MICROBIOLOGIA ORAL - MÉTODOS DE ESTUDOS DE BACTÉRIAS BUCAIS

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Métodos de estudos de bactérias 
• O estudo das bactérias visando à sua identificação, 
principalmente em termos de gênero e espécie, tem múltiplas 
aplicações e finalidades em microbiologia: 
• Diagnóstico microbiológico das diferentes doenças 
infecciosas que acometem o homem, principalmente em 
sua boca (saliva, biofilme, pus e sangue constituem os 
principais espécimes clínicos para o diagnóstico 
microbiológico) 
• Informação microbiológica completa e rápida da 
infecção 
• Identificação dos organismos 
• Susceptibilidade a antimicrobianos 
• Melhor opção terapêutica e tratamento 
• O primeiro aspecto que deve ser ressaltado é a grande 
dificuldade que o bacteriologista enfrenta quando tem que 
identificar uma espécie bacteriana. 
• A maioria dos seres vivos pode ser distinguida pelo simples exame 
morfológico. As bactérias não oferecem essa facilidade. 
• Bactérias são mais difíceis de identificar devido a morfologia 
semelhante. No entanto, o exame morfológico se torna 
extremamente útil quando da necessidade de detecção de 
bactérias não cultiváveis. 
• Nas últimas décadas do século XX começaram a surgir 
perspectivas de facilitamento dessa tarefa, com a utilização de 
métodos moleculares ou genéticos de identificação bacteriana. 
• Podemos citar algumas dificuldades encontradas para identificar 
as espécies: 
• Espécies são difíceis para cultivar e identificar 
• Características físicas de sítios de coleta 
• Sítios com progressão ativa diferente nos tempos de 
coleta (a amostra pode não servir mais devido a sucessão 
bacteriana) 
• A maior parte das infecções bucais são infecções mistas 
e presença de microrganismos oportunistas 
• As análises têm que ser executadas em laboratório de 
Microbiologia devido à necessidade de dispor de materiais 
adequados, como microscópio óptico comum, microscópio de 
contraste de fase ou de campo escuro, bateria de corantes, etc 
• Os testes usados para a identificação de bactérias em 
laboratório podem ser divididos em dois grandes grupos: 
dependentes de cultivo e independentes de cultivo 
• São os mais utilizados 
• Esse método depende de um conhecimento aproximado da 
provável composição da microbiota associada à condição que se 
pretende estudar, de forma a prover as condições atmosféricas e 
nutricionais adequadas aos mais variados tipos microbianos. 
• Necessita do material clinico fresco, meio de cultivo e bactérias 
vivas 
• Conta células viáveis 
• Útil para antibiograma 
Vantagens 
• É o único teste que se presta para a verificação de sensibilidade 
a drogas antimicrobianas (antibiograma, que indica a quais 
antibióticos a bactéria encontrada é sensível ou resistente para 
definir a melhor estratégia de tratamento para o paciente), desde 
que as bactérias sejam mantidas em condição de viabilidade. 
Desvantagens 
• São técnicas geralmente muito trabalhosas, a maioria 
dos resultados demanda alguns dias e em vários casos as 
bactérias são fastidiosas (demandam muitos dias para 
formar colônias) 
• Necessita de microrganismos viáveis para sua execução 
(alguns não são susceptíveis às mudanças ambientais) 
• Ainda não se tornou possível cultivar algumas bactérias 
(a maioria das bactérias orais, principalmente associadas 
a doenças periodontais e doenças infecciosas na região 
de cabeça e pescoço – majoritariamente anaeróbias – o 
que impede a realização do perfil de susceptibilidade a 
antimicrobianos) 
• Só estabelecem a identificação até nível de espécie, não 
se prestando, para a diferenciação de sorotipos ou 
genótipos 
• Baixa sensibilidade nos testes 
• A coleta necessita de cuidados, como o rápido transporte 
para o laboratório de análise e auxilio de meios de 
transporte adequados que impedem ou minimizam a 
desidratação e a oxidação dos materiais coletados, cuja 
preparação é trabalhosa, cara e necessita de mão-de-
obra bastante qualificada 
Coleta do material e meios de transporte 
• A viabilidade de um grupo de microrganismos depende da 
composição dos diferentes meios de transporte. Assim, antes de 
coletarmos o material para análise, devemos ter um bom 
conhecimento sobre esse material para direcionarmos a escolha do 
meio de transporte e o processamento posterior desse material. 
Ideal: o material deve ser coletado em condições de assepsia e 
ser imediatamente processado no laboratório para manter ao 
máximo a viabilidade microbiana. 
Quando não possível: semeadura imediata do material-problema 
em meios de transporte adequados para cada material clínico. 
• Os meios de transporte (meios químicos) mais utilizados 
na atualidade são: 
➢ VMGA III (Viability Maintaining 
Microsbiotatic Medium) 
➢ RTF (Reduced Transport Fluid) 
➢ PRAS (Solução de Ringer Pre-Reduced 
Anaerobically Sterilized) 
➢ THM (Thioglycolate Medium) 
➢ Stuart, adequado para streptococos 
Processamento laboratorial 
1. Dispersão e diluição da amostra 
2. Incubação 
3. Exame de morfologia das colônias 
4. Teste para identificação definitiva de bactérias (mais 
específicos, determinam a espécie por meio do fenótipo 
do organismo isolado) 
➢ Provas bioquímicas: baseiam-se na detecção de 
atividades enzimáticas das bactérias, 
expressadas pela produção de catabólitos 
como: ácido, CO2, enzimas, exotoxinas, etc 
 
➢ Provas sorológica: detectam antígenos de 
superfície na bactéria (imunofluorescência, 
imunoaglutinação do látex, ensaio de 
imunoabsorção acoplada a enzimas – ELISA); 
podem levar a reações cruzadas. 
➢ Provas moleculares: trabalham com o DNA da 
bactéria (pode ser executada na ausência de 
bactérias viáveis, tornando dispensável a 
realização de cultivos) 
Testes independentes de cultivo 
• Constituídos, principalmente, pelos modernos testes de 
identificação genética de bactérias (testes 
genéticos/moleculares: sondas de DNA e PCR) 
Vantagens 
• Não necessitam de organismos viáveis/bactérias vivas 
• Diagnóstico é mais seguro pois baseiam-se em sequencias 
de ácidos nucleicos e não na expressão fenotípica (que 
podem se alterar devido a variações das condições de 
cultivo) 
• Possibilitam a caracterização genética dos 
microrganismos 
• Alta sensibilidade e especificidade 
• Menor tempo necessário para identificação 
• Material clínico fresco ou congelado 
• Não precisa de meio de cultivo 
• Não conta células bacterianas 
• DNA diretamente de material clínico: não exigem o 
isolamento do agente infeccioso, podendo ser efetuadas 
em amostras retiradas diretamente da infecção 
• Eficiente detecção de anaeróbios (muitos não crescem 
adequadamente em culturas) 
• Limitações muito menores em relação aos métodos de 
cultura 
Desvantagens 
• Não permitem a realização do antibiograma, o que reduz sua 
utilidade 
Sondas de DNA 
• Etapas principais: 
• Desnaturação do DNA 
• Hibridização 
• Detecção 
• A sonda é um pequeno pedaço de DNA que é projetada para ter 
uma sequência complementar a sequência particular do DNA na 
amostra. Isto permite que a sonda hibride ou se ligue a um 
fragmento de DNA específico na membrana 
• Após a hibridação, a sonda permite que o fragmento de DNA de 
interesse seja detectado entre os muitos fragmentos de DNA 
diferentes na membrana e irá parear com qualquer sequência de 
DNA complementar a ela. Portanto, se a sequência procurada não 
estiver presente na amostra, não houve o pareamento. 
Obs: 
• Esse método permite o processamento de muitas amostras 
simultaneamente, mas possuem sensibilidade e especificidade 
inferiores aos métodos de PCR. 
• As sondas de DNA não discriminam entre células viáveis e não 
viáveis, podendo produzir resultados falso-positivos 
Reação em cadeira da polimerase (PCR) 
• Permite a detecção de patógenos isolados (obtidos por cultura) 
ou diretamente em material clinico, mesmo se presente em 
pequenas quantidades através da amplificação de sequencias 
nucleotídicas de DNA contidas no patógeno. 
• Detecta-se pequenasquantidades de DNA bacteriano 
• Produz um grande número de cópias de um ou mais genes 
a partir de uma mínima quantidade de DNA 
• Detecta-se microrganismos em espécimes clínicos 
estocados 
• Viabilidade microbiana não é necessária 
• Com o advento do PCR em tempo real, além da presença do 
microrganismo, pode-se realizar a quantificação do DNA do mesmo 
na amostra clínica em tempo real, o que permitiria acompanhar a 
eficácia do tratamento instituído. 
• A detecção de microrganismos utilizando-se de métodos de alta 
especificidade e sensibilidade é de grande importância em 
infecções graves e/ou raras, pois é possível que patógenos 
permaneçam na região infectada e continuem a sobreviver em 
pequenos número, evitando a agudização do quadro infeccioso 
Obs: sua especificidade limita a quantidade de informações que 
podem ser fornecidas pelo teste, uma vez que apenas detecta um 
ou alguns patógenos em cada conjunto de ciclos de amplificação do 
DNA. 
Coleta do material e meios de transporte 
• Enquanto a viabilidade e quantidade celular não são pontos 
relevantes para os testes moleculares, o transporte dos espécimes 
em condições em que o DNA mantenha sua integridade é 
fundamental. (devem ser transportados em temperaturas baixas) 
• O DNA deve ser extraído de forma a eliminar agentes capazes 
de inibir a ação da DNA polimerase 
Além dos aspectos metodológicos relativos à detecção de 
diferentes espécies bacterianas da microbiota bucal, existe uma 
grande diversidade entre microrganismos da mesma espécie. Esta 
diversidade pode inclusive refletir-se na virulência. 
• Alguns clones de uma determinada espécie podem estar mais 
associados a doenças do que outros, refletindo a importância da 
detecção de clones específicos de um determinado patógeno, e não 
somente a identificação em termos de espécie. 
• Para a identificação dos clones de maior virulência geralmente 
são usadas técnicas baseadas em sondas de DNA ou PCR 
• Os métodos mais utilizados para análise da diversidade 
microbiana envolvem a análise do DNA cromossômico e/ou 
plasmidial. A análise da diversidade também é útil na determinação 
da identidade das cepas entre indivíduos diferentes.