Aula 06 - Clonagem molecular e vetores

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Prof. MSc. Gabriel Rezende
Biomédico
Clonagem Molecular
Desenvolvimento da Clonagem molecular
Processo	de	construção	de	moléculas
de	DNA
recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante.
Campo do conhecimento envolvido:
engenharia genética
manipulação gênica
clonagem gênica
tecnologia do DNA recombinante
modificação genética
Definição: Clonagem molecular
Isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas
Origem do termo: cada colônia bacteriana é um clone
Tecnologia do DNA recombinante
Produção de proteínas em larga escala Construção de bibliotecas genômicas e de cDNA
Clonagem molecular
1. Ligação do recombinante
fragmento de DNA
em um
plasmídeo
 DNA
INSERTO
VETOR
Clonagem molecular
2. Introdução do DNA recombinante em uma célula hospedeira compatível
Objetivos gerais da clonagem molecular
Preparação do DNA  vetor
Preparação do DNA ou cDNA inserto
Ligação do inserto no vetor
Seleção do sistema vetor/hospedeiro
Introdução de DNA recombinante no hospedeiro
Seleção de clones recombinantes
Identificação de clones recombinantes
Etapas da clonagem molecular
Enzimas de restrição
Capacidade de clivar DNA em regiões específicas
Palindrômicas
Preparação do vetor/ inserto
Ligação do inserto no vetor
Clonagem não dirigida
Construção do DNA recombinante
Clonagem dirigida (Duas enzimas)
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
XhoII
XhoII
Digestão e ligação
Vetor de clonagem
Clivagem com
endonuclease
de restrição
Ligação pela DNA ligase
Fragmento de DNA a ser clonado
DNA recombinante
Ligação do inserto no vetor
T4 DNA ligase
Ligação do inserto no vetor
Tipos de vetores
Plasmídeos
Propagação/ Expressão
Cosmídeos
Vetores derivados do fago lambda/ M13 Cromossomos artificiais derivados do fago P1 (PACs) Cromossomos artificiais bacterianos (BACs) Cromossomos artificiais de levedura (YACs) = 1 mb
Tipos de vetores
1 kilobase= 1.000 pares de base
Plasmídeo
Todo plasmídeo para ser um bom vetor deve ter:
Origem de replicação (Ori)
Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)
Resistência a antibiótico (Neo, Kan, etc.)
Promotor
Tipos de vetores
Plasmídeo
Tipos de vetores
Infecção E. coli  efiência 100%
Cosmídeos
Plasmídeos com um fragmento de DNA do fago λ
Transformação
Eletroporação
Microinjecção
Bombardeamento
Infecção viral
Métodos de introdução de DNA no hospedeiro
Transformação
Seleção de colônias
Resistência a antibiótico
Ampicilina
X
Seleção
Sequenciamento de DNA
PCR
Análise de produtos gênicos (reconhecimento imunológico)
Métodos de identificação de clones recombinantes
Identificação
Técnicas de screening
Questão 02. (PUC-SP) Em um experimento de Engenharia Genética, alguns pesquisadores introduziram em células bacterianas uma sequência de DNA ativo, responsável pela produção de insulina humana. A síntese desse hormônio proteico no interior das bactérias é:
A) possível, pois, excetuando-se a referida sequência de DNA, as bactérias apresentam os componentes necessários à síntese de proteínas.
B) possível, se, além do referido gene, forem introduzidos ribossomas, componentes celulares ausentes em bactérias.
C) impossível, pois o RNA mensageiro correspondente à insulina não seria transcrito.
D) impossível, pois as bactérias não apresentam enzimas capazes de promover as ligações peptídicas encontradas na insulina.
E) impossível, pois o DNA bacteriano seria destruído pelo DNA humano, e as células perderiam a atividade.
Técnicas de screening
A função de um vetor na engenharia genética do DNA recombinante é:
A cortar o DNA em vários fragmentos.
B Transportar o DNA recombinante em células hospedeiras.
C interligar fragmentos de DNA recombinante.
D fazer milhões de cópias de um segmento específico do DNA.
E selecionar os fragmentos de DNA por pares de bases (pb).
Técnicas de screening
 As enzimas de restrição são amplamente utilizadas nas pesquisas biotecnológicas, pois são capazes de cortar a molécula de DNA em pontos específicos, denominados palíndromos.
Um trecho de dupla fita de DNA correspondente a um palíndromo é:
A) TACTAC
ATGATG
B) AAACCC
TTTGGG
C) TTAAGG
AATTCC
D) GAATTC
CTTAAG
E) GAGAGA
CTCTCT
Técnicas de screening
A clonagem molecular é um processo complexo, extremamente importante para o avanço da biologia e para a produção de novos tratamentos e tecnologias. Disponível em: CAMPBELL, Neil A. et al. Biologia. Artmed Editora, 2014. Acessado em: 08 mar 23
Considerando a importância da clonagem molecular, avalie as afirmações a seguir. 
A clonagem molecular tem como foco a produção de cópias idênticas de um organismo vivo. 
A clonagem molecular envolve a inserção de um fragmento de DNA em uma célula hospedeira, onde é replicado para produzir mais cópias. 
 A técnica de clonagem molecular permite a criação de bancos de genes, que são coleções de fragmentos de DNA de um ou mais organismos. 
Os vetores utilizados em clonagem molecular são moléculas de RNA que podem se replicar de forma independente em uma célula hospedeira. É correto o que se afirma em: 
A) I, II e III. B) II, III e IV C) I, II, III e IV. D) IV. E) II e III.
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