parte 6 - propagação in vitro

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17/12/2020
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Propagação in vitro
INTRODUÇÃO 
Biotecnologia:
• realizar ou modificar produtos ou processos
para um uso específico utilizando utilizando
sistemas biológicos, organismos vivos, ou seus
derivados.
Exemplos clássicos
• emprego de leveduras na produção de:
• pão,
• cerveja e chopp
• vinho
• emprego de bactérias na produção de:
• queijos
• Iogurtes
• estratégias de melhoramento de plantas;
• obtenção de híbridos
INTRODUÇÃO 
• Cultura tecidos vegetais:
Denominação genérica que se dá aos vários procedimentos de
cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais em um meio
nutritivo e em condições assépticas
Consiste em selecionar explantes, desinfectá-los e cultivá- los em
meio nutritivo mantido sob condições assépticas, sendo a
multiplicação dos propágulos feita através de sucessivos
subcultivos.
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Principais características
 in vitro = cultivo em frascos de vidro ou
plásticos
Ambiente artificial (físico e nutricional);
Ocupa menor espaço físico;
Diferentes tipos de células, tecidos e órgãos;
Ambiente asséptico = ausência de
microorganismos e insetos
Importância da cultura de tecidos
 excelente ferramenta para clonar plantas em escala comercial
(grande escala, pequeno espaço, durante o ano todo);
 Propagação de espécies de difícil propagação por sementes;
 limpeza clonal (produção de mudas livres de vírus;
 Conservação de germoplasma;
 Manipulação genética: colaborar na realização de estudos de
transformação genética; hibridação somática, seleção in vitro,
indução de mutações;
 Embriogênese Somática: produção de sementes sintéticas
 Estudos de desenvolvimento: Aperfeiçoamento da interação entre
fatores abióticos (nutricionais, luminosos, temperatura etc) e
bióticos (hormonais e genéticos), resultando em plantas sadias,
vigorosas e geneticamente superiores, que podem ser
multiplicadas massivamente.
Desvantagens 
 Limitação da propagação massiva em
todas as especies vegetais;
 Alto custo de implantação do sistema;
 Necessidade de mão-de-obra
especializada.
Princípios/Fundamentos da cultivo 
in vitro
Princípios/Fundamentos da cultivo 
in vitro
 Cultivo in vitro se fundamentam na teoria da
TOTIPOTENCIALIDADE da célula vegetal
 GOTTLIEB HABERLANDT (1902) Totipontência celular:
‘Cada célula vegetal possui o potencial genético para
reconstruir um organismo inteiro”
 Totipotencialidade é a capacidade que uma célula tem
para se dividir e produzir TODOS os tipos celulares que
compõem o organismo, podendo formar um organismo
inteiro.
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Princípios da cultura de tecidos 
 O processo que leva a regeneração de uma planta é 
conhecido como morfogênese.
Durante a morfogênese há vários estágios que 
conduzem a diferenciação e especialização das 
células, em tecidos e orgãos;
 Outros fundamentos: 
 Determinação: capacidade da célula em seguir por 
uma rota morfogênica especificada. 
 competência celular: grau de “compromisso” da 
célula com uma rota morfogênica. 
Exemplo: Células de raiz 
 ASSEPSIA
 associação explante x meio de cultura x ambiente
 desenvolvimento de microorganismos (fungos e
bacterias);
 competição explantes ou modificam sua
composição
Princípios da cultura de tecidos 
Sistemas/Técnicas 
de cultura in vitro de células e 
tecidos
Cultura de Embrião: Embrião zigótico imaturo ou maduro;
Cultura de Órgãos: meristema, raiz, gemas, outros.
Cultura de Calos: cultivo de uma massa não-diferenciada de 
células.
Cultura de Células em Suspensão: cultura de células isoladas 
e/ou em pequenos agregados, incubada sob agitação.
Embriogênese Somática: produção de embrião 
morfologicamente semelhante a um embrião zigótico que é 
diferenciado a partir de células somáticas.
Cultura de Células Haplóides: cultura de anteras, grãos de pólen 
e óvulos, com o objetivo de se obter plantas haplóides.
Cultura de Protoplastos: isolamento e cultivo de células sem 
parede celular
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EXPLANTES 
Qualquer segmento de tecido oriundo de uma
planta para iniciar uma cultura in vitro, geralmente
com vistas a estabelecer um protocolo de plantas
de genótipo superior
Dois tipos:
Meristemáticos: ápice caulinar, meristema
apical, segmento nodal e embrioes (sementes)
Não meristemáticos: discos de folha,
segmentos de raízes e segmentos de folhas
Explantes
PREFERÍVEIS
tecidos não diferenciados ou com menor nível de
diferenciação, pois:
 apresentam alta capacidade morfogenética
 apresentam células geneticamente estáveis (permite
regenerar plantas idênticas a planta mãe).
 permitem obtenção de plantas livres de vírus;
Explantes com menor nível de 
diferenciação
Meristema apical
Ápice caulinar
Embriões imaturos
Gemas axilares – segmento nodal
Cultura de órgãos 
(meristemas,raiz, gemas, segmentos nodais, gemas, 
etc)
a) Cultura de meristema:
Consiste no estabelecimento do domo meristemático apical sem os primórdios
foliares. A brotação apical tipicamente cresce, originando um único broto.
b) Cultura de ápices caulinares:
É o estabelecimento in vitro a partir de brotações apicais maiores do que
aquelas utilizadas para iniciar a cultura de meristema, tendo alguns
primórdios foliares. Essas brotações apicais podem produzir múltiplas
brotações.
c) Cultura de segmentos nodais:
Os segmentos nodais são constituídos de gemas laterais isoladas, segmentos
de caule com uma ou múltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar
uma única brotação.
Meristema apical x ápice caulinar 
Meristema apical: 
• tecido distal ao mais novo primórdio foliar;
• forma de cúpula achatada;
• células não diferenciadas
• tamanho: 0,10 – 0,20 mm
Ápice caulinar; 
• engloba meristema apical com primórdios foliares e folhas emergentes.
• Tamanho: 0,3 a 20 mm
Por que o meristema é livre de 
vírus?
Algumas hipóteses:
• Falta de conexão vascular;
• Multiplicação do vírus é menor que o crescimento apical da
planta;
• Processos de mitose e duplicação de cromossomas competem
com a replicação do vírus
• Conteúdos elevados de auxinas inibem a difusão do vírus
• Existe um mecanismo de inativação viral nas células
meristemáticas em cultura
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Eliminação de vírus 
termoterapia e crioterapia
Limpeza de vírus
ex: vírus do mosaico da cana-de açúcar
termoterapia + cultura do ápice meristemático
cultura de meristema: explante 0,3 mm
cultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) 
termoterapia (45ºC / 8 horas)
quimioterapia + cultura do ápice meristemático
incorporação de antivirais no meio de cultura
Indexação: 
avaliação da presença do vírus
ensaios biológicos
microscopia eletrônica
sorologia (ELISA)
hibridação com ácidos nucléicos
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Cultura de embriões 
importante na propagação sexuada (via sementes) de plantas com sementes
com dificuldade de germinação na natureza. Ex: orquídeas, plantas nativas,
plantas em risco de extinção
Etapas de desenvolvimento no 
processo de propagação in vitro
T1
T2
T3
Estádios in vitro
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Vias de regeneração in vitro
Após a desinfecção e inoculação do explante as plantas 
podem ser regeneradas por
• Micropropagação: plantas regeneram-se diretamente de um 
tecido organizado se a necessidade do estádio de calo 
• Organogênese: orgãos vegetais são induzidos a partir de uma 
ou várias células
• Direta ou adventícia: órgão é induzido e desenvolve 
diretamente do explante (sem passar pela fase de calo)
• Indireta: Há uma fase de proliferação e crescimento de 
calo seguido por indução e crescimento de brotos ou 
raízes
• Embriogênese somática: formação de embriões é induzida a 
partir de células somáticas 
• Direta ou indireta (mais comum)
Morfogênese indireta 
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Sementes sintéticas: Após obtidos os embriões os mesmos podem ser
encapsulados formando a semente sintética. A semente sintética é análoga à
semente verdadeira ou botânica, e consistem de um embrião somático
envolto por uma ou mais camadas de compostos artificiais, formando uma
cápsula.
 Todo material a ser micropropagado passa, obrigatoriamente, pelos
seguintesestágios.
ESTÁGIO 0 (FASE PRELIMINAR)
Preparo do material a ser micropropagado:
 Obtenção da matriz rigoroso tratamento fitossanitário.
cultivo em ambiente protegido para maior
controle dessas condições.
 Plantas saudáveis.
 Evitar rega excessiva.
 Induzir crescimento vigoroso às plantas
Gema apical
Vaso – Casa de Vegetação
ESTÁGIO 1 (Seleção, Coleta e Desinfestação do Explante)
 Escolha do melhor tipo de explante a ser coletado.
 Lavagem com detergente
 Lavagem com Álcool
 Imersão em Hipoclorito de Cálcio
 Lavagem em água destilada estéril (duas ou três vezes)
 Inoculação explante no meio (cultivo in vitro)
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ESTÁGIO 2 (Multiplicação)
É a fase da micropropagação propriamente dita. Pode ser repetida, até um
certo limite (número de repicagens) para aumento do material a ser
micropropagado.
MS + Vitaminas + Suplemento de mg/L BAP (Citocinina)
Objetivo: Multiplicação propriamente dita dos orgãos e estruturas que são 
capazes de dar origem a plantas completas.
Fase de multiplicação - repicagem 
das plântulas
Desenvolvimento em câmaras de 
crescimento
Câmara de
Crescimento
Bananeira
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ESTÁGIO 3 (Alongamento e Enraizamento)
Nesta fase, o explante, no caso, broto adventício, é transferido,
inicialmente, para meio de cultura contendo auxinas para
alongamento e enraizamento.
MS ½ + Vitamina + mg/L de AIB (ou mg/L de ANA) + mg/L de Floroglucinol
Repicagem para 
meio de 
enraizamento
Desenvolvimento 
em câmara de 
crescimento
Final da fase de 
enraizamenrto 
(bananeira)
Câmara de
Crescimento
Formação de Calo
Figueira
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Formação de
Raízes em
Figueira
ESTÁGIO 4 (aclimatização)
 Para solo ou substrato e aclimatação em condições ex-vitro.
 Espécies lenhosas apresentam maior dificuldade no transplante e 
aclimatização do que as herbáceas.
 Normalmente realizada em Casa de Vegetação ou sob nebulização 
intermitente.
 Ambientais 
 Umidade relativa
 Luz
 Micro-organismos 
 Concentração de CO2
 Internos
 Morfologia estomatica
 Funcionamento estomatico
 Formação de cera epi-cuticular
 Capacidade fotossintética
Fatores que afetam a 
aclimatização
Figueira
Figueira
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Transferência para 
tabuleiros com um 
substrato de turfa e 
perlite (2:1)
Bananeiras 
transferidas
Fase de aclimatização 
antes da passagem 
para estufa (violetas)
Aclimatização em 
estufa
Alguns exemplares das 
bananeiras produzidas
Um exemplar de violeta 
produzida por este 
método
Meios de cultura
Objetivo: 
fixar o explante;
fornecer substâncias essenciais para o
crescimento dos tecidos;
controlar, em grande parte, o padrão de
desenvolvimento in vitro.
Composição:
nutrientes minerais, com algumas modificações para
atender às necessidades específicas in vitro.
compostos orgânicos são adicionados ao meio para
suprirem as necessidades metabólicos, energéticos
e estruturais das células.
COMPONENTES DE MEIOS 
NUTRITIVOS
Água
 componente de maior quantidade no meio.
 fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de tecidos in
vitro
 destilada e deionizada, ou bi-destilada
Macronutrientes
Micronutrientes
Fonte de carbono e energia 
 Fotossintese não efetiva: condições adequadas de iluminação e 
concentração de CO2 e, às vezes, não apresentam teores de clorofila;
 Sacarose mais utilizado: mais altas taxas de crescimento na maioria das 
espécies. 
 Concentração de sacarose: função do objetivo e estádio do explante;
Vitaminas
Mistura básica de vitaminas utilizadas até hoje:
 Tiamina (vitamina B1), 
 Ácido nicotínico (niacina) 
 Piridoxina (vitamina B6), a qual normalmente se adiciona o 
aminoácido glicina.
 Mio-Inositol: O mio-inositol é um componente do meio MS e da 
maioria dos outros meios em uso atualmente. A concentração 
mais usada de mio-inositol nos meios é de 100 mg l-1.
 Acido ascórbico
COMPONENTES DE MEIOS 
NUTRITIVOS
Reguladores de Crescimento ou Hormônios
As auxinas e as citocininas são as classes de reguladores de crescimento
mais utilizadas na cultura de tecidos.
A formação de raiz, parte aérea e calo em cultura de tecidos é regulada pela
disponibilidade e interação dessas duas classes de reguladores de crescimento.
As várias auxinas (AIA - ácido 3-indolacético, AIB - ácido indolbutírico e 2,4-D
ácido 2,4-diclorofenoxiacético, entre outras) dão respostas diferentes in vitro.
Também existem diferenças entre as citocininas, sendo que o BAP – 6-
benzilaminopurina induz a formação de grandes números de brotos e alta taxa
de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação. Poucas culturas in
vitro mostram respostas às giberelinas.
COMPONENTES DE MEIOS 
NUTRITIVOS
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Ágar e Semelhantes
 Os meios nutritivos podem ser líquidos ou sólidos, sendo que a cultura em
meio líquido normalmente exige algum tipo de suporte ou agitação para
fornecer o oxigênio necessário para a respiração do explante.
 Os meios líquidos possuem a vantagem de preparo mais rápido (e mais
barato) do que os sólidos.
 Os meios sólidos ou semi-sólidos, tradicionalmente, são solidificados com
ágar (polissacarídeo extraído de algas marinhas) o qual é dissolvido em
água fervente sendo responsável pela consistência do meio que depende de
sua concentração.
 Outros produtos geleificantes são o Gelrite (Calbiochem) e o Phytagel
(Sigma). Apresentam grau de pureza maior que o ágar e são provenientes
de fermentações bacterianas (George, 1996). Em geral são usados na
concentração de 0,2% a 0,5% (2 a 5 g/l).
COMPONENTES DE MEIOS 
NUTRITIVOS
Carvão aditivado:
 pó fino e de cor escura,
 adsorve substâncias potencialmente fitotóxicas produzidas pelo próprio
explante e assim minimizar os problemas com a oxidação das culturas.
 Concentrações em torno de 0,1% a 0,3% são normalmente usadas,
principalmente para adsorção de compostos fenólicos produzidos pelo
explante.
 Sugere-se, em alguns casos, aumento da concentração de fitorreguladores
utilizada quando na presença de carvão ativado, pois alguns tipos de
fitorregulares podem ser adsorvidos pelo carvão ativado e assim diminuir a
sua biodisponibilidade.
Fungicidas e antibióticos
COMPONENTES DE MEIOS 
NUTRITIVOS
COMPONENTES DE MEIOS 
NUTRITIVOS
pH
 O pH dos meios nutritivos ajustado com 
 HCl ou NaOH, 
 valor ligeiramente ácido (entre 5 e 6)
 5,6
Exemplo protocolo
1. Pulverização planta no vaso ou campo
Benlate 500 – 60 g/100 L de água
Agrimicina – 240 g/100 L de água
2. Assepsia
- lavagem com detergente neutro por 5 min.
- etanol 70% por 1 minuto
- imersão em benomyl (2 g/L) e cloranfenicol (100 mg/L ) 5 minutos. 
- 150 mg/l acido cítrico + 150 mg/l acido ascórbico: 5 min.
- hipoclorito de sódio 3,0% , por 30 min (mesa vibratória).
- lavagem em água destilada por 3 vezes, dentro Câmara Asséptica. 
Tempo total de 10 min.
3. Papel para enxugar esterilizado a 180 graus ou autoclavado
4. Vitaminas
- Tiamina: 1000 mg Tiamina / 100 ml água destilada 
solução  1 ml (10 mg Tiamina ) / L Meio.
- Ácido Nicotínico: 200 mg Ác. Nicotínico (volume 
conhecido de KOH 0,2N) / 100 ml água destilada 
solução  1 ml (2 mg Ác. Nicotínico ) / L Meio.
- Pirodoxina: 1000 mg Pirodoxina / 100 ml água destilada 
 solução  1 ml (10 mg Pirodoxina ) / L Meio.
- Inositol: 10.000 mg Inositol / 100 ml água destilada 
solução  1 ml (100 mg Inositol ) / L Meio.
- Sacarose: 30 g / L de meio MS.
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5. Tratamentos: 
MS, acrescido de: 
0,5 mg .L-1 de BAP + 1,0 mg.L-1 de AIB
6. Instalação
Inoculação  plástico na tampa
7. Tempo de luz: 4 dias no escuro e depois usar 16 
horas de luz/dia.
4.6. FATORES QUE AFETAM A RESPOSTA DO EXPLANTE 
IN VITRO.
a) Material Vegetal
 Genótipo:
 Talvez o fator mais importante na determinação da resposta do
explante.
 Devido ao ciclo celular, não é raro, a ocorrência de respostas
diferenciadas de materiais entre clones diferentes.
 Estado fisiológico da planta matriz, com ênfase à fenologia:
Respostas diferentes podem ser obtidas se o explante écoletado em plantas
em:
 estágio dormente,
 em florescimento,
 em frutificação, ou
 com diferentes condições de nutrição.
 Tratamento à Planta Matriz:
A resposta do explante depende:
 em muito do tratamento fitossanitário (Benomyl, Agrimicina).
 da aplicação de reguladores vegetais a que foi submetida a planta
matriz.
 Tamanho do Explante:
Geralmente, quanto maior for o explante, melhor será a resposta em 
termos de pegamento.
 Oxidação do Explante:
Em algumas espécies pode haver a liberação de compostos fenólicos
interferindo na resposta do explante. Neste caso, deve-se aumentar a 
freqüência de repicagens e adicionar antioxidantes ao meio de cultura.
Ácido cítrico e ascórbico.
Carvão
b) Fatores relacionados ao ambiente:
Todos os elementos do ambiente podem interferir diretamente na
resposta do explante. Entre esses fatores, destacam-se:
 luminosidade (intensidade e fotoperíodo),
 temperatura,
 umidade,
 pressão osmótica, gases (O2 e CO2)
 e tamanho do recipiente.
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C) Meio de Cultura
 A composição do meio de cultura (macro e micronutrientes),
 adição e fonte de carbono,
 e combinação e concentração de reguladores vegetais,
“fatores mais importantes na determinação do 
meio de cultura na resposta do explante”.
4.7. Problemas que podem ocorrer na micropropagação
Entre os principais problemas que podem ocorrer no processo
de micropropagação, destacam-se:
 Contaminações
 Envelhecimento precoce
 Vitrificação
 Desordem fisiológica
 Variabilidade genética (variação somaclonal)
Normal
Figueira
Normal Fungo
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Bactéria: Ceratia spp.
4.8. Equipamentos Utilizados na Micropropagação
 autoclave
 equipamentos para tratamento de água
destilador; deionizador; osmose reversa;
 peagametro
 balanças
 câmara de fluxo laminar
 Micropipetas
 Estufas de esterilização e secagem;
 Agitador 
 Fonte de calor: forno microondas; “rabo quente”
 Sala de crescimento: prateleiras, lâmpadas e ar condicionado;
Equipamentos Utilizados na Micropropagação
Câmara de fluxo laminar
Requisitos para trabalhar no 
fluxo laminar:
 Higiene (pessoal e do equipamento); 
 Habilidade; 
 Concentração;
 Inoculação e Repicagem das das mudas;
Custo: superior a R$7.000,00 
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Autoclave
T =120 C 
P = 1 atm 
Time = 20 min 
 Esterilizar Esterilizar meio de cultura
Custo - R$ 8.000,00 a R$ 15.000,00 
Estufa para 
secagem de materiais
Câmara de
Crescimento
16 horas de Luz / dia
Sala de crescimento dos explantes
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Crescimento do explante – parte aérea Crescimento parte aérea
Raiz
Calo
Coqueiro
Temperatura na sala de crescimento dos explantes deve estar entre 22 e 27ºC
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Bananeira
Bananeira
Roseira
Tomateiro ENDURECIMENTO DAS MUDAS
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MUDAS PRONTAS MUDAS PRONTAS
MUDAS PRONTAS