INTRODUÇÃO A ESPECTROFOTOMETRIA

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Introdução a espectrofotometria: Introdução a espectrofotometria: 
dosagem de fenóis em extratos dosagem de fenóis em extratos 
vegetaisvegetais
Prof Diogo Miron
Objetivos
• Caracterizar a espetrofotometria no 
visível;
• Caracterizar a reação com reagente de • Caracterizar a reação com reagente de 
Folin Ciocalteau;
• Apresentar aplicações.
Princípio
1. Radiação na faixa de 200 – 900 nm é passado
pela solução de um analito (amostra).
2. Os elétrons das ligações químicas moleculares
absorvem energia e ocupam um estado de
energia mais alto.
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energia mais alto.
3. A absorção de energia é proporcional à
concentração do analito em faixa específica
(método quantitativo).
4. Os diferentes tipos de ligação geram diferentes
espectros de absorção do analito (método
qualitativo).
Aplicações
• Método robusto e mais utilizado para quantificação de fármacos 
em formulações quando não há interferência dos excipientes ou 
associado a técnicas cromatográficas;
• Determinação do valor de pKa de alguns fármacos;
• Determinação do coeficiente de partição e solubilidade de 
fármacos;
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fármacos;
• Usado na determinação da liberação de formulações farmacêuticas 
(teste de dissolução);
• Pode ser utilizado para caracterização da cinética de degradação de 
fármacos;
• O espectro de UV de fármacos é usado como teste de identificação 
de fármacos pelas farmacopéias.
Pontos Fortes
• Método fácil de aplicar, barato e robusto com 
boa precisão para análise quantitativa de 
fármacos em medicamentos;
• Método de rotina para determinação de 
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• Método de rotina para determinação de 
parâmetros físico-químicos de fármacos;
• Alguns problemas básicos do método podem 
ser resolvidos com a aplicação do método da 
derivada.
Limitações
• Moderadamente seletivo. A seletividade do 
método depende do cromóforo de cada fármaco 
(fármacos coloridos com cromóforo extendido é 
mais facilmente distinguível que fármacos com 
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mais facilmente distinguível que fármacos com 
grupos cromóforos constituídos de grupamento 
benzeno simples);
• Não prontamente aplicável à análise de misturas. 
Pode haver necessidade de associar a técnicas 
cromatográficas 
Revisão
Nome Limites de comprimento 
de onda 
Transição 
Raios X 10
-2
 - 10
2
 Elétrons da camada K e L 
Ultravioleta afastado 10 – 200 nm 
Elétrons de camadas 
intermediárias 
Ultravioleta próximo 200 - 400 nm Elétrons de valência 
Visível 400 – 750 nm Elétrons de valência 
Infravermelho próximo 0,75 – 2,5 µm Vibrações moleculares 
Infravermelho médio 2,5 – 50 µm Vibrações moleculares 
Infravermelho afastado 50 – 1000 µm 
Rotações moleculares e 
vibrações fracas 
Microondas 0,1 – 100 cm Rotações moleculares 
Ondas de rádio 1 – 1000 m -- 
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Ondas de rádio 1 – 1000 m -- 
 
Revisão
Espectro da Luz visível 
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Revisão
• Coloração visualizada nas soluções
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Componentes básicos da instrumentação 
espectroscópica 
• Esquema de um espectrofotômetro UV-Vis
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Componentes básicos da instrumentação 
espectroscópica 
• Monocromador - Prisma
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• Monocromador – Rede de difração
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Componentes básicos da instrumentação espectroscópica 
• Lâmpadas 
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Fonte 
Região de comp. 
onda 
Aplicação 
Lâmpada de H2 e D2 160 – 380 nm Absorção molecular no UV 
Lâmpada de tungstênio 320 – 2400 nm Absorção molecular no Vis 
Lâmpada de Xe 200 – 1000 nm Fluorescência molecular 
 
Componentes básicos da instrumentação espectroscópica 
• Equipamentos com duplo feixe
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Componentes básicos da instrumentação espectroscópica 
• Equipamentos com DAD (Diode Array Detector)
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Análise Quantitativa 
• Lei de Lambert
– A intensidade da luz emitida diminui exponencialmente 
quando a espessura do meio absorvente aumenta 
aritmeticamente ou que qualquer camada de uma dada 
espessura absorve a mesma fração de luz que incide sobre 
ela. 
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Transmitância
0
(%)
P
P
T
T=
Absorvância
TA log−=
Análise Quantitativa 
• Lei de Beer
– A intensidade de um feixe de luz monocromático diminui 
exponencialmente quando a concentração da substância 
absorvente aumenta aritmeticamente.
A = AA = A
1%1%
.b.c.b.c
%%
= = εε.b.c.b.c
MM
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Onde: A é a absorvância; A1% é a absortividade 1% teórica de uma solução a 
1% da substância em análise; b é o caminho óptico, geralmente 1 cm; c% é a 
concentração da substância em g%; ε é a absortividade molar teórica de 
uma solução 1 mol/L da substância em análise; c
M 
é a concentração 
da substância em mol/L.
Exercício 
• Qual a absortividade A1% e ε de um fármaco X que possui 
peso molecular de 200 g/mol e que para uma solução de 10 
μg/mL apresentou absorbância de 0,500?
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Reação de Folin-Ciocalteau
• Muitos métodos, baseados em diferentes
princípios, são descritos para determinação de 
fenóis;
• O método mais utilizado para determinação
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• O método mais utilizado para determinação
de fenóis é o método espectroscópico através
da reação com reagente de Folin Ciocalteau.
Reação de Folin-Ciocalteau
• A redução do ácido fosfomolibdico-
fosfotungstico (Folin) com formação de 
coloração azul emmeio básico (espécies
complexadas de Mo(v))
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Reação de Folin-Ciocalteau
• O reagente de Folin-Ciocalteau é não
específico e detecta todos grupos
fenólicos de extratos, incluindo de 
proteinas.
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• A desvantagem do método é a potencial
interferência de qualquer agente redutor
� pode ser usado para medida da
capacidade redutora de amostras.
Reação de Folin-Ciocalteau - Padrão
• O ácido gálico é geralmente empregado
como padrão de referência e os
resultados expressos em equivalentes de 
ácido gálico.
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Compostos Fenólicos
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Tio-derivados
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Compostos com enxofre (tio- derivados)
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Aminoácidos
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Carboidratos e proteínas
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Compostos com carbonilas
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Exemplo de Método
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Exemplo de Aplicação
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Referências 
• WATSON, D.G. Pharmaceutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Students 
and Pharmaceutical Chemists. New York: Churchill Livingstone, 1 ed., 2000. 
Acervo do professor.
• Jace D. Everette, Quinton M. Bryant, Ashlee M. Green, Yvonne A. Abbey, 
Grant W. Wangila, and Richard B. Walker. A THOROUGH STUDY OF 
REACTIVITY OF VARIOUS COMPOUND CLASSES TOWARDS THE FOLIN-
CIOCALTEU REAGENT. J Agric Food Chem. 2010 July 28; 58(14): 8139–8144. 
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CIOCALTEU REAGENT. J Agric Food Chem. 2010 July 28; 58(14): 8139–8144. 
doi:10.1021/jf1005935.