Relatório de Cinética Enzimática

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Cinética Enzimática
Construção da curva padrão de açúcar redutor:
Objetivo:
 Construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) para determinar a 
concentração de glicose produzida pela reação da invertase.
Introdução: 
 As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua maioria, catalisadas por enzimas, tornando a velocidade das mesmas compatíveis com as exigências metabólicas.
 Para esse estudo, utilizaremos a invertase da levedura que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose.
 Conhecendo-se por colorimetria a quantidade de açúcar redutor formado por cálculo estequiométrico, pode-se determinar a quantidade correspondente de sacarose hidrolisada.
 Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da reação catasilada através de seu Km (concentração de substrato necessária para atingir metade da velocidade máxima da reação catalisada pela enzima em questão).
 A união da enzima com o substrato forma o complexo enzima-substrato, reação reversível, podendo voltar a liberar a enzima e o substrato ou liberando a enzima na mesma proporção em que foi utilizada mais o produto.
 Michaelis e Menten, desenvolveram então a expressão:
 
 onde [S] é a concentração de substrato e Vmáx é a velovicade máxima da reação, em mol (de produto formado) por unidade de tempo.
 Assim, a levedura por intermédio da “invertase” hidrolisa a sacarose, resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, açúcares esses que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é impermeável à sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase para a hidrólise ocorrer fora da célula da levedura.
 Neste experimento, a invertase será obtida de levedura de panificação (fermento fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor), cuja hidrólise resulta na formação de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão estimados pela reação de Somogyl-Nelson.
 Para isso, se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reação enzimática, permitindo determinar graficamente os valores de Km e Vm para a reação enzimática da levedura
Material:
Pipetas
Tubos de ensaio
Espectrofômetro
Reativo de Somoggy
Reativo de Nelson
Glicose
 Metodologia:
Indentificar os tubos; o primeiro com a letra B, o segundo com o número 1, o terceiro com número 2, e assim por diante até o número 5. Adicionar água aos tubos de ensaio. No tubo B foi adicionado 1ml de água, no tubo 1 foi adicionado 0,8ml, no tubo seguinte 0,6ml, o tubo 3 adicionou-se 0,4ml, no tubo 4 foi adicionado 0,2ml, e no ultimo tubo não foi adicionada a água.
 Em seguida, adicionou-se glicose em cada um dos tubos, com exceção do tubo de ensaio B. No tubo 1 foi adicionado 0,2ml, no 2 foi 0,4ml, no 3 foi 0,6ml, no 4 foi 0,8ml, e no tubo 5 foi adicionado 1ml de glicose. Logo depois foi adicionado 1ml de reativo de Somoggy em todos os tubos. Após essa parte da prática, os tubos foram agitados e levados ao banho-maria fervente (100ºC) por 10 minutos. 
Após o banho-maria, foi adicionado 1ml de reativo de nelson em todos os tubos de ensaio, e depois, 7ml de água em cada um dos tubos de ensaio.
Depois foi medida a absorbância dos tubos no comprimento de onda de 530nm. Foram encontrados os seguintes valores de absorbância, começando pelo tubo B, 0,04; no tubo 1 foi 0,107; no tubo 2 foi 0,122; no tubo 3, 0,138; no tubo 4, 0,178; no tubo 5 foi 0,294.
	Tubos
	H2O (ml)
	Glicose 0,2mg\ml (ml)
	Reativo de Somoggy
	Agitar bem e levar ao banho-maria fervente (100ºC) por 10 min.
	Reativo de Nelson
	H2O (ml)
	Glicose (mg)
	ABS (530 nm)
	B
	1,0
	0
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	0,04
	1
	0,8
	0,2
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	0,107
	2
	0,6
	0,4
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	0,122
	3
	0,4
	0,6
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	0,138
	4
	0,2
	0,8
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	0,178
	5
	0
	1,0
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	0,294
Resultados:
 
Construção da curva de Michaelis-Menten e cálculo do gráfico de Lineweaver-Burk:
 1. Objetivo:
 
 Determinação dos parâmetros cinétivos Km (constante de Michaelis) e Vmáx (velocidade máxima) através da construção dos gráficos de Michaellis-Menten e de Lineweaver-Burk.
 2. Material:
 
 Os mesmos utilizados nos experimentos anteriores.
 
 3. Metodologia:
 Identificar os tubos na seguinte ordem: B1, 1, B2, 2, B3, 3, B4, 4, B5, 5. Adiconou-se, respectivamente, as seguintes quantidades de tampão em cada um dos tubos: 2,3ml, 1,8ml, 2,1ml, 1,6ml, 1,7ml, 1,2ml, 0,9ml, 0,4ml, 0,5ml e 0ml. Em seguida, adicionou-se sacarose 0,4M em cada um dos tubos, respectivamente: 0,2ml, 0,2ml, 0,4ml, 0,4ml, 0,8ml, 0,8ml, 1,6ml, 1,6ml, 2,0ml, 2,0ml. Então, adicionou-se 0,5ml de enzima apenas nos tubos 1, 2, 3, 4 e 5. Agitou-se bem os tubos e estes foram colocador em banho-maria(37ºC) por 15minutos. Em seguida, adicionou-se 1ml de reativo de Somoggy em todos os tubos e, então, foram agitados e levados ao banho-maria fervente (100ºC) por 10 minutos. Depois dos 10 minutos, adicionou-se 1ml de reativo de Nelson em todos os tubos. Depois, foram adicionados 5,5ml de água em cada um dos tubos. Após esse processo, foi medida a absorbância dos tubos no comprimento de onda de 530nm. No tubo 1 foi obtido 0,322, no tubo 2 foi 0,404, no tubo 3 foi 0,441, no tubo 4 foi 0,502, e no tubo 5 foi obtido o valor de 0,557.
	
	Tampão (ml)
	Sacarose 0,4M (ml)
	Enzima (ml)
	Agitar bem e levar ao banho-maria por 15 minutos a 37ºC.
	Reativo de Somoggy (ml)
	Agitar bem e levar ao banho-maria fervente (100ºC) por 10 minutos. 
	Reativo de Nelson (ml)
	H20 (ml)
	ABS a 530 nm
	B1
	2,3
	0,2
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	1
	1,8
	0,2
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	0,322
	B2
	2,1
	0,4
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	2
	1,6
	0.4
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	0,404
	B3
	1,7
	0,8
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	3
	1,2
	0,8
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	0,441
	B4
	0,9 
	1,6
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	4
	0,4
	1,6
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	0,502
	B5
	0,5
	2,0
	-
	
	
	
	1,0
	
	
	5
	0
	2,0
	0,5
	
	
	
	1,0
	
	0,557
 4. Resultados:
 
	Tubo
	[sacarose]
	Atividade (ml\min)
	1
	0,008
	0,0018
	2
	0,016
	0,0024
	3
	0,032
	0,0026
	4
	0,064
	0,0030
	5
	0,080
	0,0034