemente alta para saturar a hexoquinase, e essa enzima normalmente age com a velocidade máxima, ou muito próximo dela. A hexoquinase é
inibida pelo produto (glicose 6-fosfato). A isoenzima predominante da hexoquinase no fígado é a hexoquinase IV (glicoquinase), que possui uma afinidade por glicose menor - em concentração de 10 mM de glicose ela está com 50 % de saturação. Esta concentração de glicose é maior que a concentração normal de glicose no sangue (4 mM). Quando a concentração de glicose no sangue é alta, e isso acontece após uma refeição rica em carboidrato, a glicose em excesso é transportada para o interior do hepatócito, onde a glicoquinase a converte em glicose-6-fosfato. Como a glicoquinase não está saturada quando a glicose no sangue tem concentração de 10 mM, sua atividade continua a aumentar à medida que a concentração de glicose aumenta até 10
mM ou mais.
Qual é o produto final da glicólise e quais são os destinos possíveis deste produto?
O produto final da glicólise é o piruvato, que possui três destinos possíveis: formar acetil-CoA em condições aeróbicas através da enzima piruvato desidrogenase; formar lactato ou etanol em condições anaeróbicas, dependendo do organismo.
Quais são os tipos de fermentações e quais são os produtos finais das mesmas? Qual a função das fermentações? Cite exemplos de situações em que elas ocorrem?
Em hipóxia, o piruvato é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase (fermentação lática). Esta reação ocorre em situações como contração vigorosa (exercício físico intenso) ou em alguns tecidos ou tipos celulares (retina e eritrócitos) mesmo em condições aeróbias. Em condição anaeróbia, alguns tecidos vegetais, certos invertebrados, protistas e microrganismos realizam fermentação alcóolica, onde o piruvato é transformado em CO2 e etanol pelas enzimas álcool descarboxilase e álcool desidrogenase. As fermentações lática e alcoólica necessitam de NADH e produzem o NAD+, que é importante para dar continuidade à glicólise.
Além destas fermentações, existe a fermentação acética, que é uma reação química que consiste na oxidação parcial do álcool etílico, com produção de ácido acético. Este processo é utilizado na produção de vinagre comum e do ácido acético industrial. É realizada por bactérias denominadas acetobactérias, produzindo ácido acético e dióxido de carbono.
Sabe-se que o mercúrio inibe a enzima piruvato desidrogenase. Considerando este fato, quais as consequências metabólicas do envenenamento por mercúrio? Após a ingestão de glicose, essas consequências metabólicas se agravarão? Justifique.
A enzima piruvato desidrogenase é responsável pela conversão irreversível do piruvato à acetil-CoA, uma etapa mitocondrial crucial para interligar a glicólise ao ciclo de Krebs. O mercúrio inibe a piruvato desidrogenase, não havendo formação de acetil-CoA a partir do piruvato, e consequentemente ocorre uma inibição do ciclo de Krebs e uma redução na produção de ATP. Haverá seta maneira um predomínio do metabolismo anaeróbico através do aumento da fermentação lática tecidual. Após aingestão de
glicose, essas as consequências metabólicas se agravarão, pois quando o organismo não utiliza a via aeróbica para obtenção de ATP, há um acúmulo de ácido lático, devido a degradação da glicose pela via anaeróbica.
Explique por que o ciclo de Krebs é considerado uma via metabólica anfibólica. Qual a importância das reações anapleróticas? Cite as principais reações anapleróticas. 
O Ciclo de Krebs participa efetivamente tanto de processos anabólicos como catabólicos, por isso é considerada uma via metabólica anfibólica. Os compostos intermediários do ciclo de Krebs podem ser utilizados como precursores em vias biossintéticas: oxaloacetato e α-cetoglutarato formarão respectivamente aspartato e glutamato. A eventual retirada desses intermediários pode ser compensada por reações que permitem restabelecer o seu nível. Entre essas reações, que são chamadas de anapleróticas por serem reações de preenchimento, a mais importante é a que leva à formação de oxaloacetato a partir do piruvato e que é catalisada pela piruvato carboxilase, que ocorre no fígado e rim. O oxaloacetato também pode ser reposto pela enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (músculo) e pela fosfoenolpiruvato carboxilase (vegetais superiores, levedura e bactéria), a partir de fosfoenolpiruvato. Outra reação anaplerótica adicional é calaizada pela enzima
málica, largamente distribuída nos eucariotos e procariotos, que converte o piruvato em malato, um precursor do oxaloacetato.
Dois lavradores foram contratados para pulverizar uma plantação de laranjas com agrotóxico contendo 0-dinitrocresol (DNOC). No final do dia, ambos começaram a passar mal e um deles morreu quando retornava à sede da fazenda para procurar ajuda. O médico que examinou o corpo observou que o rigor mortis (rigidez muscular) estava muito avançado, considerando a hora da morte do paciente. O outro homem foi internado com temperatura de 39,3ºC e suava profusamente, apresentando frequência respiratória de 60 incursões por minuto. Apesar de todo o esforço médico para reduzir a temperatura corporal, ele também morreu logo depois da internação. A necropsia revelou congestão pulmonar e leve edema. Havia uma impressionante ausência de gordura subcutânea e abdominal. Em vista da história clínica, uma amostra do pesticida foi enviada a uma Faculdade de Biotecnologia próxima, que dispunha de bons laboratórios de pesquisa. Lá, a amostra foi examinada em uma preparação de mitocôndrias de célula do fígado de rato, com um eletrodo de oxigênio (Figura 10.1)
Responda as questões de acordo com o caso clínico apresentado:
a) Esquematize a cadeia respiratória indicando os locais da fosforilação oxidativa e os pontos de entrada dos substratos usados no experimento mencionado na Figura 10.1.
O succinato é um intermediário do ciclo de Krebs que é oxidado pela succinato desidrogenase e gera fumarato e FADH2. O FADH2 é oxidado e transfere seus elétrons para o Complexo II mitocondrial. O malato é um intermediário do ciclo de Krebs que é oxidado pela malato desidrogenase e gera oxaloacetato e NADH. O NADH é oxidado e transfere seus elétrons para o Complexo I mitocondrial. O glutamato é um aminoácido que pode ser oxidado, gerando NADH, que também transfere seus elétrons para o Complexo I mitocondrial. A fosforilação oxidativa ocorre como consequência das
diversas oxidações citadas acima, transferência de elétrons e bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana. Quando os prótons retornam para a matriz através da ATP sintase, ocorre a fosforilação do ADP, formando ATP.
b) Por que a respiração mitocondrial depende de ADP? Explique o resultado da adição de KCN (cianeto de potássio).
O consumo de oxigênio na mitocôndria ocorre quando os elétrons, provenientes de carreadores reduzidos (NADH e FADH2), são transferidos pelos complexos respiratórios I, II e III chegando ao Complexo IV onde o oxigênio é o aceptor final de elétrons. Durante a transferência de elétrons, são bombeados prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana nos complexos I, III e IV, formando um gradiente de prótons e a força próton-motriz necessária para a geração de ATP pela ATP sintase. A síntese de ATP ocorre pelo retorno dos prótons do espaço intermembrana para a
matriz mitocondrial pela ATP sintase, utilizando como substrato ADP e Pi. Caso não haja ADP disponível, não ocorrerá síntese de ATP. A ausência de ADP reduz a velocidade de oxidação de NADH e FADH2 e consequente bombeamento de prótons, já que não é possível a síntese de ATP. O cianeto de potássio inibe a respiração celular, conforme observado na figura 10.1 A, por agir no complexo IV mitocondrial, responsável pela transferência dos elétrons do citocromos ao O2.
c) Em circunstâncias normais, o que aconteceria depois da adição da oligomicina (inibidor da síntese de ATP pela ATP sintase)? O que os dados obtidos permitem concluir sobre o efeito metabólico do DNOC?
Em circunstâncias normais (sem DNOC), a adição de oligomicina deveria inibir a respiração mitocondrial e síntese de ATP, já que esta droga inibe a ATP sintase. O DNOC age como um desacoplador mitocondrial, ou seja, desfaz o gradiente de prótons e inibe a síntese de ATP. Como resultado, o consumo de oxigênio aumenta em uma tentativa de reestabelecer o gradiente de prótons necessário para a síntese de ATP. Aumento do consumo de oxigênio é resultado do aumento de catabolismo para gerar carreadores de elétrons reduzidos (NADH e FADH2) que transferem seus elétrons para os complexos respiratórios.
d) Por que a temperatura corporal estava elevada antes da morte do segundo lavrador? Explique a ausência de tecido adiposo no cadáver. d) Por que a temperatura corporal estava elevada antes da morte do segundo lavrador? Explique a ausência de tecido adiposo no cadáver.
A temperatura corporal estava elevada devido ao aumento do metabolismo catabólico que possui inúmeras reações exotérmicas que contribuem para geração de calor. A ausência de tecido adiposo pode ser atribuída ao aumento da oxidação de lipídeos para gerar acetil-Coa, que entra para o ciclo de Krebs e gera NADH e FADH2, que transferem seus elétrons para os complexos respiratórios, em uma tentativa de reestabelecer o gradiente de prótons e a síntese de ATP.