PROVA PRÁTICA BIOQUÍMICA

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BIOQUÍMICA
Experimento 1: Saponificação 
01. Reação de hidrólise alcalina de trialcilgicerol:
TRIACILGLICEROL + KOH >(aquecimento)> glicerol + sais de ácidos graxos
02. Porque se utiliza EtOH na reação de saponificação?
As funções do etanol nesta reação são: indicar o término da reação, através de um cheiro característico e retirar possíveis impurezas contidas na base ou no éter.
03. Explique a ação detergente dos sabões:
Os sabões, por si só, não removem a sujeira. A porção apolar do sabão reage com a gordura enquanto a polar interage com a água. A gordura fica retida em uma micela de detergente é removida pela ação mecânica da água.
Experimento 2: Extração de polissacarídeo
01. Qual o principio da reação de Molisch e o que acontece quando é aplicada a um polissacarídeo?
A reação de Molisch é uma reação de desidratação, seguido de uma de condensação com o alfa-naftol. Como polissacarídeos são moléculas ricas em grupamentos –OH, são facilmente desidratadas por ácidos fortes, que previamente também rompem as ligações glicosídicas, formando monossacarídeos que são desidratados e formam os derivados furfúricos. Um esquema geral da reação é apresentado na sequência:
02. Porque predomina a coloração azul?
A coloração azul resulta do aprisionamento do iodo no interior da cadeia de amilose, formando o complexo amilose-I6, responsável pela coloração azul intensa, já que há absorção de luz na região visível das cadeias de I6. Quanto maior a ramificação da cadeia, menos intensa será a coloração, uma vez que a interação entre o iodo e a cadeia será menor. Ainda que o amido também seja formado por amilopectina, as cadeias de amilose são maiores e menos ramificadas do que as de amilopectina. 
03. Porque ocorre a precipitação do amido quando, em solução aquosa, é tratado com etanol ou sulfato de amônio?
O etanol possui uma constante dielétrica menor do que a da água, o que favorece as interações amido-amido. O sulfato de amônio diminui a solubilidade do amido, devido sua alta força iônica. O sulfato de amônio vai remover a agua de hidratação do amido, favorecendo as interações amido-amido.
Experimento 3: Precipitação e coloração de proteínas
Objetivo: Evidenciar a presença de proteínas por meio de reações de coloração e verificar a precipitação de proteínas come sem desnaturação.
Precipitação por adição de sais neutros: ocorre um aumento da força iônica do sistema. Salting in: as moléculas de sal interagem com as proteínas, diminuindo as interações P-P, o que aumenta sua solubilidade. Salting out: Em grandes concentrações de sal a água passa a solvatar preferencialmente os íons de sal, aumentando as interações P-P.
Precipitação por solventes orgânicos: A constante dielétrica da água é maior do que solventes orgânicos, o que significa que na água, as interções água-proteína prevalecem as interações P-P, o oposto do que acontece em solventes.
Experimento 4: Fotocolorimetria e determinação do concentração de proteínas
01. Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica?
A espectrofotometria é uma técnica analítica que utiliza o espectro eletromagnético para determinar a concentração de espécies químicas. Na técnica, um feixe de luz atravessa uma solução ou material biológico contendo moléculas capazes de absorver luz. Sendo assim, parte da luz incidente será absorvida, enquanto o restante será detectado pelo aparelho. 
02. Faixa de sensibilidade do método: A absorção ocorre em vários comprimentos de onda, a faixa utilizada é a da luz visível: de 380nm-750nm.
Experimento 5 – Caracterização da urease
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Experimento 6 – Extração de DNA da cebola
DNA pode desnaturar e renaturar conforme alterações na temperatura. Com a presença da DNA polimerase é possível copiar uma parte do DNA. O processo de desnaturação altera propriedades físicas do DNA, como a absorção de luz UV (possibilitando o acompanhamento via espectrofotômetro) e viscosidade. A desnaturação é progressiva e a temperatura na qual 50% do DNA se encontra desnaturado é chamada de temperatura média de fusão (Tm). Quanto mais pares GC, maior a energia necessária para desnaturar o DNA (GC tem 3 LH, AT tem 2).
Exercícios:
01. Qual a função dos componentes na solução de lise? As moléculas do detergente são capazes de desestruturar a organização das moléculas de lipídios presentes nas membranas celulares promovendo o rompimento celular (lise). O aquecimento em banho-maria favorece a desnaturação das moléculas de DNA (abertura das fitas duplas) e o sal (NaCl) estabiliza as fitas simples de DNA. O isopropanol é usado porque o DNA é insolúvel em álcool e deste modo promove a separação dos ácidos nucléicos da solução e, em função de sua menor densidade em relação à água e outros componentes celulares, o DNA migra para a superfície da solução. O álcool também desidrata as moléculas de DNA, fazendo com que elas se aglutinem formando um aglomerado visível.
02. A que se deve a diferença de DNA observada nos experimentos? Deve-se a desnaturação do DNA, que o torna menos viscoso.
Experimento 7 – Hidrólise ácida e enzimática (saliva) do amido
Saliva contém uma amilase que hidrolisa ligações α (1→4), No amido a hidrólise enzimática produz moléculas de maltose, maltotriose, dextrinas, oligossacarídeos e poucas moléculas de glicose. A reação com o iodo vai desaparecendo devido a formação desses produtos. A hidrólise ácida hidrolisa tanto ligações α(1→4) como α(1→6). À medida que a reação progride, a reação com o iodo vai desaparecendo e o poder redutor do hidrolisado vai aumentando como consequência do aumento de açúcares redutores. Neste experimento, é esperado que a hidrólise ácida tenha uma concentração maior de glucose. 
A reação com o DNS (a mesma do experimento da invertase) serve para quantificar a concentração de açúcares redutores na amostra (nesse caso a glucose).
Experimento 8 e 9 – Cinética enzimática
Reação da invertase e dosagem de açúcares redutores pelo método do DNS:
A sacarase catalisa a hidrólise da molécula de sacarose em alfa-D-glucose e alfa-D-frutose:
As hexoses em meio alcalino e com aquecimento formam enedióis que reduz o DNS. A evidência dessa reação é a mudança de coloração amarela a uma coloração marrom/laranja forte. Logo, esses açúcares redutores podem ser determinados com auxilio de espectrofotometria.
Efeitos da concentração de substrato: Em baixas concentrações, a enzima está quase toda na sua forma livre, fazendo com que a velocidade seja determinada pela concentração de substrato, se a concentração de substrato for suficiente, a velocidade varia proporcionalmente com a concentração de enzima. (Vmáx é atingida quando toda enzima se encontra na forma de ES, o substrato com menor valor de Km apresenta maior afinidade com a enzima). A velocidade varia também com o pH, e em geral há uma faixa de pH ótima para cada enzima.
Tempo (abcissa) vs A (ordenada)
Exercícios 
01.Descreva a reação enzimática da invertase:
Sacarose >(invertase)>Glucose + frutose
02. Como se pode determinar a concentração dos produtos da reação catalisada pela invertase?
Através da reação de oxirredução com o DNS. 
03. Qual o Km obtido para a invertase? Qual seu significado?
O Km é a concentração de substrato necessária para atingir a metade da velocidade máxima. Pode ser determinado plotando um gráfico de 1/v (ordenada) vs 1/[S] (abcissa), cuja equação de reta é 1/V=1/Vmáx + Km/Vmáx .1/[S] ou pela equação: Vo= Vmax.[S]/Km+[S].
04. Qual o pH ótimo e seu significado? O pH ótimo de uma enzima é aquela aonde sua atividade é máxima.