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Bases Histológicas Mecanismos Celulares, Moleculares e Bases Histológicas Prof. Dr. Igor Luiz Souza da Cruz igor.cruz@faa.edu.br 07 de agosto de 2025. ME CONTA AÍ: Dias Conteúdo 07/08/2025 Métodos de Estudo em Histologia 14/08/2025 Introdução ao Estudo das Células 21/08/2025 Tecido Epitelial de Revestimento e Glandular 28/08/2025 Tecido Conjuntivo 04/09/2025 Tecido Adiposo e Cartilaginoso 11/09/2025 Tecido Ósseo e Muscular 18/09/2025 Tecido Nervoso 25/09/2025 Tecido Sanguíneo e Sistema Circulatório 02/10/2025 P1 09/10/2025 P1 16/10/2025 Semana Desestressa 23/10/2025 Sistema Digestório 30/10/2025 Sistema Respiratório 06/11/2025 Sistema Urinário e Sistemas Genitais Masculino e Feminino 13/11/2025 Sistema Imunitário e Sistema Endócrino 20/11/2025 Feriado 27/11/2025 P2 04/12/2025 P2 11/12/2025 P3 18/12/2025 P3 C R O N O G R A M A P1 P2 https://app.minhabiblioteca.com.br/reader/books/9788527739283 https://app.minhabiblioteca.com.br/reader/books/9788527739283 Objetivos de Aprendizagem do dia • Compreender as técnicas de microscopia para a visualização do material histológico. • Descrever as etapas de processamento histológico. O QUE É HISTOLOGIA? Introdução - Histologia é o estudo das células, tecidos e sua organização na formação dos órgãos do corpo humano. - Por se tratar de estruturas microscópicas, seu estudo depende de técnicas específicas de preparação e do uso de microscópios. (do grego hystos = tecido + logos = estudos) Por que estudar histologia? Biologia celular BioquímicaFisiologia Patologia A compreensão dos tecidos depende da integração com outras áreas da biomedicina. Preparação de Amostras para Microscopia Óptica - Microscópio de luz (óptico/fotônico): • Imagem formada por raios de luz que atravessam a amostra. • Método mais comum: cortes histológicos. - Observação de estruturas vivas: • Possível com células vivas, camadas finas ou tecidos transparentes. • Observação direta em lâminas de vidro ou placas de Petri. • Permite estudo em tempo real, sob diferentes condições fisiológicas. BLADE: o caçador de vampiros. Direção: Stephen Norrington. Produção: Peter Frankfurt, Wesley Snipes, Robert Engelman. [S.l.]: New Line Cinema, 1998. 1 filme (120 min), son., color. Preparação de Amostras para Microscopia Óptica - Tecidos espessos: • Não permitem a passagem da luz diretamente. • Necessário fazer cortes muito finos (cortes histológicos). • Esses cortes são colocados sobre lâminas para observação. - Como são feitos os cortes? • Utiliza-se um equipamento chamado micrótomo. • Antes do corte, o tecido passa por tratamentos específicos. PREPARAÇÃO DOS TECIDOS MICROTOMIA DESIDRATAÇÃO E DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MONTAGEM E COLORAÇÃO DOS CORTES FIXAÇÃO A fixação preserva a estrutura do tecido por meio de agentes químicos, como formol, que criam ligações cruzadas nas proteínas, mantendo sua aparência semelhante à do tecido vivo. Fixação - Por que fixar? • Evitar autólise (degradação por enzimas celulares ou bactérias). • Preservar a estrutura e composição molecular. • Endurecer a amostra para facilitar o corte. - Como é feita a fixação? • Fixação química (mais comum):Tecidos imersos em soluções fixadoras (formam ligações entre moléculas). Exemplo: Formaldeído 4% (microscopia óptica). • Exemplo: Glutaraldeído + Tetróxido de ósmio (microscopia eletrônica). • Fixação física: Menos usada; métodos como congelamento rápido e aquecimento. Fixação Cassete histológico Fixação https://www.youtube.com/watch?v=VFxWpNDrgYE&t=180s PREPARAÇÃO DOS TECIDOS MICROTOMIA DESIDRATAÇÃO E DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MONTAGEM E COLORAÇÃO DOS CORTES FIXAÇÃO Os tecidos são desidratados usando banhos de álcool em concentrações crescentes (50% → 100%) e, em seguida, tornados transparentes através do processo de diafanização usando xileno (xilol). Desidratação e Diafanização - Por que desidratar e diafanizar? • Preparar o tecido para inclusão em parafina ou resina. • Remover água (incompatível com parafina). • Substituir a água por solventes orgânicos miscíveis com a substância de inclusão. • Clarear o tecido, tornando-o translúcido. - Como é feita? • Desidratação: Imersão em banhos de etanol com concentrações crescentes (70% a 100%). • Diafanização (clareamento): Substituição do etanol por solvente orgânico (xilol ou toluol). • O solvente orgânico torna o tecido transparente, indicando que está pronto para a inclusão. DIAFANIZAÇÃO Desidratação e Diafanização Desidratação Diafanização PREPARAÇÃO DOS TECIDOS MICROTOMIA DESIDRATAÇÃO E DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MONTAGEM E COLORAÇÃO DOS CORTES FIXAÇÃO Para permitir o corte em lâminas finas e a observação das estruturas celulares, o tecido é incluído em um meio apropriado. Na microscopia óptica, utiliza-se geralmente parafina. O tecido é infiltrado com parafina fundida e, em seguida, moldado em um bloco que endurece ao esfriar, preparando-o para o corte no micrótomo. Inclusão - Por que incluir o tecido? • Permitir o corte preciso em secções finas no micrótomo. • Diferenciar melhor as células e a matriz extracelular. • Preservar a integridade da amostra durante o corte. - Como é feita? • O tecido é totalmente infiltrado com parafina fundida (microscopia óptica) ou resina (microscopia eletrônica). • Após a impregnação, é transferido para um molde com parafina fundida e deixado até endurecer. • Forma-se um bloco de parafina, que será cortado posteriormente em lâminas delgadas. Inclusão https://www.youtube.com/watch?v=VFxWpNDrgYE&t=180s PREPARAÇÃO DOS TECIDOS MICROTOMIA DESIDRATAÇÃO E DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MONTAGEM E COLORAÇÃO DOS CORTES FIXAÇÃO Depois de os blocos terem sido aparados de modo a remover o excesso de material de inclusão, eles são preparados para a microtomia. Esta tarefa é efetuada utilizando-se um micrótomo, uma máquina equipada com uma navalha ou lâmina e um braço que avança o bloco de tecido em incrementos específicos uniformes. Para a microscopia óptica, a espessura de cada corte é de cerca de 5 a 10 μm. Microtomia - Por que cortar o bloco? • Produzir lâminas finas o suficiente para a passagem da luz no microscópio. • Observar detalhes celulares e teciduais com nitidez. - Como é feita? • O bloco é aparado para remover excesso de parafina/resina. • Em seguida, é colocado no micrótomo, que realiza cortes finos e regulares. • Espessura dos cortes (microscopia óptica): entre 5 a 10 µm. • As lâminas obtidas são recolhidas para montagem em lâminas de vidro. Criossecção de tecidos fixados e congelados https://www.youtube.com/watch?v =mP6aLHo6P2Y&ab_channel=Mont realNeuro Microtomia PREPARAÇÃO DOS TECIDOS MICROTOMIA DESIDRATAÇÃO E DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MONTAGEM E COLORAÇÃO DOS CORTES FIXAÇÃO Os cortes de parafina são montados (colocados) em lâminas de vidro e corados em seguida com corantes solúveis em água, possibilitando a diferenciação de vários componentes celulares. Coloração dos Cortes - Por que colorir os cortes? • A maioria das células e tecidos é incolor. • A coloração permite visualizar estruturas celulares ao microscópio óptico. • Sem coloração, o contraste é insuficiente (exceto em técnicas especiais, como contraste de fase). - Como é feita? • A parafina é removida com xilol ou toluol (desparafinização). • Os cortes são reatribuídos à água por banhos com etanol em concentrações decrescentes. • Após a hidratação, os cortes são corados com soluções aquosas de corantes. - Coloração mais comum: • Hematoxilina e Eosina (HE) – destaca núcleo, citoplasma e matriz extracelular. • Existem diversas colorações específicas para diferentes estruturas e componentes celulares. Coloração dos Cortes https://www.youtube.com/watch?v=2D0rj0m6dV s Coloração dos Cortes Adrenal Hematoxilina/Eosina(HE): - Hematoxilina é um corante básico, cora componentes ácidos como o núcleo. - Eosina é um corante ácido, cora componentes básicos como o citoplasma.Núcleos Citoplasma Coloração dos Cortes - Como funciona a coloração? • Corantes básicos → afinidade por componentes ácidos → estruturas basófilas Ex: núcleo, nucléolo, ergastoplasma, MEC da cartilagem hialina. Exemplos: azul de metileno, azul de toluidina, hematoxilina. Cor: azul ou roxo-azulado. • Corantes ácidos → afinidade por componentes básicos → estruturas acidófilas Ex: citoplasma, mitocôndrias, colágeno, miofibrilas. Exemplos: eosina, orange G. Cor: rosa ou amarelo-alaranjado. Myocardial histology of patient 1: Acid Fuchsin Orange G staining of myocardium [× 200] showing hypertrophy with thickened muscular fibres (Grünert et al., 2020). Pele, mastocitoma de baixo grau, observar os grânulos intracitoplasmáticos dos mastócitos corados de azul e infiltrado de eosinófilos e neutrófilos, canino, fêmea, Shih-tzu, 10 anos e 11 meses, Azul de Toluidina, 40x (Calandro et al., 2011) Coloração dos Cortes Fotomicrografia de um corte histológico corado pelos corantes hematoxilina e eosina. A maior parte da imagem contém hepatócitos, células do fígado organizadas em cordões e que deixam espaços entre si preenchidos por capilares sanguíneos. O citoplasma dos hepatócitos está corado em cor-de-rosa pela eosina. A hematoxilina cora a cromatina dos núcleos e os nucléolos em azul-arroxeado. (Grande aumento. Imagem de P. Abrahamsohn.) Microscópio Óptico Microscópio Óptico • A resolução de um microscópio depende principalmente da lente objetiva, sendo também influenciada pela qualidade e pelo ajuste do condensador. • As oculares ampliam a imagem, mas não aumentam a resolução. • A lente objetiva é uma lente convexa (convergente). Ao atravessar essa lente, os raios de luz vindos da amostra convergem e se cruzam em um ponto focal, o que inverte a imagem. • Ocular + objetiva = ampliação • Condensador = qualidade da luz (sem ampliação) Microscópio Óptico Microscópio Monocular Microscópio Binocular Microscópio Trinocular Lâminas Lâminas com borda lisa e borda fosca A borda lisa se apresenta totalmente transparente, enquanto a fosca tem uma extremidade utilizada para anotação e identificação da lâmina. Lamínulas Utilizada sobre a lâmina para cobrir a amostra, evitando aberrações da imagem e refração dos raios luminosos. Conjunto de Lâminas ITENS DO KIT: Conjunto de lâminas preparadas para estudo em Histologia, composição: 1- Epitélio colunar Sec 2- Epitélio ciliado Sec 3- Epitélio escamoso simples Sec 4- Epitélio Escamoso Estratificado Sec 5- Célula endotelial Sec 6- Folículo cabelo humano Sec 7- Glândula sudorípara humana Sec 8- Tecido Adiposo Sec 9- Tecido Conjuntivo Frouxo W.M. 10- Tecido Conjuntivo Denso Tendão L.S. 11- Cartilagem hialina Sec 12- Cartilagem elástica Sec 13- Osso desgastado X.S. 14- Corte osso descalcificado X.S. 15- Corte osso descalcificado L.S. 16- Tecido Capilar Vessel C.S 17- Músculo esquelético X.S 18- Músculo esquelético L.S 19- Músculo esquelético L.S e X.S 20- Músculo liso X.S 21- Músculo liso L.S 22- Músculo liso L.S e X.S 23- Músculo liso separado W.M 24- Corte de músculo cardíaco C.S 25- Corte de músculo cardíaco L.S 26- Medula Espinhal C.S 27- Medula Espinhal L.S 28- Neurônio - motor W.M 29- Terminação neurônio motor W.M 30- Feixe de Nervos X.S 31- Nervo C.S 32- Nervo L.S 33- Ganglio espinhal L.S 34- Medula Óssea Vermelha sec. 35- Linfonodo sec. 36- Glândula Tireoide Sec 37- Glândula parótida Sec 38- Glândula submandibular Sec 39- Glândula Sublingual Sec 40- Testículo but sec. 41- Língua L.S 42- Corte da Traqueia Sec 43- Esôfago C.S 44- Junção esôfago com estomago. 45- Corte da parede Gástrica Sec 46- Corte do duodeno Sec 47- Corte do jejuno Sec 48- Corte de íleo X.S 49- Colón X.S 50- Reto X.S3 51- Apêndice Sec 52- Corte do Fígado Sec 53- Corte do pulmão Sec 54- Corte da vesícula biliar Sec 55- Ducto biliar Sec 56- Baço sec. 57- Corte de pâncreas Sec 58- Artéria X.S 59- Veia C.S 60- Artéria venosa C.S 61- Corte do cérebro Sec 62- Cerebelo Sec 63- Rim C.S 64- Rim L.S 65- Corte da bexiga urinária 66- Ureter C.S 67- Vesícula seminal C.S 68- Trompa de Falópio 69- Ovário C.S 70- Corte do útero 71- Cervix sec. 72- Glândula mamaria humana Sec 73- Testículo do Rato Sec 74- Testículo C.S 75- Epidídimo Sec 76- Esfregaço de espermatozóides (H) 77- Pênis C.S 78- Corte de próstata 79- Células epiteliais orais 80- Complexo de Golgi Observação: As lâminas poderão sofrer alterações de lote para lote, sem aviso prévio. ? ? Microscópio Óleo de Imersão Função: - Reduz perda de luz e refração - Melhora resolução e nitidez - Protege a objetiva de arranhões ? ? Objetivas Microscopia Eletrônica Microscópio eletrônico de varredura Microscópio óptico Até 1.000x Até 1.000.000x Utiliza um feixe de elétrons para produzir uma imagem ampliada de uma amostra MEV Microscopia Eletrônica de Varredura US$ 1.000.000 = R$ 5.450.000 Fonte: Costa-Bauzá. A.; Grases, F. & Julià F. The power of desktop scanning electron microscopy with elemental analysis for analyzing urinary stones. Urolithiasis, v. 51, 2023. ? MET Microscopia Eletrônica de Transmissão US$ 10.000.000 = R$ 54.500.000Fonte: Zhao J. et al. Cell morphological analysis of SARS-CoV-2 infection by transmission electron microscopy. J Thorac Dis. v. 12, n. 8, p. 4368–4373, 2020. ? Processamento das Amostras - Distorções e Artefatos • A imagem do corte histológico é o resultado de várias etapas, desde a fixação até a colocação da lamínula sobre o tecido. • Essas etapas podem causar distorções nos tecidos, fazendo com que a imagem final seja diferente da estrutura real dos tecidos vivos. • Essas distorções são chamadas de artefatos de técnica. - Causas comuns de artefatos • Retração da amostra provocada pelo fixador, desidratação e pelo calor da parafina na inclusão. • A retração pode criar espaços artificiais dentro e entre as células. • A retração é menor quando os tecidos são incluídos em resinas, que endurecem e preservam melhor a estrutura. Limitações dos Cortes Histológicos - As colorações não revelam todos os componentes celulares em um só preparo. - Técnicas diferentes são necessárias para visualizar estruturas específicas. - Cortes são 2D de estruturas 3D — podem gerar interpretações equivocadas. - Estruturas como núcleos podem aparecer incompletas (“calotas” ou “sombras”). O que aprendemos hoje? O que aprendemos hoje? O que aprendemos hoje? Material Extra Maleck, M., do Nascimento, J. C. ., Souza da Cruz, I. L. ., & Pitta de Resende Côrtes, P. . (2020). Técnicas histológicas adaptadas para tecidos de ratos. Revista De Saúde, 11(1), 25–28. https://doi.org/10.21727/rs.v11i1.1996 A B 1 2 3 4 5 5 43 2 1 Figura 1: Face dorsal papilas filiformes, técnica sem adaptações (A) e técnica com adaptações (B). 1- Queratina; 2- Papila filiforme; 3- Tecido epitelial de revestimento; 4- Lâmina própria; 5- Tecido muscular estriado esquelético. O que veremos no próximo encontro? FEEDBACK DA AULA • Qual é a ordem correta das etapas de preparação histológica para análise na microscopia? R: Fixação, desidratação, diafanização, inclusão, microtomia, montagem e coloração dos cortes. • Descreva qual é a coloração histológica mais amplamente utilizada em análises microscópicas e explique o que essa coloração cora nos tecidos. R: Hematoxilina (corante básico) cora o ácido (núcleo); eosina (corante ácido) cora o básico (citoplasma). • Dúvidas? Avisos: TRAZER JALECO! Slide 1: Bases Histológicas Slide 2 Slide 3 Slide 4 Slide 5 Slide 6 Slide 7: Introdução Slide 8: Por que estudar histologia? Slide 9: Preparação de Amostras para Microscopia Óptica Slide 10 Slide 11: Preparação de Amostras para Microscopia Óptica Slide 12: PREPARAÇÃO DOS TECIDOS Slide 13: Fixação Slide 14: Fixação Slide 15: Fixação Slide 16: PREPARAÇÃO DOS TECIDOS Slide 17: Desidratação e Diafanização Slide 18: Desidratação e Diafanização Slide 19: PREPARAÇÃO DOS TECIDOS Slide 20: Inclusão Slide 21: Inclusão Slide 22: PREPARAÇÃODOS TECIDOS Slide 23: Microtomia Slide 24: Microtomia Slide 25: PREPARAÇÃO DOS TECIDOS Slide 26: Coloração dos Cortes Slide 27: Coloração dos Cortes Slide 28: Coloração dos Cortes Slide 29: Coloração dos Cortes Slide 30: Coloração dos Cortes Slide 31: Microscópio Óptico Slide 32: Microscópio Óptico Slide 33: Microscópio Óptico Slide 34: Lâminas Slide 35: Lamínulas Slide 36: Conjunto de Lâminas Slide 37: Microscópio Slide 38: Objetivas Slide 39: Microscopia Eletrônica Slide 40: MEV Slide 41: MET Slide 42: Processamento das Amostras Slide 43: Limitações dos Cortes Histológicos Slide 44 Slide 45 Slide 46 Slide 47 Slide 48 Slide 49 Slide 50 Slide 51