Cap4 Fecundacao

Prévia do material em texto

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 121
F
121
Desejo e desejo e desejo
Sempre o desejo procriativo do mundo.
Saindo da obscuridade iguais opostos
avançam,
Sempre substância e aumento, sempre sexo,
Sempre uma tessitura de identidade, sempre
distinção,
Sempre uma criação de vida.
WALT WHITMAN (1855)
O objetivo final de todas as intrigas amoro-
sas, sejam elas cômicas ou trágicas, é na
realidade mais importante que todas as ou-
tras finalidades na vida humana.
Ele se volta para nada menos que a compo-
sição da próxima geração.
A SCHOPENHAUER
(CITADO POR C. DARWIN, 1871)
ERTILIZAÇÃO (FECUNDAÇÃO) é o processo pelo qual duas células sexuais
(gametas) se fundem para criar um novo indivíduo com potenciais genéticos
derivados dos dois genitores. A fecundação, portanto, realiza duas atividades
separadas: sexo (a combinação de genes derivados dos dois pais) e a reprodução
(criação de novos organismos). Assim, a primeira função da fecundação é a de trans-
mitir genes dos pais para a prole, e a segunda é a de iniciar no citoplasma do ovo
aquelas reações que permitem o desenvolvimento.
Embora os detalhes da fecundação variem de espécie para espécie, os eventos da
concepção consistem, em geral, de quatro atividades principais:
• Contato e reconhecimento entre espermatozóide e óvulo. Na maioria dos
casos, isso assegura que o espermatozóide e o óvulo sejam da mesma espécie.
• Regulação da entrada do espermatozóide para o interior do óvulo. Somente
um espermatozóide pode, em última análise, fecundar um óvulo. Isso é geral-
mente conseguido com a permissão de somente um espermatozóide entrar no
óvulo e a inibição da entrada de qualquer outro.
• Fusão do material genético do espermatozóide e do óvulo.
• Ativação do metabolismo do ovo para começar o desenvolvimento.
Estrutura dos gametas
Existe um diálogo complexo entre óvulo e espermatozóide. O óvulo ativa o metabolis-
mo do espermatozóide que é essencial para a fecundação, e o espermatozóide retorna
a mensagem ativando o metabolismo do óvulo necessário para o início do desenvol-
vimento. Porém, antes de investigar esses aspectos da fecundação, temos que consi-
derar as estruturas do espermatozóide e do óvulo – dois tipos de células especializadas
para a fertilização.
EspermatozóideEspermatozóideEspermatozóideEspermatozóideEspermatozóide
Foi somente no século XIX que o papel do espermatozóide na fertilização tornou-se
conhecido. Anton van Leeuwenhoek, o microbiologista holandês que co-descobriu o
espermatozóide em 1678, acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vi-
vendo em seu interior (daí o termo espermatozóides, significando “animais do esper-
ma”). Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reprodução do
organismo onde se encontravam, porém, posteriormente chegou a acreditar que cada
espermatozóide continha um embrião pré-formado. Leeuwenhoek (1685) escreveu que
Fertilização:
Iniciando um novo organismo 4
122 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
espermatozóides eram sementes (tanto sperma como sêmen significam “semente”), e
que a fêmea meramente proporcionava o solo nutriente no qual as sementes eram
plantadas. Sob esse aspecto, ele estava voltando a uma noção da procriação enunci-
ada por Aristóteles 2000 anos antes. Por mais que tentasse, Leeuwenhoek era continu-
amente desapontado em suas tentativas de achar um embrião pré-formado nos esper-
matozóides. Nicolas Hartsoeker, o outro co-descobridor do espermatozóide, dese-
nhou uma figura do que pretendia encontrar: um ser humano pré-formado
(“homúnculo”) dentro do espermatozóide (Figura 4.1). Essa crença de que o esperma-
tozóide continha um organismo embrionário inteiro, nunca recebeu muita aceitação,
porque implicava num enorme desperdício de vida em potencial. A maioria dos inves-
tigadores consideravam o espermatozóide como sem importância (Veja Pinto-Correia,
1997, para detalhes sobre essa extraordinária história). [fert1.html]
A primeira evidência sugerindo a importância do espermatozóide na reprodução
veio de uma série de experimentos realizados por Lazzaro Spallannzani em fins de 1700.
Spallanzani demonstrou que sêmen filtrado de rã, livre de espermatozóide, não fecun-
dava óvulos. Concluiu, porém, que o fluido viscoso retido pelo papel de filtro, e não o
espermatozóide, era o agente da fertilização. Ele acreditava, também, que os “animais
espermáticos” eram parasitas.
A combinação das melhores lentes de microscópio e da teoria celular, levaram a
uma reapreciação da função espermática. Em 1924, J. L. Prevost e J. B. Dumas afirma-
ram que os espermatozóides não eram parasitas, mas sim os agentes ativos da fertili-
zação. Notaram a existência universal de espermatozóides em machos sexualmente
maduros e sua ausência em indivíduos imaturos ou idosos. Essas observações,
acopladas à conhecida ausência de espermatozóides na mula estéril, os convenceram
que “existe uma íntima relação entre sua presença nos órgãos e a capacidade
fecundadora do animal”. Eles propuseram que o espermatozóide penetra o óvulo e
contribui materialmente para a geração seguinte.
 Essas assertivas não foram em geral levadas em consideração até a década de 1840,
quando A. von Kolliker descreveu a formação do espermatozóide a partir de células
contidas em testículos adultos. Kolliker ridicularizou a idéia que o sêmen poderia ser
normal e ainda assim tolerar a presença de um número enorme de parasitas. Mas ainda
assim, negou que haveria qualquer contato físico entre espermatozóide e óvulo. Acredi-
tava que o espermatozóide excitava o desenvolvimento do óvulo de maneira semelhante
aquela pela qual o ímã comunica sua presença ao ferro. Somente em 1876, Oscar Hertwig
e Hermann Fol, independentemente, demonstraram a entrada do espermatozóide no
óvulo e a união de seus núcleos. Hertwig procurou um organismo adequado para obser-
vações microscópicas detalhadas e descobriu que o ouriço-do-mar Mediterrâneo,
Toxopneustes lividus, era perfeito para isso. Não somente era freqüente na região e
sexualmente maduro a maior parte do ano, como seus óvulos eram abundantes e trans-
parentes, mesmo sob alto aumento. Após misturar espermatozóide e óvulo em suspen-
sões, Hertwig repetidas vezes observou o espermatozóide entrando no óvulo e viu a
união dos núcleos dessas células. Notou também que apenas um espermatozóide era
visto penetrar em cada óvulo e que todos os núcleos do embrião derivavam dos núcleos
fundidos por ocasião da fertilização. Fol fez observações semelhantes e detalhou o
mecanismo de penetração do espermatozóide. A fertilização estava finalmente reconhe-
cida como a união de espermatozóide e óvulo, e a união dos gametas do ouriço-do-mar
permanece como um dos exemplos de fertilização melhor estudado. [fert2.html]
Cada espermatozóide consiste de um núcleo haplóide, um sistema de propulsão
para movimentar o núcleo, e um saco de enzimas que permitem a entrada do núcleo no
óvulo. A maior parte do citoplasma do espermatozóide é eliminada durante o amadure-
cimento, deixando somente certas organelas modificadas para exercer a função esper-
mática (Figura 4.2). Durante o transcorrer do amadurecimento, o núcleo haplóide se
torna muito aerodinâmico e seu DNA altamente comprimido. Na parte frontal desse
núcleo haplóide comprimido está a vesícula acrossômica, derivada do aparelho de
Golgi, contendo enzimas que digerem proteínas e açúcares complexos; por isso, pode
Figura 4.1Figura 4.1Figura 4.1Figura 4.1Figura 4.1
A criança humana pré-formada no espermato-
zóide, conforme representada por Nicolas
Hartsoeker (1964).
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 123
Vesícula acrossômica
Membrana plasmática
Núcleo
Centríolo
Mitocôndrias
Axonema
Mitocôndrias
Aparelho
de Golgi
Núcleo
Vesícula
acrossômica
e grânulo
Flagelo
Centríolo
Flagelo
Centríolo
Golgi
remanescente
MicrotúbulosPorção
final
Cauda
Porção mediana
Pescoço
Cabeça do
espermatozóide
Mitocôndrias
ser considerado como uma vesícula secretória modificada. Essas enzimas armazena-
das são usadas para lisar os invólucros externos do óvulo. Em muitas espécies, tais
como os ouriços-do-mar, existe uma região de moléculas globulares de actina entre o
núcleo e a vesícula acrossômica. Essas proteínas são usadas para estender um pro-
cesso de forma semelhante a um dedo durante os estágios precoces da fertilização. Em
ouriços-do-mar e várias outras espécies, o reconhecimento mútuo entre espermatozói-
de e óvulo envolve moléculas desse processo acrossômico. Juntos, o acrossomo e o
núcleo constituem a cabeça do espermatozóide.
Os meios pelos quais o espermatozóide é impulsionado variam de acordo com o
modo pelo qual a espécie se adaptou às condições ambientais. Em algumas espécies
(como o nematelminto parasitário Ascaris), o espermatozóide viaja por movimentação
amebóide de extensões lamelipodiais da membrana celular. Na maioria das espécies,
porém, um espermatozóide é capaz de viajar por longas distâncias agitando o seu
flagelo. Os flagelos são estruturas complexas. A sua principal porção motora é chama-
da axonema. Um axonema é formado pelos microtúbulos que emanam do centríolo na
base do núcleo do espermatozóide (Figuras 4.2 e 4.3). O centro do axonema consiste
de dois túbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtúbulos.
Realmente, só um microtúbulo está completo, contendo 13 protofilamentos; o outro
tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4.3B). Um modelo tridimensi-
onal de um microtúbulo completo está apresentado na Figura 4.3C. Aqui vemos os 13
protofilamentos interligados; os quais consistem exclusivamente da proteína dimérica,
a tubulina.
Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo, outras proteínas também
são críticas para a função do flagelo. A força para a propulsão do espermatozóide é
proporcionada pela dineína, uma proteína apensa aos microtúbulos (Figura 4.3B). A
dineína hidrolisa moléculas de ATP e pode converter a energia química liberada em
Figura 4.2Figura 4.2Figura 4.2Figura 4.2Figura 4.2
A modificação de uma célula germinativa para formar um espermatozóide de ma-
mífero. O centríolo produz um longo flagelo na parte que virá a ser a extremidade
posterior do espermatozóide, e o aparelho de Golgi forma a vesícula acrossômica
na futura extremidade anterior. As mitocôndrias (pontos abertos) agrupam-se ao
redor do flagelo perto da base do núcleo haplóide e são incorporadas na parte
mediana do espermatozóide. O citoplasma remanescente é descartado e o núcleo
se condensa. O tamanho do espermatozóide maduro foi aumentado em relação às
outras figuras. (Segundo Clermont e Leblond, 1955.)
124 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
(A) (C)
(B)
MICROTÚBULO DUPLO
AXONEMA
Membrana plasmática
Trave radial
Cabeça da trave
Nexina
Subfibra A
Subfibra B
energia mecânica que propulsiona o espermatozóide. Essa energia pemite o
deslizamento ativo das duplas externas de microtúbulos, levando o flagelo a se
curvar (Ogawa et al., 1977; Asai, 1996). A importância da dineína pode ser avaliada
em indivíduos com a síndrome genética chamada de tríade de Kartagener. Esses
indivíduos não têm dineína em suas células ciliadas e flageladas, o que as torna
estruturas imóveis. Machos com essa doença são estéreis (espermatozóide imóvel),
susceptíveis à infeções brônquicas (cílios respiratórios imóveis), e têm 50 porcento
de probabilidade de ter o coração do lado direito de seu corpo (Afzelius, 1976).
Outra importante proteína flagelar parece ser a histona H1. Essa proteína é geral-
mente vista dentro do núcleo, onde dobra e aperta a cromatina em agregados. No
entanto, Multigner e colaboradores (1992), mostraram que essa mesma proteína
estabiliza os microtúbulos flagelados impedindo seu espalhamento.
O arranjo “9 + 2” dos microtúbulos com os braços de dineína foi conservado nos
axonemas em todo o reino eucarioto, sugerindo que é extremamente adequado na
transmissão de energia para a movimentação. A energia para mover o flagelo e assim
impulsionar o espermatozóide vem dos anéis de mitocôndrias localizadas na região
do pescoço do espermatozóide (veja Figura 4.2). Em muitas espécies (notavelmente
mamíferos) uma densa camada de fibras se interpôs entre a bainha mitocondrial e o
axonema. Essa camada fibrosa enrijece a cauda do espermatozóide. Como sua es-
pessura diminui na direção apical, as fibras provavelmente previnem que a cabeça
Figura 4.3
O aparelho de movimentação do espermato-
zóide. (A) Seção transversal do flagelo de um
espermatozóide mamífero, mostrando o
axonema central e as fibras externas. (B) Dia-
grama interpretativo do axonema, mostrando o
arranjo “9 + 2” dos microtúbulos e outros com-
ponentes flagelares. O diagrama esquemático
mostra a associação de protofilamentos de
tubulina em um microtúbulo duplo. A primeira
(“A”) porção do par duplo é um microtúbulo
normal compreendendo 13 protofilamentos. A
segunda (“B”) porção da dupla contém somen-
te 11 (ocasionalmente 10) protofilamentos. (C)
Um modelo tridimensional do microtúbulo “A”.
As subunidades α-tubulina e β-tubulina são
semelhantes, porém, não idênticas, e o
microtúbulo pode mudar de tamanho polimeri-
zando e despolimerizando subunidades de tu-
bulina em qualquer um dos lados. (A cortesia de
D. M. Phillips; B segundo De Robertis et al.,
1975, e Tilney et al., 1973; C de Amos e Klug,
1974, cortesia dos autores.)
Microtúbulo central
Braço interno de dineína
Braço externo de dineína
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 125
do espermatozóide balance abruptamente. Assim, o espermatozóide sofreu extensa
modificação para assegurar a passagem de seu núcleo para o óvulo.
Entretanto, a diferenciação do espermatozóide não se completa nos testículos.
Após sua expulsão para a luz dos túbulos seminíferos, os espermatozóides são arma-
zenados no epidídimo, onde adquirem a capacidade de se mover. Essa mobilidade é
conseguida através de mudanças no sistema gerador de ATP (possivelmente através
da modificação da dineína), assim como de alterações da membrana plasmática que
permitem que ela se torne mais fluida (Yanagimachi, 1994). Os espermatozóides libera-
dos durante a ejaculação podem se mover, mas ainda não têm a capacidade de se ligar
ao óvulo e fertilizá-lo. Esses estágios finais do amadurecimento espermático (chama-
do capacitação) não ocorrem antes do espermatozóide ter permanecido no interior do
trato reprodutivo feminino durante um certo tempo.
O óvuloO óvuloO óvuloO óvuloO óvulo
Todo o material necessário para o começo do crescimento e desenvolvimento tem
que estar armazenado no óvulo maduro. Enquanto o espermatozóide eliminou a
maior parte do seu citoplasma, o óvulo em desenvolvimento (chamado de oócito
antes de tornar-se haplóide) não somente conserva seu material, mas continua a
acumulá-lo ativamente. Sintetiza ou absorve proteínas, como a gema, que atuam
como reservatórios de alimento para o embrião em desenvolvimento. Assim, game-
tas femininos das aves são enormes células singulares que se tornaram entumecidas
pela acumulação de gema. Mesmo óvulos com gema relativamente esparsa são com-
parativamente grandes. O volume do óvulo do ouriço-do-mar é de aproximadamente
2 x 10-4 µm3, mais de 10.000 vezes aquele do espermatozóide. A representação do
óvulo do ouriço-do-mar e do espermatozóide na Figura 4.4 mostra seus tamanhos
relativos, assim como os vários componentes do óvulo maduro. Assim, enquanto o
espermatozóide e o óvulo têm componentes nucleares haplóides iguais, o óvulo tem
ainda um notável reservatório citoplasmático acumulado durante seu amadureci-
mento. Esse armazém citoplasmático inclui proteínas, RNAs, substâncias químicas
protetoras e fatores morfogenéticos:*
• Proteínas. Será longo o período a transcorrer antesdo embrião ser capaz de se
alimentar ou obter alimento de sua mãe. As células embrionárias precoces
precisam de um certo suprimento armazenável de energia e aminoácidos. Em
muitas espécies isso é conseguido pelo acúmulo de proteínas na gema do ovo.
Muitas proteínas da gema são sintetizadas em outros órgãos (fígado, corpo
gorduroso) e viajam através do sangue materno para o ovo.
• Ribossomos e tRNA. O embrião precoce precisa produzir muitas de suas própri-
as proteínas; em algumas espécies, ocorre um surto de síntese protéica pouco
após a fecundação. A síntese protéica é conseguida pelos ribossomos e tRNA,
preexistentes no óvulo. O óvulo em desenvolvimento tem mecanismos especi-
ais para sintetizar ribossomos, e certos oócitos de anfíbios produzem até 1012
ribossomos durante a prófase meiótica.
• RNA mensageiro. Na maioria dos organismos, as mensagens para proteínas
sintetizadas durante o desenvolvimento inicial já estão acondicionadas no
oócito. Estima-se que os óvulos do ouriço-do-mar contêm de 25.000 a 50.000
tipos diferentes de mRNA. Porém, esse mRNA permanece dormente até após a
fertilização (veja Capítulo 12).
• Fatores morfogenéticos. Essas moléculas dirigem a diferenciação celular
em certos tipos de células. Parecem estar localizadas em diferentes regiões
do óvulo e se segregam em células diferentes durante a clivagem (veja
Capítulo 13).
* Os conteúdos do óvulo variam muito de espécie para espécie. A síntese e a colocação desses
materiais será tratada no Capítulo 22, quando discutirmos a diferenciação das células germinativas.
126 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Espermatozóide
Camada gelatinosa
Envoltório vitelínico
Membrana
plasmática
Grânulo de gema
Grânulo cortical
Mitocôndria
Núcleo
• Substâncias químicas protetoras. O embrião não pode fugir de predadores ou
movimentar-se para um ambiente mais seguro, necessitando, por isso, estar
equipado para enfrentar esses fatores. Muitos óvulos contêm filtros ultravioleta
e enzimas de reparos de DNA que os protegem da luz solar; alguns óvulos
contêm moléculas que predadores potenciais acham desagradáveis; a gema de
óvulos de aves contém até mesmo anticorpos. [fert3.html]
Dentro desse enorme volume de citoplasma reside um grande núcleo. Em algumas
espécies (por exemplo, ouriços-do-mar), o núcleo já é haplóide no momento da fertili-
zação. Em outras espécies (incluindo muitos vermes e a maioria dos mamíferos), o
núcleo do óvulo ainda é diplóide, e o espermatozóide penetra antes das divisões
meióticas estarem completas. O estágio do núcleo do óvulo no momento da entrada
do espermatozóide está ilustrado na Figura 4.5.
Envolvendo o citoplasma está a membrana plasmática do óvulo. Essa mem-
brana deve regular o fluxo de certos íons durante a fertilização e deve ser capaz de
se fundir com a membrana plasmática do espermatozóide. Acima da membrana
plasmática está o envoltório vitelínico (Figura 4.6). O componente principal desse
envoltório forma uma esteira fibrosa sobre o óvulo. Essa esteira é suplementada
por extensões de glicoproteínas da membrana plasmática e pontes proteináceas
vitelínicas que aderem a esteira à membrana (Mozingo e Chandler, 1991). O
envoltório vitelínico é essencial para a ligação espécie-específica do espermato-
zóide. Nos mamíferos, o envoltório vitelínico é uma matriz extracelular separada e
grossa chamada zona pelúcida. O óvulo do mamífero é também rodeado por uma
camada de células, as células do cumulus (Figura 4.7). A camada cumular repre-
senta células foliculares ovarianas que estavam alimentando o óvulo quando da
sua liberação do ovário. O espermatozóide dos mamíferos tem que passar por
essas células para fertilizar o óvulo*.
Imediatamente abaixo da membrana plasmática do óvulo está uma fina casca (de
aproximadamente 5µm) de um citoplasma gel-símile chamado de córtex. O citoplasma
nessa região é mais duro que o citoplasma interno e contém altas concentrações de
moléculas globulares de actina. Durante a fertilização, essas moléculas polimerizam-se
*Em mamíferos, as coberturas extracelulares do óvulo estão divididas em duas regiões: A zona
pelúcida e o cumulus. O termo corona radiata refere-se àquelas células foliculares imediatamente
adjacentes à zona pelúcida; são as células mais internas do cumulus.
Figura 4.4Figura 4.4Figura 4.4Figura 4.4Figura 4.4
Estrutura do óvulo do ouriço-do-mar durante
a fertilização. (Segundo Epel, 1977.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 127
Microvilosidades Envoltório vitelínico
 Grânulo cortical(A) (B)
Os vermes anelídeos O nematelminto O verme nemerteano O anfioxo Cnidários
Dinophilus e Ascaris Cerebratulus Branchiostoma (e.g., anêmonas)
Sacocirrrus O mesozoário Dicyema O verme poliqueta Anfíbios Ouriços-do-mar
O verme poliqueta A esponja Grantia Chaetopterus Mamíferos (maioria)
Histriobdella O verme poliqueta O molusco Peixes
O platelminto Myzostoma Dentalium
Otomesostoma O verme concha O verme central
O onicóforo Nereis Pectinaria
Peripatopsis O molusco Spisula Muitos insetos
O verme equiuróide Urechis Estrela-do-mar
Cães e raposas
Vesícula
germinal
Pronúcleo
feminino
Corpos
polares
Oócito
primário
jovem
Oócito primário
totalmente
crescido
Primeira metáfase Segunda metáfase Meiose completa
para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. Microfilamentos
são necessários para a divisão celular, e são também usados para estender a superfície
do óvulo para o interior das microvilosidades, que ajudam a entrada do espermatozói-
de para dentro da célula (veja Figura 4.6; veja também a Figura 4.19). Ainda, dentro
desse córtex estão os grânulos corticais (veja Figuras 4.4 e 4.6). Essas estruturas
Figura 4.5Figura 4.5Figura 4.5Figura 4.5Figura 4.5
Estágios de maturação do óvulo no momento
da entrada do espermatozóide em diferentes
animais. (Segundo Austin, 1965.)
Figura 4.6Figura 4.6Figura 4.6Figura 4.6Figura 4.6
A superfície do óvulo do ouriço-do-mar. (A) Micrografia eletrônica de varredura de um óvulo
antes da fertilização. A membrana plasmática está exposta onde o envoltório vitelínico foi
retirado. (B) Microfotografia eletrônica de transmissão de um ovo não-fertilizado, mostrando
microvilosidades e a membrana plasmática, que estão estreitamente cobertas pelo envoltório
vitelínico. Um grânulo cortical aparece diretamente abaixo da membrana plasmática do óvulo.
(de Schroeder, 1979, cortesisa de T. E. Schroeder.)
128 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Cumulus
Óvulo
Zona
pelúcida
(A) (B)
ligadas à membrana são homólogas à vesícula acrossômica do espermatozóide, sendo
organelas derivadas do Golgi contendo enzimas proteolíticas. No entanto, enquanto
cada espermatozóide contém uma vesícula acrossômica, cada óvulo do ouriço-do-mar
contém aproximadamente 15.000 grânulos corticais. Além das enzimas digestivas, os
grânulos corticais também contêm mucopolissacarídeos, glicoproteínas adesivas e
proteína hialina. As enzimas e os mucopolissacarídeos atuam na prevenção da entra-
da de outros espermatozóides no óvulo após a entrada do primeiro, e as proteínas
hialinas e adesivas envolvem o embrião precoce providenciando apoio aos blastôme-
ros do estágio de clivagem.
Muitos tipos de óvulos têm uma geléia no exterior do seu envoltório vitelínico
(Figura 4.4). Essa rede de glicoproteínas pode ter numerosas funções, mas é principal-
mente usada para atrair ou ativar o espermatozóide. O óvulo, portanto, é uma célula
especializada para receber o espermatozóide iniciando o desenvolvimento.
Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância
Muitos organismos marinhos liberam seus gametas para o ambiente. Esse ambien-
te pode ser tão pequeno quanto uma poça de maré ou tão grande como o oceano.
Além disso, esse ambiente é compartilhado com outras espécies que podem libe-
rar suas células sexuais no mesmo período. Essesorganismos enfrentam dois
problemas: 1) Como podem espermatozóides e óvulos se encontrarem quando em
concentrações tão diluídas, e 2) que mecanismo inibe o espermatozóide da estrela-
do-mar tentar fertilizar os óvulos do ouriço-do-mar? Dois mecanismos principais
evoluíram para resolver essas dificuldades: atração e ativação espécie-específica
do espermatozóide.
Atração do EspermatozóideAtração do EspermatozóideAtração do EspermatozóideAtração do EspermatozóideAtração do Espermatozóide
A atração espécie-específica do espermatozóide (um tipo de quimiotaxia) foi docu-
mentada em numerosas espécies, incluindo cnidários, moluscos, equinodermos e
urocordados (Miller, 1985; Yoshida et al., 1993). Em 1978, Miller demonstrou que os
óvulos do cnidário Orthopyxis caliculata não somente secretam um fator quimiotáti-
co mas também regulam o período de sua liberação. Oócitos em desenvolvimento, em
Figura 4.7Figura 4.7Figura 4.7Figura 4.7Figura 4.7
Óvulos de hamster imediatamente antes da fecundação. (A) O ovo do hamster, ou óvulo, está
encaixado na zona pelúcida. Essa, por sua vez, está envolvida por células do cumulus. Uma célula
do corpo polar, produzida durante a meiose, também está dentro da zona pelúcida. (B) Em menor
aumento, um oócito de camundongo é mostrado em relação ao cumulus. Partículas de carbono
coloidal (tinta Nanquim) são excluídas pela matriz de hialuronidase. (Cortesia de R. Yanagimachi.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 129
(A) (B) (C) (D)
vários estágios de amadurecimento, foram fixados sobre lâminas microscópicas, e
espermatozóides foram adicionados a uma certa distância dos óvulos. Miller encon-
trou que quando o espermatozóide era adicionado a oócitos que ainda não haviam
completado sua segunda divisão meiótica, não havia atração de espermatozóide pelos
óvulos. Porém, após o término da segunda divisão meiótica e os óvulos estarem
prontos para ser fertilizados, o espermatozóide migrava em sua direção. Assim, esses
oócitos não controlam somente o tipo de espermatozóide que atraem, mas também o
momento em que o atraem.
Os mecanismos de quimiotaxia são diferentes em outras espécies (veja Metz, 1978;
Ward e Kopf, 1993). Uma dessas moléculas quimiotáticas, um peptídio de 14 aminoácidos
chamado resact foi isolado da geléia do óvulo do ouriço-do-mar Arbacia punctulata
(Ward et al., 1985). Resact difunde facilmente na água do mar e tem um profundo efeito
quando adicionado a uma suspensão de espermatozóide de Arbacia, mesmo em con-
centração muito baixa (Figura 4.8). Quando uma gota de água do mar, contendo esper-
matozóide de Arbacia, é colocada em uma lâmina de microscópio, o espermatozóide
geralmente nada em círculos de aproximadamente 50 µm de diâmetro. Se uma quantida-
de mínima de resact for introduzida na gota, em segundos o esperma migra para a
região da injeção e ali se congrega. À medida que o resact continua a difundir-se, mais
espermatozóide é recrutado para dentro do crescente agrupamento. Resact é específi-
co para A. punctulata e não atrai espermatozóide de outras espécies. Espermatozóide
de A. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers,
1985; Bentley et al., 1986) e pode nadar através de um gradiente crescente de concen-
tração desse composto até alcançar o óvulo.
Resact também age como um peptídio ativador de espermatozóide. Esses peptídios
(mais de 70 foram isolados de diferentes espécies de ouriços-do-mar) causam au-
mentos dramáticos e imediatos da motilidade espermática e do consumo de oxigênio
(Hardy et al., 1994). O receptor para resact é uma proteína transmembrana. Quando
ela liga o resact ao lado externo da célula, resact causa uma mudança conformacional
que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmático. Isso aumenta a
concentração de GMP cíclico do óvulo (Shimomura et al., 1986), que parece ativar a
ATPase da dineína estimulando a agitação da cauda no espermatozóide (Cook e
Babcock, 1993).
Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-MarAtivação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-MarAtivação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-MarAtivação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-MarAtivação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar
Uma segunda interação entre espermatozóide e óvulo envolve a ativação do esperma-
tozóide pela geléia do óvulo. Na maioria dos invertebrados marinhos, essa reação
acrossômica tem dois componentes: a fusão da vesícula acrossômica com a membrana
plasmática do espermatozóide (uma exocitose que resulta na liberação dos componen-
tes da vesícula acrossômica) e a extensão do processo acrossômico (Figura 4.9; Colwin
e Colwin, 1963). A reação acrossômica pode ser iniciada pela geléia do óvulo
solubilizada, pela geléia que envolve o óvulo, ou mesmo em certas espécies, pelo
contato com o próprio óvulo. Também pode ser ativada artificialmente pelo aumento
da concentração de cálcio na água do mar.
Figura 4.8Figura 4.8Figura 4.8Figura 4.8Figura 4.8
Quimiotaxia do espermatozóide em Arbacia.
Um nanolitro de uma solução 10-nM de
resact é injetado em uma gota de 20ml de
suspensão de espermatozóide. A posição da
micropipeta está indicada em (A). (A) Uma
fotografia de 1 segundo, mostrando esper-
matozóide nadando em círculos estreitos an-
tes da adição de resact. (B-D) Exposições
semelhantes de 1 segundo mostrando a mi-
gração do espermatozóide para o centro do
gradiente de resact 20, 40 e 90 segundos após
a injeção. (de Ward et al., 1985, cortesia de
V. D. Vacquier.)
130 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Membrana
acrossômica
Enzimas
acrossômicas
BindinaMembrana do
espermatozóide
Actina
globular Microfilamentos
de actina
Núcleos
Em ouriços-do-mar, o contato com a geléia do óvulo causa a exocitose da vesícula
acrossômica e a liberação de enzimas digestoras de proteínas que podem digerir um
caminho através da geléia de revestimento até a superfície do óvulo (Dan, 1967; Franklin,
1970; Levine et al., 1978). A seqüência desses eventos está esquematizada na Figura
4.9. A reação acrossômica é considerada ser iniciada por um oligossacarídeo ligado a
uma proteína na geléia do óvulo que permite a entrada de cálcio na cabeça do esperma-
tozóide (SeGall e Lennarz, 1979; Schackmann e Shapiro, 1981; Keller e Vacquier, 1994
a,b). A exocitose da vesícula acrossômica é causada por uma fusão, mediada pelo
cálcio, da membrana acrossômica com a membrana plasmática adjacente do esperma-
tozóide (Figuras 4.9 e 4.10). Essa exocitose permite que a vesícula acrossômica libere
seu conteúdo na cabeça do espermatozóide*.
A segunda parte da reação acrossômica envolve a extensão do processo
acrossômico (veja Figura 4.9). Essa protrusão se origina da polimerização de molécu-
las globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al., 1978). A exposição do
espermatozóide do ouriço-do-mar à geléia do óvulo também ocasiona a rápida utiliza-
ção de ATP e um aumento de 50% da respiração mitocondrial. A energia gerada é
usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro, 1985).
Os fatores da geléia do óvulo que iniciam a reação acrossômica em ouriços-do-mar
são muitas vezes muito específicos. Os espermatozóides dos ouriços-do-mar Arbacia
punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a geléia de
seus próprios óvulos. No entanto, o espermatozóide de S. purpuratus também pode
ser ativado pela geléia de Lytechinus variegatus (mas não de A. punctulata) (Summers
e Hylander, 1975). Portanto, a geléia do óvulo pode prover reconhecimento espécie-
específico em algumas espécies, mas não em outras.
* Tais reações exocitóticas podem ser vistas na liberação de insulina das células pancreáticas e
na liberação de neurotransmissores de terminais sinápticos. Em todos os casos, há uma fusão
mediada pelo cálcio entre a vesícula secretória e a membrana celular. Realmente, a semelhança entrea exocitose da vesícula acrossômica e a exocitose da vesícula sináptica pode ser bastante profunda.
Estudos recentes de reações acrossômicas em ouriços-do-mar e mamíferos (Florman et al., 1992;
González-Martínez et al., 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do
espermatozóide ligam essas moléculas, causam a despolarização da membrana que poderia abrir
canais de cálcio voltagem-dependentes de maneira reminescente à transmissão sináptica. As prote-
ínas que atracam os grânulos corticais à membrana celular também parecem ser homólogas àquelas
usadas na ponta do axônio (Bi et al., 1995).
Figura 4.9Figura 4.9Figura 4.9Figura 4.9Figura 4.9
Reação acrossômica em espermatozóide de
equinoderma. (A-C) A porção da membrana
acrossômica diretamente abaixo da membra-
na do espermatozóide funde-se com essa li-
berando o conteúdo da vesícula acrossômica.
(D) Enquanto as moléculas de actina se agre-
gam para produzir microfilamentos, o pro-
cesso acrossômico se estende para fora. Fo-
tografias reais da reação acrossômica no es-
permatozóide do ouriço-do-mar são mostra-
das em seguida. (Segundo Summers e Hylan-
der, 1974; fotografias por cortesia de G. L.
Decker e W. J. Lennarz.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 131
Membrana celular do
espermatozóide
Fusão entre a
membrana celular
do espermatozóide
e a membrana
acrossômica adjacente
Membrana
acrossômica
Núcleo
Centríolo
Ação à Distância: Gametas de Mamíferos
MUITO DIFÍCIL estudar as inte-
rações que podem estar ocorren-
do entre gametas de mamíferos
culas que permitem aos espermatozóides
nadar em direção ao óvulo e serem
ativados. Há muita controvérsia em rela-
ção ao deslocamento do espermatozóide
mamífero até o oviduto, a capacitação e
as reações de hiperativação que parecem
ser necessárias em algumas espécies para
ligá-lo ao óvulo, e a possibilidade que o
óvulo possa estar atraindo o espermato-
zóide por quimiotaxia.
Translocação e CapacitaçãoTranslocação e CapacitaçãoTranslocação e CapacitaçãoTranslocação e CapacitaçãoTranslocação e Capacitação
O trato reprodutivo de mamíferos femini-
nos exerce um papel muito ativo no pro-
cesso de fertilização. Enquanto a motili-
dade espermática é necessária para que o
espermatozóide do camundongo, uma vez
no oviduto encontre o ovo, a motilidade
espermática provavelmente é um fator de
menor importância para entrar no ovidu-
to. O espermatozóide é encontrado no
oviduto de camundongos, hamsters, co-
baia, vacas e seres humanos dentro de 30
minutos após a deposição, um período
“demasiadamente curto para ser atingido
até mesmo pelo espermatozóide mais olím-
pico, se confiar somente no poder de seus
flagelos” (Storey, 1995). É mais provável
que o espermatozóide seja transportado
para o oviduto por meio da atividade mus-
cular do útero.
Espermatozóide mamífero recém-eja-
culado é incapaz de sofrer a reação acros-
sômica sem ter residido por algum tempo
no trato reprodutivo feminino (Chang,
1951; Austin, 1952). Esse requisito para
capacitação varia de espécie para espécie
(Gwatkin, 1976) e pode ser mimetizado in
vitro pela incubação de espermatozóide
em meios de cultura de tecidos (contendo
íons de cálcio, bicarbonato e soroalbumi-
na) ou em fluido dos ovidutos. Os esper-
matozóides que não foram capacitados
são “segurados” na matriz cumular, não
atingindo assim o óvulo (Austin, 1960;
Corselli e Talbot, 1987).
As alterações moleculares que expli-
cam a capacitação ainda são desconheci-
das (veja Yanigamachi, 1994), mas exis-
tem quatro conjuntos de alteraçõess mo-
leculares que podem ser importantes. Pri-
meiro, a membrana da célula espermática
É
antes do contato espermatozóide-óvulo.
Um motivo óbvio para isso é que a fertili-
zação ocorre dentro dos ovidutos femini-
nos. Embora seja relativamente fácil
mimetizar as condições rodeando a fertili-
zação do ouriço-do-mar (usando água do
mar natural ou artificial), ainda não conhe-
cemos os componentes dos vários ambi-
entes naturais encontrados pelo esperma-
tozóide dos mamíferos em sua viajem ao
encontro do óvulo. Um segundo motivo
para essa dificuldade é que a população
de espermatozóide ejaculada para o inte-
rior da fêmea é provavelmente muito he-
terogênea, contendo espermatozóides em
diferentes estágios de amadurecimento.
Dos 280 x 106 espermatozóides humanos
normalmente ejaculados para o interior da
vagina, somente 200 atingem a região
ampolar do oviduto, onde ocorre a fecun-
dação (Ralt et al., 1991). Como menos de 1
em 10.000 espermatozóides chegam perto
do óvulo, é difícil analisar aquelas molé-
Figura 4.10Figura 4.10Figura 4.10Figura 4.10Figura 4.10
Reação acrossômica em espermatozóide de hamster. (A) Micrografia de transmissão eletrônica
de um espermatozóide de hamster passando pela reação acrossômica. A membrana acrossômica
pode ser vista formando vesículas. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrônicas
mostrando a fusão de membranas acrossômica e celular na cabeça do espermatozóide. (A de
Meizel, 1948, cortesia de S. Meizel; B, segundo Yanagimachi e Noda, 1970.)
Informações adicionais Especulações&
132 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
pode se alterar, mudando sua composi-
ção de lipídios. A concentração de
colesterol no espermatozóide é diminuída
durante a capacitação do espermatozóide
em várias espécies (Davis, 1981), e duas
proteínas encontradas tanto no soro como
no trato reprodutivo feminino (albumina
e proteína 1 de transferência lipídica), fo-
ram verificadas remover colesterol do es-
permatozóide humano (Langlais et al.,
1988; Ravnik et al., 1992). Em segundo lu-
gar, certas proteínas ou carboidratos na
superfície do espermaozóide são perdidos
durante a capacitação (Poirier e Jackson,
1981; Lopez et al., 1985; Wilson e Oliphant,
1987). É possível que essas entidades per-
didas durante a capacitação estivessem
bloqueando locais de reconhecimento
para as proteínas que se ligam à zona
pelúcida. Em terceiro lugar, certas proteí-
nas são fosforiladas por um caminho
cAMP-dependente. O AMP cíclico pode
induzir artificialmente a competência atra-
vés da proteína quinase cAMP-depen-
dente (PKA), que é necessária tanto para
a aquisição de competência como para a
fosforilação de tirosino-quinases. É pos-
sível que o trato reprodutivo feminino es-
timule a adenilciclase do espermatozóide
a produzir mais cAMP e que esse ative a
proteína quinase que inicia a cascata de
fosforilação, terminando na fosforilação
e ativação das proteínas envolvidas na
ligação do espermatozóide à zona pelúcida
e mediando a exocitose da vesícula acros-
sômica (Leyton e Saling, 1989a; Visconti
et al., 1995a,b). Em quarto lugar, o poten-
cial da membrana do espermatozóide é
dramaticamente reduzido (de cerca de –
30 para –50 mV; Zeng et al., 1995). Porém,
ainda é incerto se esses eventos são in-
dependentes um do outro e até que pon-
to cada um deles produz capacitação do
espermatozóide.
Hiperativação e QuimiotaxiaHiperativação e QuimiotaxiaHiperativação e QuimiotaxiaHiperativação e QuimiotaxiaHiperativação e Quimiotaxia
As diferentes regiões do trato reproduti-
vo feminino podem secretar fatores dife-
rentes, regionalmente específicos. Esses
fatores podem influenciar a motilidade
espermática assim como a capacitação. Por
exemplo, quando os espermatozóides de
certos mamíferos (especialmente hams-
ters, cobaias e algumas variedades de ca-
mundongos) passam do útero para os
ovidutos, ficam “hiperativados”, passan-
do a nadar com maior velocidade e geran-
do maior força. Suarez e colaboradores
(1991) mostraram que enquanto essas re-
ações não são conducentes a viagens em
fluidos de baixa viscosidade, parecem ser
muito adequadas para o movimento line-
ar do espermatozóide no fluido viscoso
que poderá encontrar no oviduto.
Além de aumentar a atividade do es-
permatozóide, fatores solúveis no ovidutotambém podem prover o componente dire-
cional do movimento do espermatozóide.
Especulou-se que o óvulo (ou, mais pro-
vavelmente, o folículo ovariano no qual o
óvulo se desenvolve) pode estar secretan-
do substâncias quimiotáticas que poderi-
am atrair o espermatozóide em direção ao
óvulo durante os últimos estágios da mi-
gração (veja Hunter, 1989). Ralt e colabora-
dores (1991) testaram essa hipótese usan-
do fluido de folículos humanos cujos óvu-
los estavam sendo usados para fertiliza-
ção in vitro. Realizando um experimento
semelhante aquele descrito anteriormente
com ouriços-do-mar, os autores microinje-
taram uma gota do fluido folicular em uma
gota maior da suspensão de espermato-
zóides. Feito isso, observaram que parte
do espermatozóide mudou sua direção de
movimentação, passando a migrar ao en-
contro da fonte de fluido folicular. A
microinjeção de outras soluções não teve
esse efeito. Esses estudos não eliminam a
possibilidade de que o efeito fosse devido
a uma estimulação geral do movimento ou
do metabolismo do espermatozóide. No en-
tanto, essas investigações revelaram uma
correlação fascinante: o fluido de somente
a metade dos folículos testados mostrou
um efeito quimiotático, e em quase todos
os casos, o óvulo só era fertilizável se, e
somente se, o fluido demonstrasse habili-
dade quimiotática (P < 0,0001). É possível,
portanto, que tal como certos óvulos de
invertebrados, o óvulo humano secrete um
fator quimiotático somente quando estiver
capacitado para a fertilização.
Deve-se notar que “o prêmio da corri-
da não vai sempre para o mais rápido”. Em-
bora algum espermatozóide possa alcan-
çar a região ampolar do oviduto (onde ocor-
re a fertilização) dentro de meia hora após a
relação sexual, aquele espermatozóide pode
ter poucas chances de fertilizar o óvulo.
Wilcox e colaboradores (1995) acharam que
quase todas os engravidamentos humanos
resultam de relacionamento sexual duran-
te um período de seis dias, terminando no
dia da ovulação. Isso significa que o es-
permatozóide fertilizador poderia demorar
até seis dias para fazer a jornada. Eisenbach
(1995) propôs a hipótese pela qual a
capacitação é um acontecimento transitó-
rio, e que é dada ao espermatozóide uma
janela de competência relativamente bre-
ve, durante a qual pode ter sucesso na fer-
tilização do óvulo. Quando os espermato-
zóides atingem a ampola, adquirem com-
petência, mas se aí ficam por um período
demasiadamente longo, perdem-na. O es-
permatozóide pode também ter diferentes
prazos de sobrevivência, dependendo da
sua localização dentro do trato reproduti-
vo; isso pode permitir que algum esperma-
tozóide chegue mais tarde, porém com uma
melhor probabilidade de sucesso do que
aquele que chegou dias antes.
Reconhecimento do óvulo e espermatozóide:
Contato de gametas
Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-MarReconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-MarReconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-MarReconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-MarReconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-Mar
Uma vez que o espermatozóide do ouriço-do-mar tiver penetrado na geléia do óvulo,
o processo acrossômico do espermatozóide faz contato com o envoltório vitelínico do
óvulo (Figura 4.11). Um importante passo do reconhecimento espécie-específico ocorre
nesse ponto. A proteína acrossômica mediando esse reconhecimento é chamada bin-
dina. Em 1977, Vacquier e colaboradores isolaram essa proteína insolúvel, de 30.500-
Da, do acrossomo de Strongylocentrotus purpuratus. Essa proteína é capaz de se
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 133
(A) (B)
S. purpuratus S. fransciscanus
S
. 
p
u
rp
u
ra
tu
s
S.
 f
ra
ns
ci
sc
an
us
Aglutinação
Partículas
de bindina
O
V
O
S
 D
E
S
G
E
L
E
IF
IC
A
D
O
S
Aglutinação Sem aglutinação
Sem aglutinação
BINDINA DO ESPERMATOZÓIDE
Óvulos
ligar a óvulos desgeleificados de S. purpuratus (Figura 4.12; Vacquier e Moy, 1977).
Ainda mais, sua interação com óvulos é relativamente espécie-específica (Glabe e
Vacquier, 1977; Glabe e Lennarz, 1979); a bindina isolada dos acrossomos de S.
Purpurata aglutina seus próprios óvulos desgeleificados, mas não aqueles de Arbacia
puctulata. Usando técnicas imunológicas, Moy e Vacquier (1979) demonstraram que
a bindina está especificamente localizada no processo acrossômico, exatamente onde
deve estar para o reconhecimento espermatozóide-óvulo (Figura 4.13).
Estudos bioquímicos mostraram que as bindinas de espécies proximamente relaci-
onadas de ouriço-do-mar são mesmo diferentes. Esse achado implica na existência de
Figura 4.11Figura 4.11Figura 4.11Figura 4.11Figura 4.11
Contato do processo acrossômico do espermatozóide do ouriço-do-mar com uma
microvilosidade do óvulo. (de Epel, 1977, cortesia de F. D. Collins e D. Epel.)
Figura 4.12Figura 4.12Figura 4.12Figura 4.12Figura 4.12
Aglutinação espécie-específica por bindi-
na de óvulos desgeleificados . (A) aglutina-
ção promovida pela adição de 212 µg de
bindina em um recipiente plástico conten-
do 0.25 ml de suspensão a 2% (volume/
volume) de óvulos. Após 2-5 min de agita-
ção branda, os recipientes foram fotografa-
dos. Cada bindina somente se ligou a seus
próprios óvulos. (B) Fotomicrografia de
fluorescência de óvulos de S. purpuratus
ligados entre si por partículas de bindina
de S. purpuratus marcadas por fluorescên-
cia. As partículas de bindina estavam inva-
riavelmente nos lugares onde dois óvulos
se encontravam. (A baseado em fotografias
de Glabe e Vacquier, 1977; B de Glabe e
Lennarz, 1979, cortesia dos autores.)
134 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
receptores espécie-específicos de bindina no envoltório vitelínico. Tais receptores
também foram sugeridos pelos experimentos de Vacquier e Payne (1973), que satura-
ram óvulos de ouriço-do-mar com espermatozóide. Como pode ser visto na Figura 4.14
A, a ligação do espermatozóide não se dá sobre a superfície inteira do óvulo. Mesmo
Figura 4.13Figura 4.13Figura 4.13Figura 4.13Figura 4.13
Localização de bindina no processo acrossômico. (A) a técnica de localização
imunoquímica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina está exposta.
Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a proteína bindina, e esses anticorpos
foram incubados com espermatozóide que tinha sofrido a reação acrossômica. Quando a
bindina estava presente, os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermato-
zóide. Depois de todo anticorpo não-ligado ser removido por lavagem, o espermatozói-
de foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho.
Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente à enzima peroxidase.
Dessa maneira, moléculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia
bindina. Peroxidase catalisa a formação de um precipitado escuro de diaminobenzidina
(DAB) e água oxigenada. O precipitado só se forma onde há bindina. (B) Localização de
bindina no processo acrossômico após a reação acrossômica (33.200x). (C) Localização
de bindina no processo acrossômico na junção do espermatozóide com o óvulo. (B e C de
Moy e Vacquier, 1979, cortesia de V. D. Vacquier.)
FigurFigurFigurFigurFiguraaaaa 4.14 4.14 4.14 4.14 4.14
Receptores de bindina no óvulo. (A) Mi-
crografia eletrônica de varredura do esper-
matozóide do ouriço-do-mar ligado ao
envoltório vitelínico de um óvulo. (B) liga-
ção do espermatozóide de S. purpuratus a
partículas de polistireno que foram cober-
tas com a proteína purificada do receptor de
bindina. (A cortesia de C. Glabe, L. Perez e
W. J. Lennarz; B de Foltz et al., 1993.)
(A) DAB + H2O2
Imunoglobulina
porcina anti-coelho
conjugada com a
enzima peroxidase
Precipitado
denso
Bindina
Anti-bindina
de coelho
Processo acrossômico
(B) (C)
Precipitado DAB
Membrana
vitelínicado óvulo Acrossomo
Núcleo
Espermatozóide
(B)
(A)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 135
Equivalentes da zona pelúcida por µl
L
ig
aç
ão
 d
o 
es
pe
rm
at
oz
ói
de
 (
%
)
ZP3 sem
carboidratos
(A) (B)
a níveis saturantes de espermatozóide (aproximadamente 1500), parece haver espaço
no óvulo para mais cabeças de espermatozóide, indicando haver um número limitante
de locais ligantes de espermatozóide. Um grande complexo de glicoproteínas dos
envoltórios vitelínicos de óvulos de ouriço-do-mar foi isolado e mostrou ligar bindina
radioativa de maneira espécie-específica (Glabe e Vacquier, 1978; Rossignol et al.,
1984). Essa glicoproteína é também capaz de competir com óvulos pelo espermatozói-
de da mesma espécie. Isto é, se espermatozóide de S. purpuratus é misturado com o
receptor de bindina de envoltórios vitelínicos de S. purpuratus, o espermatozóide se
liga a ele e não irá fertilizar os óvulos. O receptor isolado de S. purpuratus, porém, não
irá interferir com a fertilização de outros ouriços-do-mar relacionados. Esse receptor
de bindina é uma glicoproteína transmembrana com quase 1300 aminoácidos (Foltz et
al., 1993). A região ligante de bindina se estende para o espaço extracelular e provavel-
mente se torna um componente do envoltório vitelínico. Esses receptores de bindina
se agregam em complexos, e centenas deles são provavelmente necessários para
amarrar o espermatozóide no óvulo (Figura 4.14B). Assim, reconhecimento espécie-
específico dos gametas do ouriço-do-mar ocorrem ao nível da atração, ativação e
adesão do espermatozóide à superficie do óvulo. [fert4.html]
Ligação de Gametas e Reconhecimento em MamíferosLigação de Gametas e Reconhecimento em MamíferosLigação de Gametas e Reconhecimento em MamíferosLigação de Gametas e Reconhecimento em MamíferosLigação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos
ZP3: A PROTEÍNA LIGANTE DA ZONA PELÚCIDA DO CAMUNDONGO. A zona
pelúcida tem nos mamíferos um papel análogo aquele do envoltório vitelínico nos
invertebrados. Essa matriz de glicoproteínas é sintetizada e secretada pelo oócito em
crescimento, e tem dois papéis importantes durante a fertilização: liga o espermatozóide, e
inicia a reação acrossômica após essa ligação (Saling et al., 1979; Florman e Storey, 1982;
Cherr et al., 1986). A ligação de espermatozóide à zona é relativamente, porém não absolu-
tamente, espécie-específica (especificidade por espécie não deveria ser um grande proble-
ma quando a fertilização ocorre internamente), e a ligação do espermatozóide do camun-
dongo à zona dessa espécie pode ser inibida pela incubação prévia de espermatozóide
com glicoproteínas da zona. Bleil e Wassarman (1980, 1986, 1988) isolaram da zona pelúcida
do camundongo uma glicoproteína ZP3, de 83-kDa, que é o competidor ativo nesse ensaio
de inibição. As outras duas proteínas da zona, ZP1 e ZP2, não puderam competir pela
ligação do espermatozóide (Figura 4.15). Ainda mais, ZP3 radiativamente marcada ligou-se
às cabeças do espermatozóide do camundongo que tinha acrossomos intactos. Assim,
ZP3 é a proteína específica na zona pelúcida à qual se liga o espermatozóide do camundon-
go. ZP3 também inicia a reação acrossômica após os espermatozóides terem se ligado a ela.
O espermatozóide do camundongo pode, dessa forma, concentrar suas enzimas
proteolíticas diretamente no ponto de fixação à zona pelúcida.
Figura 4.15Figura 4.15Figura 4.15Figura 4.15Figura 4.15
Ligação do espermatozóide à zona pelúcida.
(A) ensaio de inibição mostrando a dimi-
nuição específica da ligação do esperma-
tozóide do camundongo às zonas pelúcidas
quando espermatozóide e zonas são incu-
bados com aumentos crescentes da porção
carboidrato da glicoproteína ZP3. A im-
portância da porção carboidrato de ZP3 é
também, indicada por essa figura. (B) Li-
gação de ZP3 marcada radioativamente a
espermatozóide capacitado do camundon-
go. (A segundo Bleil e Wassarman, 1980, e
Florman e Wassarman, 1985; B de Bleil e
Wassarman, 1986, cortesia dos autores.)
136 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Zona pelúcida
Óvulo
Espermatozóide
ZP3 (proteína ligante de
espermatozóide) na Zona
Proteínas candidatas
a ligação à zona no
acrossomo
N-acetil
glicosamina
Galactose
Membrana
celular do
espermatozóide
GALACTOSILTRANSFERASE SP 56
(proteína
periférica da
membrana)
P95
Ligação
cruzada ativa
proteínas G
Ativação
de
tirosinoquinase
Ativação de síntese
de IP
3
 na
membrana
acrossômica
Regulação de
canais iônicos
ou síntese
de IP
3
Reação acrossômica
Liberação de Ca++
ZP3
O mecanismo molecular pelo qual a zona pelúcida e o espermatozóide do mamí-
fero se reconhecem mutuamente está sendo estudado. A hipótese corrente sobre
a ligação dos gametas de mamíferos postula um conjunto de proteínas do esper-
matozóide capazes de reconhecer regiões específicas de carboidratos na zona ZP3
do óvulo (Florman et al., 1984; Florman e Wassarman, 1985; Wassarman, 1987;
Saling, 1989). A remoção desses grupos de carboidratos ligados por treonina ou
serina suprime a habilidade de ligar o espermatozóide.
PROTEÍNAS DE ADESÃO ESPERMATOZÓIDE-ZONA. O espermatozóide do camun-
dongo não “fura” para chegar ao interior da zona. Na realidade, os espermatozóides se
aproximam paralelamente ao plano da superfície da zona e aí são ativamente fixados
(Baltz et al., 1988). Como é a zona capaz de ligar e conservar esses espermatozóides
contorcedores? Parece que ZP3 pode ligar-se a pelo menos três proteínas adesivas na
membrana do espermatozóide, e milhares desses sítios podem ser necessários para
prevenir que essas duas células se separem. Há uma controvérsia significativa sobre a
questão de se todas as três proteínas no espermatozóide são necessárias para ligação à
zona, e quais as suas respectivas funções (veja Figura 4.16: Snell e White, 1996). Parece
que cada uma delas tem papéis específicos, mas um tanto sobrepostos na adesão do
espermatozóide e na reação acrossômica. Essas três proteínas são: a proteína ligante de
galactose, a galactosil-transferase e a quinase do receptor da zona.
A PROTEÍNA LIGANTE DE GALACTOSE 56-KDA (SP56). Uma proteína crítica
ligante da zona do espermatozóide parece ser a proteína que especificamente se liga
aos resíduos de galactose de ZP3. Bleil e Wassarman (1980) mostraram que um dos
carboidratos críticos da glicoproteína ZP3 é o grupo galactose terminal. Se essa galactose
terminal for removida ou modificada quimicamente, a atividade ligante de espermatozói-
de é perdida. Esses pesquisadores posteriormente isolaram essa proteína, ligando
Figura 4.16Figura 4.16Figura 4.16Figura 4.16Figura 4.16
Ligação de espermatozóide à zona pelúcida do
camundongo: alguns possíveis participantes.
A proteína ZP3 da zona pelúcida liga esper-
matozóide. Há evidência da ligação de três pro-
teínas espermáticas – a galactosiltransferase
da superfície, sp56 e P95 – à ZP3. Essa liga-
ção induz a reação acrossômica através da ati-
vação do fluxo de cálcio. Os detalhes ainda
terão que ser elucidados. (Segundo Snell e
White, 1996.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 137
ZP3 à uma coluna de afinidade, passando em seguida, por essa coluna, as proteínas
isoladas da membrana de espermatozóides de camundongo (Bleil e Wassarman,
1990). A maioria das proteínas passou pela coluna; porém um peptídio de 56-
kDa, ligou-se às partículas recobertas com ZP3, mas não se ligou a partículas
recobertas com ZP2 em experimento semelhante. Essa proteína foi encontrada
exposta na membrana espermática; ligava-se a resíduos de galactose, sugerin-
do fortemente ser um receptor de espermatozóide ligante à entidade terminal de
galactose na glicoproteína ZP3. A proteína sp56 liga-se à zona pelúcida de
ovos não-fertilizados (porém não dos fertilizados), bloqueando a ligação es-
permatozóide-óvulo (Figura 4.17; Bookbinderet al., 1995).
GALCTOSILTRANSFERASE. A Segunda proteína do espermatozóide que parece
ser importante para ligação espermatozóides-zona é a enzima da membrana celular do
espermatozóide, glicosiltransferase. No laboratório de Shur foi demonstrado que esse
receptor para a zona é uma enzima que reconhece o açúcar N-acetilglicosamina na ZP3
(Shur e Hall, 1982a,b; Lopez et al., 1985; Miller et al., 1992). Essa enzima, N-
acetilglicosamina:galactosiltransferase, está embebida na membrana plasmática do
espermatozóide, diretamentre acima do acrossomo, com seu sítio ativo apontando
para fora. A função enzimática dessa enzima de 60-kDa seria a de catalisar a adição de
um açúcar galactose (de UDP-galactose) para uma cadeia de carboidrato terminando
em um açúcar N-acetilglicosamina (veja Capítulo 3). No entanto, não há resíduos de
UDP-galactose no trato reprodutivo feminino. Embora a enzima possa se ligar aos
resíduos de proteínas da zona, exatamente como qualquer enzima se ligaria a um
substrato, ela não pode catalisar a reação porque o segundo reagente está faltando.
Portanto, as enzimas (no espermatozóide) ficam ligadas a seus substratos (na zona).
Se essa hipótese estiver correta, poderíamos esperar que a ligação óvulo-es-
permatozóide seria inibida ou pela inibição da enzima, ou pela adição do segundo
reagente, UDP-galactose. Isso é exatamente o que Shur e colaboradores acharam
ser o caso. A ligação espermatozóide-zona foi bloqueada por: (1) adição de UDP-
galactose, (2) remoção de resíduos de N-acetilglicosamina de ZP3, (3) adição de
anticorpos que bloqueiam a atividade da galactosiltransferase, e (4) colocação de
um excesso de galactosiltransferase no meio (a enzima em excesso iria ligar-se à zona
e inibir o espermatozóide de se ligar) (Lopez et al., 1985; Shur e Neely, 1988). Além
disso, membranas de espermatozóide de camundongo irão transferir um açúcar de
UDP-galactose especificamente para ZP3 (Miller et al., 1992). Assim, a galactosil-
transferase da superfície do espermatozóide parece reconhecer um grupo carboidrato
na proteína ZP3 da zona pelúcida do camundongo. A agregação dessas
galactosiltransferases ocasiona a ativação de uma proteína G que pode ser impor-
tante na iniciação da reação acrossômica (Gong et al., 1995).
Figura 4.17Figura 4.17Figura 4.17Figura 4.17Figura 4.17
Sp56 purificada liga-se à zona pelúcida e ini-
be a ligação de espermatozóide a óvulos de
camundongo. (A) Ligação de sp56 à zona
pelúcida de ovos não-fertilizados. A pista 1 é
o resultado da lise de ovos não-fertilizados,
fazendo migrar as proteínas extraídas em um
gel, transferindo o gel, e sondando para a pre-
sença de sp56 com anticorpo marcado. Não
se vê sp56. A pista 2 mostra o resultado po-
sitivo obtido quando o ovo não-fertilizado é
pré-incubado com sp56, indicando que sp56
se liga aos óvulos. A pista 3 mostra os resul-
tados negativos obtidos quando sp56 foi adi-
cionada a embriões bicelulares. A pista 4 mos-
tra o controle quando sp56 purificada é feita
migrar no gel. (O anticorpo reconhece a for-
ma não-reduzida de sp56, que migra em 40
kDa). (B) Espermatozóide ligando-se normal-
mente a ovos não-fertilizados de camundon-
go (aproximadamente 76 espermatozóides
por óvulo). Os embriões bicelulares (aqui
marcados por asteriscos) são controles inter-
nos mostrando não ocorrer ligação. (C ) Na
presença de sp56, o espermatozóide foi im-
pedido de se ligar à zona. (de Bookbinder et
al., 1995; cortesia de J.D. Bleil.)
138 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
ZP3
ZP1
ZP2
Resíduos de
carboidratos
RECEPTOR DE QUINASE DA ZONA (ZRK). Uma terceira proteína espermática
que se liga à zona pelúcida do camundongo parece ser uma proteína transmembra-
na de 95-kDa com dois sítios funcionais. O sítio extracelular liga especificamente
ZP3, enquanto o sítio intracelular tem atividade enzimática de tirosina quinase
(Leyton et al., 1992). Essa atividade é estimulada quando a proteína liga ZP3. Isso
implica que a proteína de 95-kDa é uma tirosina quinase de receptor, e que pode
iniciar a reação acrossômica através da fosforilação das suas proteínas alvo (veja
Capítulo 3). O espermatozóide humano tem uma proteína semelhante, e a ZP3 hu-
mana estimula a atividade da quinase. Além disso, peptídios sintéticos que
mimetizam o domínio extracelular (que liga ZP3) dessa proteína, inibem a ligação
do espermatozóide à zona pelúcida humana, sugerindo possível uso como
contraceptivo (Burks et al., 1995).
INDUÇÃO DA REAÇÃO ACROSSÔMICA EM MAMÍFEROS POR ZP3. Uma vez
que o espermatozóide capacitado ligou-se à zona pelúcida, como ocorre a reação
acrossômica nos mamíferos? A reação é induzida pela porção protéica de ZP3
(Endo et al., 1987; Leyton e Saling,1989a), e ZP3 parece atuar perfazendo ligação
cruzada com seus receptores na membrana espermática. Esse tipo de ligação abre
os canais de cálcio, aumentando a concentração do íon no espermatozóide (Leyton
e Saling, 1992b). O mecanismo pelo qual age o ZP3 e a subseqüente exocitose do
acrossomo permanece controversa, mas pode envolver a trajetória IP
3
 (Florman,
1994; Suarez e Dai, 1995). [fert5.html]
LIGAÇÃO SECUNDÁRIA DO ESPERMATOZÓIDE À ZONA PELÚCIDA. Durante
a reação acrossômica, a parte anterior da membrana plasmática do espermatozóide é
solta (veja Figura 4.10). É ali que estão localizadas as proteínas ligantes de ZP3 e,
ainda assim, o espermatozóide deve permanecer ligado à zona para abrir, por lise, um
caminho através dela. Em camundongos, parece que uma ligação secundária à zona
é conseguida por proteínas na membrana acrossômica interna que se ligam especi-
ficamente a ZP2 (Bleil et al., 1988). Enquanto espermatozóide com acrossomo intacto
não irá se ligar à ZP2 glicoproteína, o espermatozóide cujo acrossomo reagiu o fará.
Além disso, anticorpos contra a proteína ZP2 não irão impedir a ligação do esper-
matozóide com acrossomo intacto à zona, mas irão inibir a fixação do espermatozóide
que já tenha reagido. A estrutura da zona consiste de unidades repetitivas de ZP3 e
ZP2, ocasionalmente ainda ligadas por ZP1 (Figura 4.18). Parece que os espermato-
zóides com acrossomo que reagiram, transferem sua ligação com ZP3 para as molé-
culas adjacentes de ZP2. Após a entrada de espermatozóide de camundongo no óvulo,
os grânulos corticais do ovo liberam seu conteúdo. Uma das proteínas liberadas é a
protease que especificamente altera ZP2 (Moller e Wassarman, 1989). Isso inibe ou-
tros espermatozóides, cujo acrossomo já reagiu, de mover-se mais para perto do óvulo.
Não é conhecido quais das proteínas do espermatozóide do camundongo se
ligam à ZP2. No espermatozóide porcino, ligação secundária à zona parece ser medi-
ada por proacrosina. Proacrosina torna-se a protease acrosina, há muito tempo co-
nhecida por estar envolvida na digestão da zona pelúcida. No entanto, proacrosina
é também uma proteína ligante da fucose que mantém a conexão entre espermatozói-
de que reagiu com acrosina e a zona pelúcida (Jones et al., 1988). É possível que a
proacrosina se ligue à zona, sendo depois convertida na enzima ativa que digere
localmente a zona pelúcida.
Na cobaia, ligação secundária à zona é considerada ser mediada pela proteína
PH-20. Quando essa proteína da membrana acrossômica interna foi injetada em
cobaias macho ou fêmea, 100% desses animais tornaram-se estéreis por vários me-
ses (Primakoffet al., 1988). O soro sangüíneo dessas cobaias estéreis tinha uma
concentração extremamente alta de anticorpos para PH-20. O anti-soro de cobaias
esterilizadas por injeções de PH-20 não só se ligou especificamente a essa pro-
teína, como também bloqueou a adesão espermatozóide-zona in vitro. O efeito
Figura 4.18Figura 4.18Figura 4.18Figura 4.18Figura 4.18
Diagrama da estrutura fibrilar da zona pelúcida
do camundongo. Filamentos principais da
zona pelúcida são compostos por dímeros
repetitivos das proteínas ZP2 e ZP3. Esses
filamentos estão ocasionalmente ligadospor
ZP1, formando uma esteira de malhas. (Se-
gundo Wassarman, 1989.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 139
(A) (B)
(C) (D)
contraceptivo perdurou por vários meses, após os quais a fertilidade foi restabelecida.
Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos. O análogo
humano da proteína PH-20 não é ainda conhecido, porém, certos antígenos do es-
permatozóide apresentam um padrão semelhante de localização no espermatozóide.
As proteínas da zona pelúcida humana e suas funções ainda não foram estabeleci-
das tão claramente como no camundongo. Ainda assim, esses experimentos mos-
tram que o princípio da contracepção imunológica está bem fundamentado.
Fusão de gametas e a prevenção da polispermia
Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóideFusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóideFusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóideFusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóideFusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide
O reconhecimento do espermatozóide pelo envoltório vitelínico ou zona é seguido
pela lise da porção do envoltório ou zona na região da cabeça do espermatozóide
(Colwin e Colwin, 1960; Epel, 1980). Essa lise é seguida pela fusão da membrana
espermática com a membrana do óvulo.
A entrada do espermatozóide no óvulo do ouriço-do-mar está ilustrada na Figura
4.19. A superfície do óvulo está coberta de pequenas microvilosidades; a fusão
espermatozóide-óvulo parece causar a polimerização da actina e a extensão de várias
microvilosidades para formar o cone de fertilização (Summers et al., 1975; Schatten
e Schatten, 1980, 1983). A homologia entre óvulo e espermatozóide é novamente
Figura 4.19Figura 4.19Figura 4.19Figura 4.19Figura 4.19
Varredura ao microscópio eletrônico da entrada
do espermatozóide em óvulo de ouriço-do-mar.
(A) Contato da cabeça do espermatozóide com
microvilosidades do óvulo através do processo
acrossômico. (B) Formação do cone de fertili-
zação. (C) Internalização do espermatozóide no
óvulo. (D) Micrografia de transmissão ao mi-
croscópio eletrônico da internalização do es-
permatozóide através do cone de fertilização.
(A-C de Schatten e Mazia, 1976, cortesia de G.
Schatten; D cortesia de F. J. Longo.)
140 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
demonstrada, porque o cone de fertilização transitório, tal como o processo
acrossômico, parece se prolongar pela polimerização da actina. Após a junção, pode-
se encontrar material do espermatozóide na membrana do óvulo (Gundersen et al.,
1970). O núcleo e a cauda do espermatozóide passam pela ponte citoplasmática, que
é alargada pela polimerização da actina. Yanagimachi e Noda (1970) mostraram que
processo semelhante ocorre na fusão de gametas de mamíferos (Figura 4.20).
No ouriço-do-mar, todas as regiões do óvulo são capazes de se fundir com o
espermatozóide; em várias outras espécies, existem regiões especializadas na mem-
brana para o reconhecimento e fusão com o espermatozóide (Vacquier, 1979). A
fusão é um processo ativo, freqüentemente mediado por proteínas “fusogênicas”
específicas. Proteínas como a HA do vírus da influenza e a proteína F do vírus
Sendai promovem a fusão celular, sendo possível que a bindina também seja uma
dessas proteínas. Glabe (1985) mostrou que a bindina do ouriço-do-mar promove a
fusão de vesículas fosfolipídicas e que, tal como as proteínas fusogênicas virais, a
bindina contém uma longa região de aminoácidos hidrofóbicos perto do terminal
amino. Em abalones, a lisina que dissolve o envoltório vitelínico também demons-
trou ter atividade fusogênica (Hong e Vacquier, 1986).
As proteínas fertilinas da membrana do espermatozóide dos mamíferos são
essenciais para fusão espermatozóide-óvulo (Primakoff et al., 1987; Blobel et al.,
1992; Myles et al., 1994). A fertilina do camundongo tem regiões hidrofóbicas seme-
lhantes às das proteínas fusogênicas virais, além de uma seqüência que sugere
ligação com uma integrina da membrana do óvulo. Evidência atual sugere que a
fertilina do camundongo liga-se à integrina α6β1 da membrana assumindo-se que a
região hidrofóbica da fertilina pode, em seguida, mediar a união das duas membra-
nas (Almeida et al., 1995). Quando as membranas se fundem, o núcleo, mitocôndrias,
centríolo e flagelo podem penetrar no ovo.
Prevenção da PolispermiaPrevenção da PolispermiaPrevenção da PolispermiaPrevenção da PolispermiaPrevenção da Polispermia
Assim que um espermatozóide tiver penetrado o óvulo, a capacidade de fusão da
membrana do óvulo, que fora tão necessária para conseguir a penetração, torna-se
um risco. No ouriço-do-mar, como na maioria dos animais estudados, qualquer es-
permatozóide que penetra o óvulo, pode prover um núcleo haplóide e um centríolo
para o óvulo. Na monospermia normal, na qual somente um espermatozóide penetra
o óvulo, um núcleo haplóide do espermatozóide e um do óvulo se combinam para
formar o núcleo diplóide do ovo fertilizado (zigoto), restaurando o número de cro-
mossomos apropriado para a espécie. O centríolo, provindo do espermatozóide, se
dividirá para formar os dois pólos do fuso mitótico durante a clivagem.
A entrada de múltiplos espermatozóides – polispermia – conduz à conse-
qüências desastrosas na maioria dos organismos. No ouriço-do-mar, a fertiliza-
ção por dois espermatozóides resulta em um núcleo triplóide, no qual cada
cromossomo está representado não duas, mas três vezes. Pior ainda, como o
centríolo se divide para formar os dois pólos do aparelho mitótico, aqui, em
vez de um fuso mitótico bipolar separar os cromossomos em duas células, os
cromossomos triplóides se dividiriam em quatro células. Como não há meca-
nismos para assegurar que cada uma das quatro células receba o número e o
tipo apropriado de cromossomos, esses serão distribuídos de maneira desigual.
Algumas células receberiam cópias extra de certos cromossomos e outras cé-
lulas não os teriam. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais células ou
morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4.21). [fert6.html]
As espécies desenvolveram maneiras de prevenir a união de mais de dois
núcleos haplóides. A mais comum é a de impedir a entrada de mais de um
espermatozóide no óvulo. O óvulo do ouriço-do-mar tem dois mecanismos que
evitam a polispermia: uma reação rápida, efetivada por uma mudança elétrica
na membrana plasmática do óvulo, e uma reação mais lenta, causada pela
exocitose dos grânulos corticais.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 141
O BLOQUEIO RÁPIDO DA POLISPERMIA. A membrana celular do óvulo é notável
não somente por sua habilidade de se fundir com a membrana espermática, mas tam-
bém por sua capacidade de resistir a uma ulterior fusão imediatamente após a entrada
de um espermatozóide (Just, 1919).
O bloqueio rápido à polispermia, é conseguido pela mudança do potencial elétrico
da membrana do óvulo. Essa provê uma barreira seletiva entre o citoplasma e o ambi-
ente exterior; a concentração iônica do óvulo difere muito daquela do ambiente, uma
diferença especialmente pronunciada para os íons de sódio e potássio. A água do mar
tem uma alta concentração do íon sódio, ao passo que o citoplasma do óvulo tem
relativamente pouco sódio. O oposto acontece com os íons potássio. Essa condição
é mantida pela membrana celular, que constantemente inibe a entrada de sódio no
Figura 4.20Figura 4.20Figura 4.20Figura 4.20Figura 4.20
Entrada de espermatozóide no óvulo do hamster dourado. (A) Micrografia eletrônica de
varredura do ato da fusão. O ponto “calvo” (sem microvilosidades) é o local abandona-
do pelo corpo polar. (B) Vista próxima da ligação espermatozóide-zona. (C ) Microgra-
fia eletrônica de transmissão mostrando a cabeça do espermatozóide atravessando a
zona. (D) Micrografia eletrônica de transmissão, do espermatozóide fundindo em para-
lelo a membrana do plasma do óvulo. (E) Diagrama da fusão do acrossomo do esper-matozóide e membranas plasmáticas com as microvilosidades do óvulo. (Segundo
Yanagimachi e Noda, 1970; Yanagimachi, 1994; fotografias cortesia de R. Yanagimachi.)
(A) (B) (C)
(E)
Membrana
acrossômica
interna
Núcleo
Segmento
equatorial do
acrossomo
Zona
142 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Centrossomo do
espermatozóide
Pronúcleos
do oócito
(A)
Oócito
Pronúcleos
do esperma-
tozóide
Fusão pronuclear
1a clivagem
Células em desintegração;
morte do embrião
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
oócito e impede o escoamento de íons de potássio para o ambiente. Quando inse-
rimos um eletrodo no óvulo e colocamos um outro fora do oócito, podemos medir
a constante diferença potencial da membrana plasmática do óvulo. Esse potencial
de repouso da membrana é geralmente cerca de 70 mV, e usualmente expresso
como –70 mV porque o interior da célula está carregado negativamente em relação
ao exterior. [fert7.html]
Dentro de 1-3 segundos após a ligação do primeiro espermatozóide, o potencial
da membrana muda para um nível positivo (Longo et al., 1986). Um pequeno influxo
de íons de sódio no óvulo é permitido, trazendo a diferença de potencial para +20 mV
(Figura 4.22 A). Embora o espermatozóide possa se fundir com membranas tendo um
potencial de –70 mV, não pode se fundir com membranas com um potencial de repou-
so positivo. Não é conhecido como a ligação ou a entrada do espermatozóide sina-
liza a abertura dos canais de sódio; porém, Gould e Stephano (1987, 1991) fornece-
ram o que poderá ser uma pista importante para a compreensão desse processo. Os
autores isolaram do espermatozóide de Urechis (um verme equiuróide marinho) uma
proteína cromossômica capaz de abrir canais de sódio de óvulos de Urechis. Quan-
do tais óvulos são expostos a essa proteína, a mudança da velocidade do influxo de
sódio e do potencial de membrana resultante são muito parecidos com aqueles
produzidos pelo espermatozóide vivo. A abertura dos canais de sódio no óvulo,
parece ser causada pela ligação do espermatozóide ao óvulo.
Jaffe e seus colaboradores mostraram que a polispermia podia ser induzida
quando óvulos foram supridos artificialmente com uma corrente elétrica que man-
tinha negativo o seu potencial de membrana. Reciprocamente, a fertilização podia
ser inteiramente prevenida conservando tal potencial positivo (Jaffe, 1976). O
bloqueio rápido da polispermia podia também ser evitado baixando-se a concen-
tração do sódio da água (Figura 4.22B-D). Se os íons de sódio não forem suficien-
tes para ocasionar um deslocamento positivo do potencial de membrana, ocorre a
polispermia (Gould-Somero et al., 1979; Jaffe, 1980). Não é conhecido como dife-
renças no potencial de membrana atuam sobre o espermatozóide bloqueando a
segunda fecundação. Muito provavelmente, o espermatozóide conduz um compo-
nente (possivelmente uma proteína fusogênica carregada positivamente), sendo a
inserção desse componente na membrana do óvulo, provavelmente, regulada pela
carga elétrica transmembrana (Iwao e Jaffe, 1989). Um bloqueio elétrico à polispermia
também ocorre em rãs (Dross e Elinson, 1980), mas provavelmente não na maioria
dos mamíferos (Jaffe e Cross, 1983).
O BLOQUEIO LENTO DA POLISPERMIA. Óvulos do ouriço-do-mar (e muitos ou-
tros) têm um segundo mecanismo para assegurar que múltiplos espermatozóides não
penetrem no citoplasma do óvulo (Just, 1919). O bloqueio rápido é transitório, o po-
tencial de membrana do óvulo do ouriço-do-mar somente permanece positivo por
cerca de um minuto. Essa curta mudança de potencial não é suficiente para prevenir a
polispermia de maneira permanente. Carroll e Epel (1975) demonstraram que a
Figura 4.21Figura 4.21Figura 4.21Figura 4.21Figura 4.21
Desenvolvimento aberrante de um óvulo de ouriço-do-mar fecundado por dois espermato-
zóides. (A) Fusão de três núcleos haplóides, cada um contendo 18 cromossomos, e
divisão dos dois centríolos espermáticos para formar quatro pólos mitóticos. (B, C) Os
54 cromossomos se distribuem aleatoriamente nos quatro fusos. (D) Na anáfase da
primeira divisão, os cromossomos duplicados são arrastados para os quatro pólos. (E)
Quatro células contendo números e tipos diferentes de cromossomos são formadas,
causando a morte prematura do embrião (F). (Segundo Boveri, 1907.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 143
Segundos
[Na+] (mM)
Porcentagem de
ovos polispérmicos
(B) (C) (D)
Adição de
espermatozóide
(A)
polispermia ainda pode ocorrer se os espermatozóides ligados ao envoltório
vitelínico não forem removidos de alguma maneira. Essa remoção é conseguida
pela reação dos grânulos corticais, um bloqueio mecânico mais lento da polispermia
que se torna ativo cerca de 1 minuto após a primeira ligação bem sucedida esper-
matozóide-óvulo.
Diretamente abaixo da membrana do óvulo do ouriço-do-mar existem 15.000
grânulos corticais, cada um com 1 um de diâmetro (veja Figura 4.6B). Com a entra-
da do espermatozóide, esses grânulos se fundem com a membrana plasmática do
óvulo, liberando seu conteúdo para o espaço entre a membrana e a esteira fibrosa
das proteínas do envoltório vitelínico. Há várias proteínas associadas com esse
processo de exocitose de grânulos corticais. As primeiras são proteases. Essas
enzimas dissolvem os postos vitelínicos que conectam as proteínas do envoltório
vitelínico à membrana celular, secionando o receptor de bindina e todo espermato-
zóide a ele ligado (Vacquier et al., 1973; Glabe e Vacquier, 1978). Outras proteínas,
mucopolissacarídeos liberados dos grânulos, produzem um gradiente osmótico
que permite a entrada da água no espaço entre a membrana celular e o envoltório
e, dessa forma, o envoltório vitelínico se expande e passa a ser chamado de
envoltório de fertilização (Figuras 4.23 e 4.24). Uma terceira proteína, produto dos
grânulos corticais, uma peroxidase, enrijece o envoltório de fertilização através de
ligações cruzadas entre resíduos de tirosina em proteínas adjacentes (Foerder e
Shapiro, 1977; Mozingo e Chandler, 1991). Como mostra a Figura 4.23, o envoltório
de fertilização começa a se formar no local da entrada do espermatozóide e conti-
nua sua expansão ao redor do óvulo. À medida que esse envoltório se forma, os
espermatozóides são liberados. O processo se inicia cerca de 20 segundos após a
fixação do espermatozóide e se completa ao fim do primeiro minuto da fertilização.
Finalmente, uma quarta proteína granular, a hialina, forma uma capa em volta do
óvulo (Hylander e Summers, 1982). A célula estende microvilosidades alongadas
cujas extremidades se ligam a essa camada hialina, que fornece apoio para os
blastômeros durante a clivagem.
Em mamíferos, a reação granular não cria um envoltório de fertilização, porém, o
efeito é o mesmo. Enzimas liberadas modificam os receptores de espermatozóide da
Figura 4.22Figura 4.22Figura 4.22Figura 4.22Figura 4.22
Potencial de membrana de óvulos de ouriço-do-mar antes
e após a fertilização. (A) antes da adição do espermato-
zóide, a diferença de potencial através da membrana celu-
lar do óvulo é de aproximadamente –70 mV. De 1 a 3 se-
gundos após o espermatozóide fertilizante ter entrado em
contato com o óvulo, o potencial se desloca na direção
positiva. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+
490 mM. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+
120 mM (colina foi substituída por sódio). Os ovos de
Lytechinus foram fotografados durante a primeira
clivagem. (D) Tabela mostrando a elevação da polispermia
com o decréscimo da concentração do íon sódio. (de Jaffe,
1980, fotografias cortesia de L. A. Jaffe.)
144 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
(A) (B)
(C) (D)
zona pelúcida de maneira que esses não mais podem ligar-se a espermatozóide (Bleil
e Wassarman, 1980). Essa modificação é chamada reação da zona. Durante essa
reação, tanto ZP3 como ZP2 são modificadas. Florman e Wassarman (1985),propu-
seram que os grânulos corticais do óvulo do camundongo contêm uma enzima que
corta os resíduos terminais de açúcares de ZP3, com isso liberando espermatozóide
ligado à zona e evitando a fixação de mais espermatozóide. Esses grânulos corticais
contêm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias
de carboidrato de ZP3. Miller e colaboradores (1992, 1993) demonstraram que após
a fertilização, o resíduo de N-acetilglicosamina é removido, ZP3 não serve como
substrato para a ligação de galactosiltransferase. ZP2 é cortada pelas proteases
granulares perdendo também sua habilidade de ligar espermatozóide (Moller e Was-
sarman, 1989). Assim, o espermatozóide não pode mais iniciar ou manter sua ligação
à zona pelúcida e é rapidamente descartado.
CÁLCIO COMO O INICIADOR DA REAÇÃO GRANULAR CORTICAL . O meca-
nismo da reação dos grânulos corticais é semelhante aquele da reação acrossômica.
Após a fertilização, a concentração intracelular de cálcio do ovo aumenta muito.
Nessas concentrações, as membranas corticais se fundem com aquelas do ovo,
causando exocitose de seu conteúdo (veja Figura 4.24). Após a fusão dos grânulos
corticais ao redor do ponto de entrada do espermatozóide, uma onda de exocitose se
propaga ao redor do corte até o lado oposto do ovo.
A liberação de cálcio armazenado na região intracelular, pode ser monitorada visu-
almente pelo uso de corantes luminescentes (isolados da água-viva luminescente)
como a aequorina ativado pelo cálcio, ou de corantes como fura-2. Esses corantes
emitem luz quando ligam íons livres de cálcio. Os óvulos são injetados com o corante
e fecundados. A Prancha 12 mostra a notável onda de liberação de cálcio que se
propaga através do óvulo do ouriço-do-mar; começando no ponto de entrada do
Figura 4.23Figura 4.23Figura 4.23Figura 4.23Figura 4.23
Formação do envoltório de fertilização e remo-
ção do excesso de espermatozóide. Espermato-
zóide foi adicionado a óvulos de ouriço-do-mar,
e a suspensão foi fixada em formaldeído para
evitar futuras reações. (A) Dez segundos após
a adição de espermatozóide, esses foram vistos
rodeando o óvulo. (B,C) 25 e 35 segundos após
a inseminação, um envoltório de fertilização se
forma em volta do óvulo, iniciado no ponto de
entrada do espermatozóide. (D) O envoltório
de fertilização está completo, e o excesso de
espermatozóide é removido. (de Vacquier e
Payne, 1973, cortesia de V. D. Vacquier.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 145
(i)
Envoltório
vitelínico
Membrana plasmática
do óvulo Microvilosidade
Grânulo
cortical
Espermatozóide
supranumerário no
envoltório vitelínico
Enzimas proteolíticas e
mucopolissacarídeos são liberados
Microfilamentos
Hialina
Envoltório de
fertilização
Espermatozóide é liberado
Camada hialina
(iv)
Membrana
celular
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(ii)
(iii)
espermatozóide um feixe de luz atravessa a célula (Steinhardt et al., 1977; Gilkey et al.,
1978; Hafner et al., 1988). Como documentado pelas fotografias, os íons de cálcio não
se difundem simplesmente através do óvulo a partir do ponto da entrada do esperma-
tozóide. Ao contrário, a liberação de cálcio inicia-se de um lado da célula e termina do
outro. O mecanismo dessa onda será discutido logo adiante (veja Informações adici-
onais & Especulações, página 147). A total liberação de íons de cálcio é completada, a
grosso modo, em 30 segundos no ovo do ouriço-do-mar; os íons livres de cálcio são
re-seqüestrados pouco após sua liberação. Quando dois espermatozóides entram no
citoplasma do óvulo, a liberação de cálcio pode ser vista começando em dois pontos
separados da superfície celular (Hafner et al., 1988).
Vários experimentos demonstraram que íons de cálcio são responsáveis diretos
pela propagação da reação cortical e que são armazenados dentro do próprio óvulo.
A droga A23187 é um ionóforo que transporta íons de cálcio através de membranas,
permitindo a esses cátions atravessar barreiras antes impermeáveis. A colocação de
Figura 4.24Figura 4.24Figura 4.24Figura 4.24Figura 4.24
Exocitose de grânulos corticais. (A) Diagrama
esquemático mostrando os eventos levando à
formação do envoltório de fertilização e a ca-
mada hialina. À medida que os grânulos
corticais sofrem exocitose, liberam proteases
que cortam as proteínas que ligam o envoltório
vitelínico à membrana celular. Mucopolissa-
carídeos liberados pelos grânulos formam um
gradiente osmótico, causando a entrada de água
e tumefação do espaço entre o envoltório
vitelínico e a membrana celular. Outras enzimas
liberadas dos grânulos corticais endurecem o
envoltório vitelínico (agora o envoltório de fer-
tilização) e liberam espermatozóide a ele liga-
do. (B,C) Micrografias eletrônicas de trans-
missão e de varredura do córtex de um ovo não
fertilizado de ouriço-do-mar. (D, E) Microgra-
fias eletrônicas de transmissão e varredura da
mesma região de um ovo recém-fertilizado,
mostrando a elevação do envoltório de fertili-
zação e os pontos nos quais os grânulos
corticais fundiram com a membrana plasmáti-
ca do ovo (flechas em D). (A segundo Austin,
1965; B-E de Chandler e Heuser, 1979, corte-
sia de D. E. Chandler.)
146 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
ovos não-fertilizados de ouriço-do-mar em água do mar contendo A23187, leva à
reação granular cortical e à elevação do envoltório de fertilização, mesmo na ausên-
cia de íons de cálcio na água do mar. Portanto, A23187 provoca a liberação de íons
de cálcio já seqüestrados em organelas dentro do óvulo (Chambers et al., 1974;
Steinhardt e Epel, 1974). Estudos posteriores (Hollinger e Schuetz, 1976; Fulton e
Whittingham, 1978; Hamaguchi e Hiramoto, 1981; Kline, 1988) mostraram que o íon
de cálcio inicia reações granulares corticais quando injetado em ovos de ouriço-do-
mar, camundongo e rã.
Os íons de cálcio internos são armazenados no retículo endoplasmático do
óvulo (Eisen e Reynolds, 1985; Terasaki e Sardet, 1991). No ouriço-do-mar e na rã,
cujos óvulos sofrem uma reação granular cortical, esse retículo é pronunciado no
córtex e rodeia os grânulos (Figura 4.25; Gardiner e Grey, 1983; Luttmer e Longo,
1985). Na rã Xenopus, o retículo endoplasmático cortical fica 10 vezes mais abun-
dante durante o amadurecimento do óvulo e desaparece localmente dentro de um
minuto após a ocorrência da onda de exocitose em qualquer região do córtex. Jaffe
(1983) compara esse retículo endoplasmático seqüestrador de cálcio, ao retículo
sarcoplasmático do músculo esquelético ou cardíaco. Uma vez iniciada, a libera-
ção de cálcio é autopropagada. Cálcio livre é capaz de liberar cálcio seqüestrado
de seus locais de armazenamento, causando assim uma onda libertadora do íon
cálcio e exocitose granular cortical.
Variações em estratégias preventivas da polispermia existem em toda a nature-
za. Nos mamíferos, a polispermia é minimizada pelo pequeno número de esperma-
tozóides que atingem o local da fecundação (Braden e Austin, 1954). O bloqueio à
polispermia em hamsters parece ser controlado somente pela liberação de sítios
que ligam o espermatozóide na zona pelúcida (Miyazaki e Igusa, 1981; Jaffe e
Gould, 1985). Coelhos, no entanto, se apoiam num bloqueio da polispermia a nível
da membrana, e ninguém iria disputar o seu grau de sucesso. Finalmente, certos
mamíferos têm defesas para a polispermia sobre as quais pouco sabemos. Nos
óvulos ricos em gema de certas aves, répteis e salamandras, vários espermatozói-
des realmente penetram o citoplasma do óvulo. De uma maneira desconhecida,
todos menos um são induzidos a se desintegrar no citoplasma após a fusão do
pronúcleo do óvulo com um dos pronúcleos do espermatozóide (Ginzburg, 1985;
Elinson, 1986). Qualquer que seja o mecanismo, somente um núcleo haplóide de
espermatozóide pode fundir-se com o núcleo haplóide do óvulo.
Figura 4.25Figura 4.25Figura 4.25Figura 4.25Figura 4.25
Retículoendoplasmático rodeando grânu-
lo cortical no óvulo de ouriço-do-mar. (A)
O retículo foi corado com ósmio-iodeto de
zinco para permitir a visualização por mi-
crografia de transmissão eletrônica. O grâ-
nulo é visto rodeado pelo retículo. (B) Re-
trato de um óvulo inteiro corado por anti-
corpos fluorescentes para os canais de li-
beração de cálcio. Os anticorpos mostram
esses canais no retículo endoplasmático
cortical. (A de Luttmer e Longo, 1985, cor-
tesia de S. Luttmer; B de McPherson et
al., 1992, cortesia de F. J. Longo.) (A) (B)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 147
A Ativação do Metabolismo dos Gametas
e a liberação do íon cálcio é neces-
sária para ativação do oócito, como
o espermatozóide motiva essa libe-
toda célula, começando no ponto da en-
trada do espermatozóide; os grânulos
corticais se fundem com a membrana
celular na presença de concentrações
altas de cálcio, respondem com uma
onda de exocitose que segue os íons
de cálcio.
IP3 é também capaz de liberar íons
de cálcio em óvulos de vertebrados, e o
bloqueio do seu receptor em óvulos de
hamster impede a liberação de cálcio no
ato da fertilização. Como em ouriço-do-
mar IP3 também parece mediar a libera-
ção de cálcio de sítios no retículo en-
doplasmático (Lechleiter e Clapham,
1992; Miyazaki et al., 1992; Ayabe et al.,
1995). Xu e colaboradores (1994) mos-
traram que o bloqueio da mediação por
IP3 da saída de cálcio, impede todos os
aspectos da ativação do óvulo pelo es-
permatozóide incluindo exocitose gra-
nular, recrutamento de mRNA e recome-
ço do ciclo celular.
A questão então é: o que inicia a pro-
dução de IP3? Há dois caminhos que pa-
recem estimular a liberação de cálcio: aque-
le do receptor ligado à proteína G, larga-
mente conhecido como liberadora de íons
de cálcio na contração muscular, cresci-
mento celular, secreção hormonal, percep-
ção sensorial e liberação de neurotrans-
missores (Berridge, 1993). O outro cami-
nho é o do receptor da tirosinoquinase
em cascata, que também é usado na proli-
feração e diferenciação celular. Conforme
apresentado no Capítulo 3, o primeiro ca-
minho se inicia pela ligação de um ligante
extracelular (como a acetilcolina ou a
serotonina) à uma proteína receptora
transmembrana. No interior da membrana
plasmática esse receptor é ligado à prote-
ína trimérica G. Esse receptor ativa a pro-
teína G (veja Figuras 3.33 e 3.35), levando
à sua dissociação em subunidades, capa-
zes de ativar um conjunto de enzimas cha-
madas de fosfolipase C. Essa cataliza a
hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
(PIP2) em dois segundos mensageiros:
inositol 1,4,5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol
(DAG). O primeiro é capaz de abrir canais
de cálcio. DAG estimula a troca de prótons
que permite o efluxo de íons de hidrogê-
nio das células. O resultado disso é a ele-
vação de cálcio e do pH intracelulares.
O outro segundo mensageiro, DAG,
é considerado ativar a proteína quinase
C (PKC) da membrana, que é transferida
do citosol para a membrana plasmática
do ovo pouco após a fecundação, e pode
ser responsável pela ativação da proteí-
na que troca íons de sódio por íons de
hidrogênio (Swann e Whitaker, 1986;
Nishizuka, 1986; Shen e Burgart, 1986;
Olds et al., 1995). O bloqueio da PKC em
óvulos de ouriços-do-mar inibe a alcali-
nização do citosol observada durante a
fertilização normal (Shen e Buck, 1990).
A proteína que faz a troca Na + /H+, tam-
bém necessita de íons cálcio para sua
atividade. Assim, tanto DAG como IP
3
estão envolvidos nas ativação do óvu-
lo. A etapa regulatória chave é a ativa-
ção da fosfolipase C, que produz esses
dois compostos. Jaffe e seus colabora-
dores encontraram a proteína G em óvu-
los de ouriço-do-mar e rã; e quando in-
jetaram ativadores da proteína G nes-
ses óvulos, causaram exocitose granu-
lar na ausência de espermatozóide
(Turner et al., 1986; Kline et al., 1991).
Tal ativação foi inibida por quelantes
de cálcio, como o EGTA. [fert8.html]
Parece, portanto, que uma proteína
G pode estar envolvida na regulação de
íons seqüestrados de cálcio, e na exoci-
tose de grânulos corticais. Existem vári-
as maneiras pelas quais isso pode acon-
tecer. Em primeiro lugar, a ligação do es-
permatozóide a um receptor na membra-
na celular do óvulo pode mudar a sua
conformação de modo a ativar a proteí-
na G e iniciar a cascata (Figura 4.26A),
conforme demonstrado por Kline e co-
laboradores (1988, 1991). Eles levanta-
ram a hipótese que se essa proteína
mediar a fertilização por ser ativada por
um receptor ligante de espermatozóide,
então a mesma proteína G poderia ser
ativada por um neurotransmissor se o
ovo contiver um receptor para neuro-
transmissor capaz de ativar a proteína
G. Eles injetaram mRNA para o receptor
de serotonina ou de acetilcolina em óvu-
los de rã. Esses receptores da superfície
S
ração? Realmente não se sabe. Como se
pronunciou um investigador (Berridge,
1993): “Exatamente como o espermatozói-
de dispara o processo explosivo da libe-
ração do cálcio no óvulo, ainda permane-
ce algo misterioso”. Dados recentes su-
gerem que produção do inositol 1,4,5, tri-
fosfato (IP3) é o evento primário para a
liberação de íons cálcio do seu local de
armazenamento intracelular.
IP
3
 injetado pode liberar íons cálcio
seqüestrados no óvulo e muitos outros
tipos de células (Swann e Whitaker,
1986; Berridge, 1993); o aumento na con-
centração de IP3 intracelular é visto
ocorrer dentro de 10 segundos após a
fecundação de ovos do ouriço-do-mar
(Ciapa e Whitaker, 1986). A libertação
de íons cálcio e a reação dos grânulos
corticais rapidamente seguem a forma-
ção ou injeção de IP3 (Whitaker e Irvine,
1984; Busa et al., 1985). Os efeitos me-
diados por IP3 podem ser abortados pela
pré-injeção de agentes quelantes de
cálcio no óvulo (Turner et al., 1986),
confirmando que IP3 estimula a libera-
ção de cálcio armazenado.
Canais de cálcio respondendo ao IP
3
foram encontrados no retículo endo-
plasmático do óvulo. O IP3 formado no
local da entrada do espermatozóide é
considerado ligar-se a esses receptores
de IP3 no retículo endoplasmático, oca-
sionando uma liberação local de cálcio
(Ferris et al., 1989; Furuichi et al., 1989;
Terasaki e Sardet, 1991). Uma vez libera-
dos, os íons de cálcio podem difundir
diretamente, ou facilitar a liberação de
mais íons de cálcio de receptores sensí-
veis ao cálcio localizados no retículo en-
doplasmático (McPherson et al., 1992).
A ligação de íons de cálcio a esses re-
ceptores libera mais cálcio, e esse pode
continuar a onda, ligando-se a mais re-
ceptores e assim por diante. Mohri e co-
laboradores (1995) mostraram que o cál-
cio liberado por IP3 é necessário e sufi-
ciente para liberação de cálcio. Essa
onda de íons de cálcio é propagada por
Informações adicionais Especulações&
148 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
CAMINHOS ANTERIORES À FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE
(A) (B) (C)
Espermatozóide
Fosfolipase C (PLC)
Receptor
G-proteína
Receptor de
Tirosinoquinase
Tirosinoquinase
Receptor de IP
3
Retículo endoplasmático
APÓS A FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE
Retículo endoplasmático
(D)
Fator solúvel
do óvulo
Fatores solúveis
do Espermatozóide
G-proteína
Receptor de IP
3
celular foram sintetizados e foram de-
tectados na membrana celular do óvu-
lo. Os óvulos puderam ser “fertilizados”
por serotonina e acetilcolina e foi ob-
servado a reação cortical. Experimentos
semelhantes mostraram que quando
neurotransmissores ativam o caminho
da proteína G–IP3 em oócitos de camun-
dongo, são induzidos os eventos da fer-
tilização (Williams et al., 1992; Moore et
al., 1993).
Entretanto, a cascata ligada à proteí-
na-G não é o único caminho capaz de ge-
rar IP3 (veja Capítulo 3). Evidências re-
centes (Moore et al., 1994; Shilling et al.,
1994; Yim et al.,1994) demonstram que a
ativação do receptor da tirosinoquinase
também produz IP3 e ativa a onda de cál-
cio e a reação granular cortical (Figura
4.26b). Quando o mRNA para o receptor
dessa quinase (o receptor para o fator de
crescimento derivado das plaquetas,
PDGF) foi injetado em oócitos de estre-
la-do-mar, o receptor PDGF foi sintetiza-
do e incorporado nas membranas celula-
res desse organismo. Quando, após a
maturação dos oócitos, PDGF foi adicio-
nado à água banhando os óvulos, esses
apresentaram aumento de cálcio intrace-
lular livre, exocitose de grânulos corticais
e síntese de DNA. Alguns se desenvol-
veram em larvas. Quando o mRNA con-
tinha um ponto de mutação que impedia
Figura 4.26Figura 4.26Figura 4.26Figura 4.26Figura 4.26
Mecanismos possíveis da ativação do óvulo. (A) Trajetória do fosfatidilinositol medi-
ado pela G-proteína. (B) Trajetória do receptor da tirosinoquinase (RTK). (C) Trajetó-
ria da tirosinoquinase citoplasmática. (D) Trajetória na qual a G proteína ou
tirosinoquinase ativadas na membrana espermática ativam trajetórias no óvulo. (E)
Trajetórias de ativadores solúveis.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 149
o receptor interagir com a fosfolipase C,
nenhuma dessas reações ocorreu (Shilling
et al., 1994). Assim, tanto o caminho liga-
do ao receptor proteína-G como aquele
do receptor da tirosinoquinase, parecem
ser capazes de ativar essa fosfolipase,
criar IP3 e induzir o fluxo de cálcio no
óvulo. O receptor da bindina não ofere-
ce pistas para explicar como ocorre essa
ativação, por não ter semelhante em ou-
tras proteínas transmembrana. No entan-
to, 5 segundos após ligar a bindina, fica
fosforilado em um dos seus resíduos
tirosina citoplasmáticos (Abassi e Foltz,
1994). Isso sugere que o receptor de
bindina ligado, pode interagir com a
tirosinoquinase plasmática tal como
aqueles que medeiam a liberação de cál-
cio durante a ativação de células T (Fi-
gura 4.26 C; Hall et al., 1993).
Outra possibilidade é que a ativa-
ção do caminho do IP3 não é devida à
ligação do espermatozóide e óvulo, mas
à fusão das membranas do óvulo e do
espermatozóide. Mc Culloch e Chambers
(1992) obtiveram evidência eletrofisio-
lógica que a ativação dos óvulos do
ouriço-do-mar não ocorre até depois da
junção do espermatozóide com o óvulo.
Eles sugerem que os componentes
ativadores do óvulo se localizam na
membrana ou no citoplasma do esper-
matozóide. É até mesmo possível que
por ocasião da fusão das membranas,
as proteínas G da membrana espermáti-
ca ou as tirosinoquinases (ativadas pela
geléia do óvulo para iniciar a reação a-
crossômica) ativem a cascata polifosfo-
inositídica para liberação de cálcio do
óvulo. (No cenário apresentado na Fi-
gura 4.26 D, a bindina meramente liga o
óvulo ou, talvez, motive a fosforilação
de proteínas necessárias em fases mais
avançadas do desenvolvimento.)
Ainda outra possibilidade é que o
agente ativo na liberação de cálcio ligado
venha do citosol do espermatozóide.
Parrington e colaboradores (1996) isola-
ram uma proteína de 33-kDA, chamada
oscilina, localizada no escasso citoplas-
ma da cabeça do espermatozóide (Figura
4.26 E). A microinjeção dessa proteína em
óvulos de camundongo pode iniciar libe-
ração de cálcio, porém, os outros parâme-
tros da ativação do óvulo (exocitose dos
grânulos, recrutamento de mRNA e reto-
mada do ciclo celular) não são observa-
dos. Não é conhecido qual o papel que
essa proteína pode ter na fisiologia da ati-
vação do óvulo.
Ativação do metabolismo do óvulo
Embora a fertilização seja freqüentemente descrita como mero meio de junção de dois
núcleos haplóides, ela tem um papel igualmente importante na iniciação de processos
que iniciam o desenvolvimento. Esses eventos acontecem no citoplasma e ocorrem
sem o envolvimento dos núcleos.*
O óvulo do ouriço-do-mar maduro é uma célula metabolicamente lenta, reativada
pelo espermatozóide. Essa ativação é apenas o estímulo; aciona um conjunto de
eventos metabólicos pré-programados. As respostas do óvulo ao espermatozóide
podem ser divididas em “precoces” que ocorrem em poucos segundos após a
reação cortical e “tardias” que acontecem vários minutos após o inicio da fertiliza-
ção (Tabela 4.1).
Respostas precocesRespostas precocesRespostas precocesRespostas precocesRespostas precoces
O contato entre o espermatozóide do ouriço-do-mar ativa dois principais bloqueios à
polispermia: o bloqueio rápido, iniciado pelo influxo de sódio na célula, e o bloqueio
lento, iniciado pela liberação intracelular de íons de cálcio. A ativação de todos os
óvulos parece depender do aumento da concentração de íons livres de cálcio dentro
do óvulo. Em protostomatas, como lesmas e vermes, ao menos parte do cálcio geral-
mente entra no óvulo vindo de fora. Em deuterostomatas, tais como: peixes, rãs,
ouriços-do-mar e mamíferos, a ativação é acompanhada pela liberação de íons de
cálcio do retículo endoplasmático, resultando na onda de cálcio varrendo o óvulo
(Jaffe, 1983; Terasaki e Sardet, 1991).
*Em certas salamandras, essa função desenvolvimental da fertilização está totalmente divor-
ciada da função genética. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) é uma espécie híbrida
que consiste somente de fêmeas. Cada uma produz um ovo com um número não-reduzido de
cromossomos. Esse ovo, porém, não pode se desenvolver sozinho; assim, a salamandra prateada
copula com o macho da salamandra Jefferson (A. jeffersonianum). O espermatozóide desse macho
somente estimula o desenvolvimento do ovo; não contribui com material genético (Uzzell,
1964). Para detalhes desse complexo mecanismo de procriação veja Bogart et al., 1989.
150 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Essa liberação de cálcio é essencial para a ativação do desenvolvimento do embrião.
Se o quelante de cálcio EGTA for injetado no óvulo do ouriço-do-mar, não ocorre exoci-
tose dos grânulos corticais, mudança do potencial da fertilização, descondensação do
espermatozóide, nem reinício da divisão celular (Kline, 1988). Reciprocamente, óvulos
podem ser ativados artificialmente na ausência de espermatozóide por procedimentos
que liberam cálcio livre no oócito. Steinhardt e Epel (1974) acharam que quantidades
micromolares do ionóforo A23187 induzem no óvulo a maioria das respostas caracterís-
ticas de um ovo fertilizado normalmente. A elevação do envoltório de fertilização, o
aumento do pH intracelular, o surto de utilização de oxigênio e o aumento da síntese de
proteína e DNA são todos gerados com sua seqüência própria. Essa ativação acontece
na ausência total de íons de cálcio na água do mar. Na maioria desses casos, o desenvol-
vimento cessa antes da primeira mitose porque os ovos ainda são haplóides e desprovi-
dos do centríolo espermático necessário para a divisão.
Essa liberação de cálcio ativa uma série de reações metabólicas (Figura 4.27). Uma
delas é a ativação da enzima NAD+ quinase, que converte o NAD+ em NADP+ (Epel et
al., 1981). Essa mudança pode ter importantes conseqüências para o metabolismo
lipídico, pois NADP+ (mas não o NAD+) pode ser utilizado como coenzima para
biossíntese lipídica. Assim, a mudança de NAD+ em NADP+ pode ser importante na
construção de novas membranas exigidas durante a clivagem. Outro efeito dessa
mudança se refere ao consumo de oxigênio. Um surto de redução de oxigênio é visto
ocorrer durante a fertilização, e muito desse “surto respiratório” é usado para cruza-
mento ligado da membrana de fertilização. A enzima responsável por essa redução do
oxigênio (para água oxigenada) também é dependente de NADPH (Heinecke e Shapiro,
1989). Por último, o NADPH ajuda na regeneração da glutationa e de ovotiois (ovothiols)
que podem ser cruciais para remoção de radicais livres que poderiam de outra maneira
prejudicar o DNA do ovo e do embrião precoce (Mead e Epel, 1995).
Ligação espermatozóide-óvulo O segundos
Elevação do potencial de fertilização(bloqueio rápido da polispermia) dentro de 1 sec
Fusão das membranas espermatozóide-óvulo dentro de 6 sec
Primeira detecção de aumento de cálcio 6 sec
Exocitose das vesículas corticais (bloqueio lento da polispermia) 15-60 sec
Ativação da NAD quinase começa em 1 min
Aumento de NADH e NADPH começa em 1 min
Aumento do consumo de O
2
começa em 1 min
Entrada do espermatozóide 1-2 min
Efluxo de ácido 1-5 min
Aumento de pH (permanece alto) 1- 5 min
Descondensação da cromatina do espermatozóide 2-12 min
Migração do núcleo do espermatozóide para o centro do óvulo 2-12 min
Migração do núcleo do óvulo para o núcleo do espermatozóide 5-10 min
Ativação da síntese protéica começa em 5-10 min
Ativação do transporte de aminoácidos começa em 5-10 min
Iniciação da síntese de DNA 20-40 min
Mitose 60-80 min
Primeira clivagem 85- 95 min
TTTTTabela 4.1abela 4.1abela 4.1abela 4.1abela 4.1 Eventos da fertilização do ouriço-do-mar
EventoEventoEventoEventoEvento
TTTTTempo aproempo aproempo aproempo aproempo aproximadoximadoximadoximadoximado
aaaaapós a inseminaçãopós a inseminaçãopós a inseminaçãopós a inseminaçãopós a inseminaçãoaaaaa
Principais fontes: Whitaker e Steinhardt, 1985; Mohri et al., 1995.
a Tempos aproximados baseados em dados de S. purpuratus (15-17oC), L. pictus (16-18oC), A .
punctulata (18-20oC) e L. variegatus (22-24oC). A contagem de tempo para os eventos dentro do
primeiro minuto é melhor conhecida para Lytechinius variegatus, assim os tempos apresentados
referem-se à essa espécie.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 151
Influxo de Na+
Alteração do potencial
da membrana
Bloqueio rápido
da polispermia
Ativação da
NAD+ quinase
Conversão de
NAD+ em NADP+
Ligação e/ou fusão de
espermatozóide à
membrana celular do óvulo Produção
de IP
3
Liberação
de Ca2+
Exocitose
de grânulos
corticais Formação da
camada hialinaEstimulação de
proteína G ou
de tirosinoquinase?
Ativação de
fosfolipase C
Estimulação de síntese
protéica, replicação de
DNA, e movimentos
citoplasmáticos de
material morfogenético
Aumento do pH
intracelular
Produção de
diacil-glicerol
Ativação de
proteíno-quinase C
Troca
Na+/H+
Bloqueio lento
da polispermia
Respostas tardiasRespostas tardiasRespostas tardiasRespostas tardiasRespostas tardias
Pouco tempo após o aumento dos níveis de íons cálcio, o pH intracelular também
aumenta. Acredita-se que essas duas condições iônicas (> [Ca2+], < [H+] ajam em
conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilização, incluindo a
síntese de proteínas e de DNA (Winkler et al., 1980; Whitaker e Steinhardt, 1982). O
aumento do pH intracelular começa com o segundo influxo de íons de sódio, causan-
do uma troca 1:1 entre íons de sódio da água do mar e os íons hidrogênio do óvulo*.
Essa perda de hidrogênio faz o pH elevar-se de 6.8 a 7.2, ocasionando enormes mudan-
ças na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt, 1978).
As respostas tardias da fertilização produzidas por essas alterações iônicas, inclu-
em a ativação da síntese de DNA e da proteína. O surto de síntese de proteína ocorre
vários minutos após a entrada do espermatozóide e não depende da síntese de novo
RNA mensageiro (Figura 4.28). Em seu lugar, a síntese de proteína nova utiliza mRNAs
já presentes no citoplasma do oócito (muito mais sobre isso será mencionado no
Capítulo 12). Esses RNAs incluem aqueles que codificam proteínas como histonas,
tubulinas, actinas e fatores morfogenéticos que são utilizados durante o desenvolvi-
mento precoce. Tal surto de síntese protéica pode ser induzido pelo aumento artificial
do pH citoplasmático por íons amônio (Winkler et al., 1980). Reciprocamente, agentes
que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilização tardia como a síntese
de DNA e proteína. Quando ovos recém-fertilizados são colocados em soluções con-
tendo baixas concentrações de íons de sódio e amiloride (uma droga que inibe a troca
Na+/H+), a síntese protéica falha, os movimentos dos pronúcleos do óvulo e do esper-
matozóide são prevenidos, e a divisão celular não ocorre (Dube et al., 1985).
*Novamente, a variação espécie-para-espécie está à solta. No óvulo muito menor do camun-
dongo, não há elevação do pH após a fertilização. Similarmente no camundongo, não há um
aumento dramático na síntese protéica imediatamente em seguida à fertilização.
Figura 4.27Figura 4.27Figura 4.27Figura 4.27Figura 4.27
Modelo de um possível mecanismo de ativa-
ção do óvulo do ouriço-do-mar. (Segundo Epel,
1980 e L. A. Jaffe, comunicação pessoal.)
152 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
In
co
rp
or
aç
ão
 d
e 
va
li
na
[1
4 C
] 
na
pr
ot
eí
na
/m
g 
pr
ot
eí
na
 (
cp
m
 x
 1
0-
3 )
Horas após a fertilização
água do mar
normal
Água do mar tratada
por actinomicina
P
or
ce
nt
ag
em
 d
e 
ri
bo
ss
om
os
em
 p
ol
is
so
m
os
Tempo de desenvolvimento (horas)
Fusão do material genético
Em ouriços-do-mar, o núcleo do espermatozóide penetra o óvulo perpendicular-
mente à superficie do óvulo. Após a fusão das membranas do espermatozóide e do
óvulo, o núcleo do espermatozóide e seu centríolo se separam das mitocôndrias e
do flagelo. A mitocôndria e o flagelo se desintegram dentro do óvulo; assim,
poucas, se tanto, mitocôndrias derivadas do espermatozóide são encontradas em
organismos em desenvolvimento ou em adultos (Dawid e Blackler, 1972; Giles et
al., 1980). Em camundongos estima-se que 1 em cada 10.000 mitocôndrias são
derivadas do espermatozóide (Gyllensten et al., 1991). Assim, embora cada gameta
contribua para o zigoto com um genoma haplóide, o genoma mitocondrial é trans-
mitido principalmente pelo parente materno. Reciprocamente, em quase todos os
animais estudados (o camundongo sendo a principal exceção), o centrossomo
necessário para a produção do fuso mitótico das divisões subseqüentes é deriva-
do do centríolo espermático (Sluder et al., 1989, 1993).
O núcleo do óvulo sendo haplóide é chamado de pronúcleo feminino. Dentro do
citoplasma do óvulo, o núcleo do espermatozóide descondensa para formar o
pronúcleo masculino. Uma vez dentro do óvulo, o pronúcleo masculino sofre uma
dramática transformação. O envoltório pronuclear forma vesículas com pequenos
pacotes, expondo, com isso, a compacta cromatina do espermatozóide ao citoplas-
ma do óvulo (Longo e Kunkle, 1978). As proteínas que prendem a cromatina no seu
estado condensado, inativa, são trocadas por proteínas derivadas do citoplasma do
óvulo. Essa troca permite a descondensação da cromatina do espermatozóide. Em
ouriços-do-mar, a descondensação parece ser iniciada pela fosforilação de duas
Figura 4.28Figura 4.28Figura 4.28Figura 4.28Figura 4.28
Surto de síntese protéica na fertilização emprega mRNA armazena-
do no citoplasma do oócito. (A) Síntese protéica em óvulos do ouri-
ço-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presença ou ausência
de actinomicina D, um inibidor da transcrição. Durante as primeiras
horas, a síntese protéica ocorre sem nova transcrição dos núcleos
do zigoto ou embrião. Um segundo surto de síntese protéica ocorre
durante os estágios medianos de blástula, e isso representa tradu-
ção de mensagens recém-transcritas (e, portanto, não é visto em
embriões crescendo em actinomicina). (B) Aumento na porcenta-
gem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primei-
ras horas do desenvolvimento do ouriço-do-mar, especialmente du-
rante o primeiro ciclo celular. (A segundo Gross et al., 1964; B
segundo Humphreys, 1971.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 153
(A) (B)
Tempo (seg)
Pronúcleo do óvulo
Ponte internuclear
Pronúcleo do
espermatozóide
histonas espermatozóide-específicas, que se ligam fortemente ao DNA. Esse pro-
cesso começa quando o espermatozóide entra em contato com uma glicoproteínana
geléia do óvulo que eleva o nível da atividade proteinoquinase cAMP-dependente.
(Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Capítulo 1.)
Essas quinases fosforilam vários resíduos básicos das histonas espermatozóide-
específicas interferindo, desse modo, com sua ligação ao DNA (Garbers et al., 1980,
1983; Porter e Vacquier, 1986). Esse afrouxamento é considerado facilitar a substitui-
ção das histonas espermatozóide-específicas por outras histonas que haviam sido
estocadas no citoplasma do oócito (Poccia et al., 1981; Green e Poccia, 1985). Uma
vez descondensado, o DNA pode iniciar a transcrição e a replicação. [fert9.html]
Depois que o espermatozóide do ouriço-do-mar entra no citoplasma do óvulo, o
pronúcleo masculino gira 180o fazendo com que o centríolo fique entre o pronúcleo do
espermatozóide e o pronúcleo do óvulo. Em seguida, o centríolo espermático age
como um centro organizador de microtúbulos, estendendo seus próprios microtúbu-
los e integrando-os com os microtúbulos do óvulo formando um áster*. Esses
microtúbulos se estendem através de todo o óvulo, contatam o pronúcleo feminino, e
trazem os dois pronúcleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto, 1980;
Bestor e Schatten, 1981). A fusão forma o núcleo zigótico diplóide (Figura 4.19). A
iniciação da síntese de DNA pode ocorrer no estágio pronuclear (durante a migração)
ou depois da formação do núcleo zigótico.
Em mamíferos, o processo da migração pronuclear dura aproximadamente 12
horas, comparado com menos de uma hora no ouriço-do-mar. O espermatozóide do
mamífero entra quase tangencialmente à superfície do óvulo em vez de aproximá-la
perpendicularmente, e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4.20). O
núcleo do espermatozóide mamífero também se parte quando sua cromatina
descondensa, sendo depois reconstruído por vesículas coalescentes. O DNA do
núcleo espermático é ligado por proteínas básicas chamadas protaminas; essas
proteínas nucleares estão firmemente compactadas através de ligações dissulfeto.
Uma vez no óvulo, a glutationa reduz essas ligações de dissulfeto, permitindo o
desdobramento da cromatina do espermatozóide (Calvin e Bedford, 1971; Kvist et
*Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de ásteres de espermatozóide no seu
recém-fertilizado ovo de ouriço-do-mar, chamou-o de “sol dentro do ovo”, e considerou-o feliz
indicação de uma fertilização bem-sucedida (Hertwig, 1877). Mais recentemente, Simerly e
colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a
defeitos na capacidade do centrossoma formar esses ásteres microtubulares. Essa deficiência
causa a falência da migração pronuclear e a interrupção do desenvolvimento.
Figura 4.29Figura 4.29Figura 4.29Figura 4.29Figura 4.29
Eventos nucleares na fertilização do ouriço-
do-mar. (A) Migração dos pronúcleos do
óvulo e do espermatozóide em um ovo de
Clypeaster japonicus. O pronúcleo do es-
permatozóide está rodeado por microtúbu-
los do seu áster. (B) Fusão de pronúcleos no
ovo do ouriço-do-mar. (A de Hamaguchi e
Hiramoto, 1980, cortesia dos autores; B cor-
tesia de F. J. Longo.)
154 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
(A) (B) (C)
al., 1980). O pronúcleo masculino dos mamíferos aumenta enquanto o núcleo do
oócito completa sua segunda divisão meiótica (Figura 4.30 A).
O centrossomo que acompanha o pronúcleo masculino produz seus ásteres
(principalmente a partir de proteínas armazenadas no oócito) e contata o pronú-
cleo feminino. Então, cada pronúcleo migra ao encontro do outro, replicando seu
DNA ao longo do trajeto. No encontro, os dois envoltórios nucleares se desinte-
gram (Figura 4.30B). No entanto, em lugar de produzir um núcleo zigótico comum
(como acontece na fertilização do ouriço-do-mar), a cromatina condensa-se para
formar cromossomos que se orientam num fuso mitótico comum. Assim, um núcleo
zigótico verdadeiro em mamíferos é visto primeiro não no zigoto, mas no estágio
bicelular (Figura 4.30 C). [fert10.html]
A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos
ERALMENTE ASSUME-SE que
machos e fêmeas portam geno-
mas haplóides equivalentes.
lizando um óvulo no qual o pronúcleo
feminino está ausente. Após penetrar no
óvulo, os cromossomos do espermato-
zóide se duplicam restaurando seu nú-
mero diplóide. Assim, todo o genoma é
derivado do espermatozóide (Jacobs et
al., 1980; Ohama et al., 1981). Aqui ve-
mos uma situação em que as células so-
brevivem, se dividem e têm um número
normal de cromossomos, porém, apre-
sentam um desenvolvimento anormal. Em
vez de formar um embrião, o ovo se trans-
forma numa massa de células placento-
símiles. Não há desenvolvimento normal
quando o genoma inteiro vem do paren-
te masculino. Evidência para a não-equi-
valência dos pronúcleos mamíferos vem
também de tentativas de conseguir que
óvulos se desenvolvam na ausência de
espermatozóide. A habilidade de desen-
volver um embrião sem contribuição es-
permática é chamada partenogênese (do
grego, significando “nascimento vir-
gem”). Os óvulos de muitos invertebra-
dos e de alguns vertebrados são capa-
zes de se desenvolver normalmente na
ausência do espermatozóide se o óvulo
for ativado artificialmente. Nessas situa-
ções, a contribuição do espermatozóide
para o desenvolvimento parece dispen-
sável. Os mamíferos, no entanto, não a-
presentam a partenogênese. A colocação
de oócitos de camundongo em um meio
de cultura que artificialmente ativa o
oócito, ao mesmo tempo suprimindo a for-
mação do segundo corpo polar, produz
G
Um dos princípios fundamentais da ge-
nética Mendeliana é que os genes deri-
vados do espermatozóide são funcional-
mente equivalentes aqueles derivados
do óvulo. No entanto, estudos recentes
mostram que em mamíferos o genoma de-
rivado do óvulo pode ser funcionalmen-
te diferente e ter papel complementar du-
rante certos estágios do desenvolvimen-
to. A primeira evidência dessa não-equi-
valência veio de estudos de um tumor
humano chamado mola hidatidiforme.
Esses tumores parecem tecido placentá-
rio. A maioria dessas molas se desenvol-
ve de um espermatozóide haplóide ferti-
Figura 4.30Figura 4.30Figura 4.30Figura 4.30Figura 4.30
Movimento pronuclear em hamster. (A)
Entrada de espermatozóide na célula e
tumefação do pronúcleo do espermatozói-
de. (B) Aposição dos pronúcleos do es-
permatozóide e do óvulo. (C ) Estágio
bicelular mostrando duas células de tama-
nhos iguais com núcleos bem definidos.
Entulho no espaço perivitelínico são os cor-
pos polares em degeneração. (de Bavister,
1980, cortesia de B. D. Bavister.)
Informações adicionais Especulações&
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 155
TTTTTabela 4.2abela 4.2abela 4.2abela 4.2abela 4.2 Experimentos de transplantes pronucleares
Classe de zigotosClasse de zigotosClasse de zigotosClasse de zigotosClasse de zigotos Número de transplantesNúmero de transplantesNúmero de transplantesNúmero de transplantesNúmero de transplantes Número deNúmero deNúmero deNúmero deNúmero de
reconstruídosreconstruídosreconstruídosreconstruídosreconstruídos OperaçãoOperaçãoOperaçãoOperaçãoOperação bem-sucedidosbem-sucedidosbem-sucedidosbem-sucedidosbem-sucedidos sobreviventesobreviventesobreviventesobreviventesobrevivente
Bimaternal 339 0
Bipaternal 328 0
Controles 348 18
Fonte: McGrath e Solter, 1984.
ovos diplóides de camundongo cuja
herança deriva somente do óvulo
(Kaufman et al., 1977). Essas célu-
las se dividem para formar embri-
ões com medula espinhal, múscu-
los, esqueleto e órgãos, incluindo
corações latejantes. Porém, o de-
senvolvimento não continua e no
dia 10 ou 11 (metade do tempo da
gestação), observam-se profundas
diferenças entre os embriões nor-
mais e os partenogenéticos, esses
deteriorando e ficando grosseira-
mente desorganizados (Figura
4.31). Nem no homem nem no ca-
mundongo o desenvolvimento
pode sercompletado com cromossomos
derivados somente do óvulo.
A hipótese que pronúcleos masculi-
nos e femininos são diferentes, também
ganha apoio de experimentos de trans-
plante pronuclear (Surani e Barton, 1983;
Surani et al., 1986; McGrath e Solter,
1984). Pronúcleos recém-fertilizados de
machos ou fêmeas podem ser removidos
e adicionados a outros ovos recém-ferti-
lizados. (Os dois pronúcleos podem ser
diferenciados nesse estágio, porque o fe-
minino fica debaixo dos corpos polares.)
Assim, podem ser construídos zigotos
com dois pronúcleos masculinos ou dois
femininos. Embora ocorra a clivagem em-
brionária, nenhum desse tipos de ovos
se desenvolvem até o nascimento, ao
passo que alguns ovos controle (con-
tendo um pronúcleo masculino e um fe-
minino de zigotos diferentes) que sofre-
ram tal transplante se desenvolvem nor-
malmente (Tabela 4.20). Ainda mais, os
embriões bimaternos ou bipaternos ces-
sam o desenvolvimento ao mesmo tem-
po que camundongos partenogenéticos.
Portanto, embora os dois pronúcleos
sejam equivalentes em muitos animais,
nos mamíferos existem importantes dife-
renças funcionais entre eles.
A razão para essas mortes embrio-
nárias é que em algumas células somen-
te o alelo de certos genes derivado da
mãe é ativo, enquanto em outras célu-
las somente o alelo de genes derivado
paternalmente é funcional. (Na maioria
dos genes, naturalmente, os alelos deri-
vados do macho e da fêmea são equiva-
lentes e são ativados no mesmo grau
em cada célula. Aqui estamos tratando
de exceções a essa regra Mendeliana.)
Por exemplo, o fator de crescimento in-
sulina-símile II (IGF-II) promove o cres-
cimento de órgãos embrionários e fetais.
Em embriões de camundongos, o alelo
de IGF-II derivado paternalmente é ati-
vo em todo o embrião, ao passo que o
alelo derivado maternalmente é em ge-
ral inativo (exceto em algumas células
neurais). Assim, se um camundongo
herda um alelo mutante IGF-II de sua
mãe, irá se desenvolver até o tamanho
normal (já que o alelo derivado mater-
nalmente não é expresso); porém, se o
mesmo alelo mutante for herdado do pai,
o camundongo terá crescimento preju-
dicado (DeChiara et al., 1991). O padrão
oposto de expressão alélica se encon-
tra para um dos receptores de IGF-II.
Aqui, o gene paterno para o receptor é
mal transcrito, enquanto o alelo mater-
no é ativo (Barlow et al., 1991). As dife-
renças entre os alelos ativos e inativos
são consideradas ser causadas por mo-
dificações do DNA que ocorrem de ma-
neira diferente nos núcleos do óvulo e
do espermatozóide (serão discutidos
posteriormente no Capítulo 11). Como
certos genes importantes para o desen-
volvimento somente são ativos quando
provindos do espermatozóide e outros
tais genes só são ativos quando vêm do
óvulo, tanto pronúcleos maternos como
paternos são necessários para o desen-
volvimento completo dos mamíferos.
Figura 4.31Figura 4.31Figura 4.31Figura 4.31Figura 4.31
(A) Embriões controle e (B) partenogenéti-
cos (dois pronúcleos femininos) de camun-
dongos no 11o dia de gestação. Os camun-
dongos estavam se desenvolvendo na mes-
ma fêmea. Além de serem menores e em de-
terioração, os embriões partenogenéticos
também tinham placentas muito menores. (de
Surani e Barton, 1983, cortesia dos autores.)
156 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Pólo animal
Citoplasma
Cortical
amarelo
Núcleo do
oócito
Material do
núcleo do oócito
Citoplasma
claroGema cinzenta
(A) (B) (C) (D)
Cório Pronúcleo do
espermatozóide
Pronúcleo do
espermatozóide
Material
da gema
Crescente
amarelo
Citoplasma
amarelo
Citoplasma
amareloPólo vegetal
Rearranjo do citoplasma do óvulo
A fertilização pode iniciar deslocamentos radicais nos materiais citoplasmáticos do
óvulo. Esses rearranjos do citoplasma do oócito são muitas vezes cruciais para a
diferenciação nas etapas seguintes do desenvolvimento. Como veremos nos capí-
tulos 13 e 14, o citoplasma do óvulo freqüentemente contém determinantes
morfogenéticos que ficam segregados em células específicas durante a clivagem.
Esse determinantes, em última análise, conduzem à ativação ou repressão de genes
específicos conferindo, dessa maneira, certas propriedades às células que os incor-
poram. O arranjo espacial correto desses determinantes é crucial para o desenvolvi-
mento adequado.
Em algumas espécies, esse rearranjo na orientação pode ser visualizado pela pre-
sença de grânulos pigmentados citoplasmáticos. Um exemplo é o óvulo do tunicado
Styela partita (Conklin, 1905). O ovo não-fertilizado desse animal está apresentado na
Figura 4.32A. Um citoplasma cinzento central está envolvido por uma camada cortical
contendo inclusões lipídicas amarelas. Durante a meiose, a desintegração nuclear
libera uma substância clara que se acumula no hemisfério animal (superior) do óvulo.
Dentro de 5 minutos após a entrada do espermatozóide, o citoplasma interno claro e o
cortical amarelo migram para o hemisfério vegetal (inferior) do óvulo. Quando o pronú-
cleo masculino migra do pólo vegetal para o equador da célula, ao longo do futuro
lado posterior do embrião, as inclusões lipídicas migram com ele. Essa migração forma
um crescente amarelo, que se estende do pólo vegetal ao equador (Figura 4.32B),
trazendo o citoplasma amarelo para a área onde mais tarde células musculares irão se
formar na larva tunicada. O movimento dessas regiões citoplasmáticas depende de
microtúbulos que são gerados pelo centríolo e por uma onda de íons de cálcio que
contraem o citoplasma do pólo animal (Sawada e Schatten, 1989; Speksnijder et al.,
1990; Roegiers et al., 1995).
Movimento citoplasmático também é visto em óvulos de anfíbios. Na rã, um único
espermatozóide pode entrar em qualquer lugar do hemisfério animal; quando o faz,
altera o padrão citoplasmático do óvulo. Originalmente, o óvulo é radialmente simétri-
co em torno do eixo animal-vegetal. Após a entrada do espermatozóide, porém, o
citoplasma cortical (externo) se desloca cerca de 30° relativos ao citoplasma interno,
em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (Manes e Elinson, 1980; Vincent et
al., 1986). Em algumas rãs (como Rana), uma região do óvulo que antes estava coberta
pelo citoplasma cortical escuro do hemisfério animal fica agora exposta (Figura 4.33).
Esse citoplasma subjacente, localizado perto do equador, no lado oposto do ponto de
entrada do espermatozóide, contém grânulos pigmentados difusos e, por isso, tem
aparência cinzenta. Essa região tem sido referida como o crescente cinzento (Roux,
1987; Ancel e Vintenberger, 1948). Como veremos em capítulos subseqüentes, o cres-
cente cinzento demarca a região onde se iniciará a gastrulação em embriões de anfíbios.
Figura 4.32Figura 4.32Figura 4.32Figura 4.32Figura 4.32
Rearranjo citoplasmático no óvulo do
tunicado Styela partita. (A) Antes da fer-
tilização, citoplasma cortical amarelo ro-
deia citoplasma cinzento, tipo gema. (B)
Após a entrada do espermatozóide, o cito-
plasma cortical amarelo e o citoplasma cla-
ro derivado da degradação do núcleo do
oócito escorrem vegetativamente em dire-
ção ao espermatozóide. (C) À medida que
o pronúcleo do espermatozóide migra para
o pólo animal em direção ao pronúcleo do
óvulo, os citoplasmas amarelo e claro os
acompanham. (D) A posição final dos ci-
toplasmas amarelo e claro, marcam os lo-
cais onde as células dão origem ao mesên-
quima e aos músculos, respectivamente.
(Segundo Conklin, 1905.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 157
Em rãs como Xenopus, nas quais não se vê um crescente cinzento, podemos assim
mesmo, observar a rotação do citoplasma cortical em relação à camada interna,
subcortical. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986).
Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o
citoplasma abaixo do córtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (umalectina
ligada à fluoresceína) à superfície do ovo. Quando o ovo foi mantido em sua posição
por inclusão em gelatina, os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30° em
relação às manchas da lectina fluorescente (Figura 4.34). Em ovos normais, não inclu-
sos, a superfície do ovo é considerada girar enquanto o citoplasma subcortical, torna-
do pesado pelas plaquetas de gema, permanece estabilizado por gravidade.
O motor para esses movimentos citoplasmáticos em ovos de anfíbios parece ser
um conjunto de microtúbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical
do hemisfério vegetal, na direção da rotação citoplasmática. Os rastros dos
microtúbulos são primeiramente vistos imediatamente antes do começo da rotação, e
desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4.35; Elinson e Rowning, 1988).
Tratamento do ovo com colchicina ou radiação ultravioleta interrompe a formação
desses microtúbulos, com isso parando as rotações citoplasmáticas. Usando anticorpos
ligantes desses microtúbulos, Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros
eram formados por microtúbulos derivados do espermatozóide e do óvulo, e que o
centríolo espermático direciona sua polimerização, fazendo com que cresçam para o
interior da região vegetal do ovo. Ao atingir o córtex vegetal, esses microtúbulos se
desviam do ponto de entrada do espermatozóide, em direção ao pólo vegetal. A posi-
ção descentralizada do centríolo espermático quando esse inicia a polimerização
microtubular, proporciona direção à rotação. A força motriz para a rotação é possivel-
mente, fornecida pela ATPase cinesina. Tal como a dineína e a miosina, a cinesina
pode fixar-se às fibras e produzir energia pela hidrólise de ATP. Essa ATPase está
localizada nos microtúbulos vegetais e nas membranas do retículo endoplasmático
cortical (Houliston e Elinson, 1991b).
O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda
movimentação nesse último. Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema
Figura 4.33Figura 4.33Figura 4.33Figura 4.33Figura 4.33
Reorganização do citoplasma no ovo recém-fertilizado da rã. (A) Corte transversal
esquemático de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. O ovo tem simetria
radial em torno do seu eixo animal-vegetal. O espermatozóide entrou por um lado e
seu núcleo está migrando para o interior. O córtex está representado como o de Rana,
com um hemisfério animal altamente pigmentado e um hemisfério vegetal transparen-
te. (B) Quando está aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem,
o citoplasma cortical gira cerca de 30o em relação ao citoplasma interno. Essa rotação é
importante porque a gastrulação irá começar na região oposta ao ponto de entrada do
espermatozóide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma. (Segundo Gerhart
et al., 1989.)
(A) (B)
Ponto de
entrada do
espermatozóide
Córtex
Crescente
cinzento
Citoplasma
interno Zona de
deslizamento
158 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
(A)
(C) (D)
(B)
com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante
ligado emite fluorescência vermelha). Durante a parte intermediária do primeiro ciclo
celular, a massa do citoplasma central do ovo flui do presumível lado ventral (abdome),
para o futuro lado dorsal (posterior) do embrião (Prancha 7). Ao fim da primeira divi-
são, o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrião, é distintamente diferen-
te daquele do provável lado ventral. O que havia sido um embrião radialmente simétri-
co, é agora um embrião bilateralmente simétrico.
Como veremos nos Capítulos 6 e 15, esses movimentos citoplasmáticos iniciam
uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da rã. Realmente, os
microtúbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo
do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels, 1975; Gerhart et al., 1983).
Preparação para a ClivagemPreparação para a ClivagemPreparação para a ClivagemPreparação para a ClivagemPreparação para a Clivagem
O aumento dos níveis de íons livres de cálcio intracelular também inicia a movimen-
tação de aparelhagem para a divisão celular. O mecanismo iniciador da clivagem
provavelmente difere entre espécies, dependendo do estágio de meiose em que
Figura 4.34Figura 4.34Figura 4.34Figura 4.34Figura 4.34
Rotação do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfície da célula. (A)
Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante
Azul Nilo (que cora os lípidios nas plaquetas de gema). O ovo foi embebido em
gelatina, e as posições originais de alguns dos pontos marcados na superfície celular
com fluoresceína (círculos em A). O ponto de entrada do espermatozóide está marcado
com um S. (B,C) Com o progredir do primeiro ciclo, os pontos do citoplasma
subcortical mudaram de aproximadamente 30o em relação à superfície externa imobili-
zada do ovo. O local no ovo designando a futura superfície dorsal do embrião está
marcado com um D. (D) Sumário desses movimentos na região vegetal (inferior) do
ovo. (de Vincent et al., 1986, fotografias cortesia de J. C. Gerhart.)
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 159
(A)
(B)
(C)
ocorre a fecundação. No entanto, em todas as espécies estudadas, o ritmo das
divisões celulares é regulado pela síntese e degradação de ciclina. A ciclina mantém
as células em metáfase, e a sua degradação permite às células voltarem para interfase.
Além de suas outras atividades, os íons de cálcio também parecem iniciar a degrada-
ção da ciclina (Watanabe et al., 1991). Uma vez degradada a ciclina, os ciclos de
divisão celular podem se reiniciar.
A clivagem tem uma relação especial com essas regiões citoplasmáticas. Em embri-
ões tunicados, a primeira clivagem secciona o ovo em imagens duplicadas em um
espelho. Desse estágio em diante, cada divisão em um lado do sulco de clivagem tem
uma imagem em espelho do lado oposto. De maneira semelhante, o crescente cinzento
é seccionado pelo sulco da primeira clivagem em ovos de anfíbios. Assim, a posição
da primeira clivagem não é aleatória, mas tende a ser especificada pelo ponto de
entrada do espermatozóide e a subseqüente rotação do citoplasma do ovo. A coorde-
nação do plano de clivagem e dos rearranjos citoplasmáticos é provavelmente media-
da pelos microtúbulos do áster do espermatozóide (Manes et al., 1978; Gerhart et al.,
1981; Elinson, 1985).
Portanto, perto do fim do primeiro ciclo celular , o citoplasma se rearranja, os
pronúcleos se encontram, o DNA está se replicando e novas proteínas estão sendo
sintetizadas. O palco está preparado para o desenvolvimento de um organismo
multicelular. [fert11.html], [other.html#fert13]
Figura 4.35Figura 4.35Figura 4.35Figura 4.35Figura 4.35
Arranjo paralelo de microtúbulos se esten-
dem ao longo do hemisfério vegetal, ao longo
do futuro eixo dorso-ventral. (A) Arranjo pa-
ralelo de microtúbulos vistos na segunda par-
te do primeiro ciclo celular por anticorpos
fluorescente à tubulina. (B) Antes da rotação
citoplasmática (cerca de metade do ciclo) ne-
nhum arranjo pode ser visto. (C) No término
da rotação do citoplasma, os microtúbulos
despolimerizam. (de Elinson e Rowning,
1988, cortesia de R. Elinson.)
LITERATURA CITADA
Abassi, Y. A. and Foltz, K. R. 1994. Tyrosine
phosphorylation of the sperm receptor at ferti-
lization. Dev. Biol. 164: 430-443.
Afzelius, B. A. 1976. A human syndrome caused
by immotile cilia. Science 193: 3173-19.
Almeida, E. A. C. and ten others. 1995. Mouse
egg integrin a α P β functions as a sperm recep-
tor. Cell 81: 1095-1104.
Amos, L. A. and Klug, A. 1974. Arrangement
of subunits in flagellar microtubules. J. Cell
Sci. 14: 523-549.
Ancel, P. and Vintenberger, P. 1948. Re-
c h e r c h e s s u r l e d e t e r m i n i s m e d e l a
symmet r ie b i l a té ra le dans l ’oeuf des
amphibiens. Bull. Biol. Fr. Belg.[Suppl.]
31: 1-182.
Asai, D. J. 1996. Functional and molecular
diversity of dynein heavy chains. Semin. Cell
Dev. Biol. 7: 311-320.
Austin, C. R. 1952. The “capacitation” of
mammalian sperm. Nature 170: 326.
Austin, C. R. 1960. Capacitation and the
release of hyaluronidase. J. Reprod. Fert. 1:
310-311.
160 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Austin, C. R. 1965. Fertilization. PrenticeHall,
Englewood Cliffs, New Jersey.
Ayabe, T., Kopf, G. S. and Schultz, R. M. 1995.
Regulation of mouse egg activation: presence
of ryanodine receptors and effects of microin-
jected ryanodine and cyclic ADP ribose on
uninseminated and inseminated eggs. Develop-
ment 121: 2233-2244.
Baltz, J. M., Katz, D. F. and Cone, R. A. 1988.
The mechanics of sperm-egg interaction at the
zona pellucida. Biophys. J. 54: 643-654.
Barlow, D. P., Stöger, R., Herrmann, B. G., Saito,
K. and Schweifer, N. 1991. The mouse insulin-
like growth factor type-2 receptor is imprinted
and closely linked to the Time locus. Nature
349: 84-87.
Bavister, B. D. 1980. Recent progress in the
study of early events in mammalian fertilizati-
on. Dev. Growth Differ. 22: 385-402.
Bentley, J. K., Shimomura, H. and Garbers, D. L.
1986. Retention of a functional resact receptor
in isolated sperm plasma membranes. Cell 45:
281-288.
Berridge, M. J. 1993. Inositol triphosphate and
calcium signalling. Nature 361: 315-325.
Bestor, T. M. and Schatten, G. 1981. Antitubulin
immunofluorescence microscopy of microtubu-
les present during the pronuclear movements of
sea urchin fertilization. Dev. Biol. 88: 80-91.
Bi, G.-Q., Alderton, J.M. and Steinhardt, R.A. 1995.
Calcium-mediated exocytosis is required for cell
membrane resealing. J. Cell Biol. 131:1747-1758.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1980.
Mammalian sperm and egg interaction: Identi-
fication of a glycoprotein in mouseegg zonae
pellucidae possessing receptor activity for sperm.
Cell 20: 873-882.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1986.
Autoradiographic visualization of the mouse
egg’s sperm receptor bound to sperm. J. Cell
Biol. 102:1363-1371.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1988.
Galactose at the nonreducing terminus of O-
linked oligosaccharides of mouse egg zona
pellucida glycoprotein ZP3 is essential for the
glycoprotein’s sperm receptor activity. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 6778-6782.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1990. Identi-
fication of a ZP3-binding protein on acrosome-
intact mouse sperm by photoaffinity crosslin-
king. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5563-5567.
Bleil, J. D., Greve, J. M. and Wassarman, P, M.
1988. Identification of a secondary sperm re-
ceptor in the mouse egg zona pellucida: Role in
maintenance of binding of acrosome-reacted
sperm to eggs. Dev. Biol. 28: 376-385.
Blobel, C. P, Wolfsberg, T. G., Turck, C. W.,
Myles, D. G., Primakoff, P. and White, J. M.
1992. A potential fusion peptidle and an integrin
domain in a protein active in spermegg fusion.
Nature 356: 248-251.
Bogart, J. P., Elinson, R. P. and Licht, L. E.
1989. Temperature and sperm incorporation in
polyploid salamanders. Science 246: 1032-1034.
Bookbinder, L. H., Cheng, A., and Bleil, J. D.
1995. Tissue- and species-specific expression
of sp56, a mouse sperm fertilization protein.
Science 269: 86-87.
Boveri, T. 1902. On multipolar mitosis as a means
of analysis of the cell nucleus. (Translated by S.
Gluecksohn-Waelsch.) In B. H. Willier and J. M.
Oppenheimer (eds.), Foundations of Experimen-
tal Embryology. Hafner, New York, 1974.
Boveri, T. 1907. Zellenstudien VI. Die Entwi-
cklung dispermer Seeigeleier. Ein Beiträge zur
Befruchtungslehre und zur Theorie des Kernes.
Jena Z. Naturwiss. 43: 1-292.
Braden, A. W. H. and Austin, C. R. 1954. The
number of sperm about the eggs in mammals
and its significance for normal fertilization. Aust.
J. Biol. Sci. 7: 543-551.
Burks, D. J., Carballacla, R., Moore, H. D. M.
and Saling, P. M. 1995. Interaction of a tyrosine
kinase from human sperm with the zona pellucida
at fertilization. Science 269: 83-86.
Busa, W. B., Ferguson, J. E., Joseph, S. K.,
Williamson, J. R. and Nuccitelli, R. 1985.
Activation of frog (Xenopus laevis) eggs by
inositol triphosphate. I. Characterization of Ca2+
release from intracellular stores. J. Cell Biol.
100: 677-682.
Calvin, H. I. and Bedford, J. M. 1971. Formati-
on of disulfide bonds in the nucleus and accessory
structures of mammalian spermatozoa during
maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil.
[Suppl.] 13: 65-75.
Carroll, E. J. and Epel, D. 1975. Isolation and
biological activity of the proteases released by
sea urchin eggs following fertilization. Dev. Biol.
44: 22-32.
Chambers, E. L., Pressman, B. C. and Rose, B.
1974. The activity of sea urchin eggs by the
divalent ionophores A23187 and X 537A.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 60: 126-132.
Chandler, D. E. and Heuser, J. 1979. Membrane
fusion during secretion: Cortical granule exocytosis
in sea urchin eggs as studied by quick-freezing and
freeze fracture. J. Cell Biol. 83: 91-108.
Chang, M. C. 1951. Fertilizing capacity of
spermatozoa deposited into the fallopian tubes.
Nature 168: 697-698.
Cherr, G. N., Lambert, H., Meizel, S. and Katz,
D. F. 1986. In vitro studies of the golden hamster
sperm acrosomal reaction: Completion on zona
pellucida and induction by homologous zonae
pellucidae. Dev. Biol. 114:119-131.
Ciapa, B. and Whitaker, M. 1986. Two
phases of inosi to l polyphosphate and
diacylglycerol production at fertilization.
FEBS Lett. 195: 347-351.
Clermont, Y. and Leblond, C. P. 1955. Spermi-
ogenesis of man, monkey, and other animals as
shown by the “periodic acidSchiff” technique.
Am. J. Anat. 96: 229-253.
Colwin, A. L. and Colwin, L. H. 1963. Role of
the gamete membranes in fertilization in
Saccoglossus kowalevskii (Enteropneustra). I.
The acrosome reaction and its changes in early
stages of fertilization. J. Cell Biol. 19: 477-500.
Colwin, L. H. and Colwin, A. L. 1960. Formation of
sperm entry holes in the vitelline membrane of
Hydroides hexagonis (Annelida) and evidence of their
lytic origin. J. Biophys. Biochem. Cytol. 7: 315-320.
Conklin, E. G. 1905. The orientation and cell-
lineage of the ascidian egg. J. Acad. Nat. Sci.
Phila. 13: 5-119.
Cook, S. P. and Babcock, D. F. 1993. Selective
modulation by cGMP of the K+ channel activated
by speract. J. Biol. Chem. 268: 22402-22407.
Corselli, J. and Talbot, P. 1987. In vivo
penetration of hamster oocyte-cumulus com-
plexes using physiological numbers of sperm.
Dev. Biol. 122: 227-242.
Cross, N. L. and Elinson, R. P. C. 1980. A fast
block to polyspermy in frogs mediated by
changes in the membrane potential. Dev. Biol.
75:187-198.
Dan, J. C. 1967. Acrosome reaction and lysins. In
C. B. Metz and A. Monroy (eds.), Fertilization,
Vol. 1. Academic Press, New York, pp. 237-367.
Danilchik, M. V. and Denegre, J. M. 1991. Deep
cytoplasmic rearrangements during early deve-
lopment in Xenopus laevis, Development Ill:
845-856.
Davis, B. K. 1981. Timing of fertilization in
mammals: Sperm cholesterol/ phospholipid ratio
as determinant of capacitation interval. Proc.
Nall. Acad. Sci. USA 78: 7560-7564.
Dawid, I. B. and Blackler, A. W. 1972. Maternal
and cytoplasmic inheritance of mitochondria in
Xenopus. Dev. Biol. 29: 152-161.
DeChiara, T. M., Robertson, E. J. and Efstradiatis,
A. 1991. Parental imprinting of the mouse insulin-
like growth factor II gene. Cell 64: 849-859.
De Robertis, E. D. P., Saez, F. A. and De Robertis,
E. M. F. 1975. Cell Biology, 6th Ed., Saunders,
Philadelphia.
Dube, F., Schmidt, T., Johnson, C. H. and Epel,
D. 1985. The hierarchy of requirements for an
elevated pH during early development of sea
urchin embryos. Cell 40: 657-666.
Eisen, A . and Reynolds, G. T. 1985. Sources and
sinks for the calcium release during fertilization ofsingle sea urchin eggs. J. Cell Biol. 100: 1522-1527.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 161
Eisenbach, M. 1995. Sperm changes enabling
fertilization in mammals. Curr. Opin. Endocri-
nol. Diabetes 2: 468-475.
Elinson, R. P. 1985. Changes in levels of
polymeric tubulin associated with activation and
dorsoventral polarization of the frog egg. Dev.
Biol. 109: 224-233.
Elinson, R. P. 1986. Fertilization in amphibians:
The ancestry of the block to polyspermy. Int.
Rev. Cytol. 101: 59-100.
Elinson, R. P. and Rowning, B. 1988. A transient
array of parallel microtubules in frog eggs:
Potential tracks for a cytoplasmic rotation that
specifies the dorso-ventral axis. Dev. Biol.
128:185-197.
Endo, Y. G., Kopf, G. S. and Schultz, R. M.
1987. Effects of phorbol ester on mouse eggs:
Dissociation of sperm receptor activity from
acrosome reaction-inducing activity of the
mouse zona pellucida protein, ZP3. Dev. Biol
123: 574-577
Epel, D. 1977. The program of fertilization.
Sci. Am. 237(5): 128-138.
Epel, D. 1980. Fertilization. Endeavour N.S. 4:
26-31.
Epel, D., Patton, C., Wallace, R. W. and Cheung,
W. Y. 1981. Calmodulin activates NAD kinase
of sea urchin eggs: An early response. Cell 23:
543-549.
Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S. and
Snyder, S. H. 1989. Purified inositol 1,4,5-
trisphosphate receptor mediates calcium flux in
reconstituted lipid vesicles. Nature 342: 87-89.
Florman, H. M. 1995. Sequential focal and glo-
bal elevations of sperm intracellular Ca2+ are
initiated by the zona pellucida during acrosomal
exocytosis. Dev. Biol. 165: 152-164.
Florman, H. M. and Storey, B. T. 1982. Mouse
gamete interactions: The zona pellucida is the
site of the acrosome reaction leading to fertili-
zation in vitro. Dev. Biol. 91:121-130.
Florman, H. M. and Wassarman, P. M. 1985.
O-linked oligosaccharides of mouse egg ZP3
account for its sperm receptor activity. Cell
41: 313-324.
Florman, H. M., Bechtol, K. B. and Wassarman,
P. M. 1984. Enzymatic dissection of the
functions of the mouse egg’s receptor for sperm.
Dev. Biol. 106: 243-255.
Florman, H, M., Corron, M. E., Kim, T. D. H.
and Babcock, D. F. 1992. Activation of voltage-
dependent calcium channels of mammalian
sperm is required for zona pellucida-induced
acrosomal exocytosis. Dev. Biol. 152: 304-314.
Foerder, C. A. and Shapiro, B. M. 1977. Release
of ovoperoxiclase from sea urchin eggs hardens
fertilization membrane with tyrosine crosslinks.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4214-4218.
Fol, H. 1877. Sur le commencement de I’hémo-
génie chez divers animaux. Arch. Zool. Exp. Gén.
6: 145-169.
Foltz, K. R., Partin, J. S. and Lennarz, W. J.
1993. Sea urchin egg receptor for sperim:
Sequence similarity of binding domain to hsp70.
Science 259: 1421-1425.
Franklin, L. E. 1970. Fertilization and the role
of the acrosomal reaction in non-mammals.
Biol. Reprod. [Suppl.] 2:159-176.
Fulton, B. P. and Whittingham, D. G. 1978.
Activation of mammalian oocytes by intracellu-
lar injection of calcium. Nature 273: 149-151.
Furuichi, T., Yoshikawa, S., Miyawaki, A., Wada,
K., Maeda, N. and Mikoshiba, K. 1989. Primary
structure and functional expression of the
inositol 1,4,5-trisphosphatebinding protein
P400. Nature 342: 32-38.
Garbers, D. L., Tubb, D. J. and Kopf, G. S. 1980.
Regulation of sea urchin sperm cAMP-dependent
protein kinases by an egg associated factor. Biol.
Reprod. 22: 526-532.
Garbers, D. L., Kopf, G. S., Tubb, D, J, and Olson,
G. 1983. Elevation of sperm adenosine 3':5'-
monophosphate concentrations by a fucose
sulfate-rich complex associated with eggs. I.
Structural characterization. Biol. Reprod. 29:
1211-1220.
Gardiner, D. M. and Grey, R. D. 1983. Membrane
junctions in Xenopus eggs: Their distribution
suggests a role in calcium regulation. J. Cell Biol.
96: 1159-1163.
Gerhart, J., Ubbels, G., Black, S., Hara, K. and
Kirschner, M. 1981. A reinvestigation of the
role of the grey crescent in axis formation in
Xenopus laevis. Nature 292: 511-516.
Gerhart, J., Black, S., Gimlich, R. and Scharf, S.
1983. Control of polarity in the amphibian egg.
In W. R. Jeffery and R. A. Raft (eds.), Time,
Space, and Pattern in Embryonic Development.
Alan R. Liss, New York, pp. 261-286.
Gerhart, J., Danilchik, M., Doniach, T.,
Roberts, S., Rowning, B. and Stewart, R. 1989.
Cortical rotation of the Xenopus egg: Conse-
quences for the anterioposterior pattern of
embryonic dorsal development. Development
1989 [Suppl.]: 37-51.
Giles, R. E., Blanc, H., Cann, H. M. and Wallace,
D. C. 1980. Maternal inheritance of human
mitochondrial DNA. Proc. Natl, Acad. Sci. USA
77: 6715-6719.
Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. G. and
Reynolds, G. T. 1978. A free calcium wave
traverses the activating egg of the medaka,
Oryzias latipes. J. Cell Biol. 76: 448-466.
Ginzburg, A. S. 1985. Phylogenetic changes in
the type of fertilization. In J. Mlékovsky and V.
J. A. Novák (eds.), Evolution and Morphogene-
sis. Academia, Prague, pp. 459-466.
Glabe, C. G. 1985. Interaction of the sperm
adhesive protein, bindin, with phospholipid
vesicles. II. Bindin induces the fusion of mixed-
phase vesicles that contain phosphatidylcholine
and phosphatidylserine in vitro. J. Cell Biol.
100: 800-806.
Glabe, C. G. and Lennarz, W. J. 1979. Species-
specific sperm adhesion in sea urchins: A
quantitative investigation of bindin-mediated egg
agglutination. J. Cell Biol. 83: 595-604.
Glabe, C. G. and Vacquier, V. D. 1977. Species-
specific agglutination of eggs by bindin isolated
from sea urchin sperm. Nature 267: 836-838.
Glabe, C. G. and Vacquier, V. D. 1978. Egg
surface glycoprotein receptor for sea urchin
sperm bindin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75: 881-885.
Gong, X., Dubois, D.H., Miller, D. J., and Shur, B.
D. 1995. Activation of a G protein complex by
aggregation of β -1,4-galactosyltransferase on the
surface of sperm. Science 269: 1718-1721.
González-Martfnez, M. T., Guerrero, A.,
Morales, E., de la Torre, L. and Darszon, A.
1992. A depolarization can trigger Ca2+ uptake
and the acrosome reaction when preceded by a
hyperpolarization in L. pictus sea urchin sperm.
Dev. Biol. 150: 193-202.
Gould, M. and Stephano, J. L. 1987. Electrical
response of eggs to acrosomal protein similar to
those induced by sperm. Science 235: 1654-1656.
Gould, M. and Stephano, J. L. 1991. Peptides
from sperm acrosomal protein that activate de-
velopment. Dev. Biol. 146: 509-518.
Gould-Somero, M., Jaffe, L. A. and Holland, L.
Z. 1979. Electrically mediated fast polyspermy
block in eggs of the marine worm, Urechis
caupo. J. Cell Biol. 82: 426-440.
Green, G. R. and Poccia, E. L. 1985. Phos-
phorylation of sea urchin sperm H1 and H2B
histories precedes chromatin decondensation
and H1 exchange during pronuclear formation.
Dev. Biol. 108: 235-245.
Gross, P. R., Malkin, L. I., and Moyer, W. 1964.
Templates for the first proteins of embryonic
development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51:
407-414.
Gundersen, G. G., Medill, L. and Shapiro, B. M.
1986. Sperm surface proteins are incorporated
into the egg membrane and cytoplasm after fer-
tilization. Dev. Biol. 113: 207-217.
Gwatkin, R. B. L. 1976. Fertilization. In G.
Poste and G. L. Nicolson (eds.), The Cell
Surface in Animal Embryogenesis and
Deveopment. Elsevier North-Holland, New
York, pp. 1-53.
Gyllensten, U., Wharton, D., Josefson, A.
and Wilson, A. 1991. Paternal inheritance
of mitochondrial DNA in mice. Nature 352:
255-258.
162 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J.
B., Kramp, D. and Schatten, G. 1988. Wave of
free calcium at fertilization in the sea urchin egg
visualized with Fura-2. Cell Motil. Cytoskel. 9:
271-277.
Hall, C. G., Sancho, J., and Terhorst, C. 1993.
Reconstitution of T cell receptor ζ -mediated
calcium mobilization innonlymphoid cells.
Science 261: 915-918.
Hamaguchi, M. S. and Hiramoto, Y. 1980. Fertili-
zation process in the heart-urchin, Clypaester
japonicus, observed with a differential interferen-
ce microscope. Dev. Growth Differ. 22: 517-530.
Hamaguchi, M. S. and Hiramoto, Y. 1981.
Activation of sea urchin eggs by microinjection
of calcium buffers. Exp. Cell Res, 134: 171-179.
Hardy, D. M., Harumi, T. and Garbers, D. L.
1994. Sea urchin sperm receptors for egg
peptides. Sem. Dev. Biol. 5: 217-224.
Hartsoeker, N. 1694. Essai de dioptrique. Paris.
Heinecke, J. W. and Shapiro, B. M. 1989.
Respiratory oxygen burst of fertilization. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86: 1259-1263.
Hertwig, 0. 1877. Beiträge zur Kenntniss der
Bildung, Befruchtung, und Theilung des
theirischen Eies. Morphol. Jahr. 1: 347-452.
Hollinger, T. G. and Schuetz, A. W. 1976.
“Cleavage” and cortical granule breakdown in
Rana pipiens oocytes induced by direct micro-
injection of calcium. J. Cell Biol. 71: 395-401.
Hong, K. and Vacquier, V. D. 1986. Fusion of
liposomes induced by a cationic protein from
the acrosomal granule of abalone spermatozoa.
Biochemistry 25: 543-549.
Houliston, E. and Elinson, R. P. 1991a. Patterns
of microtubule polymerization relating to
cortical rotation in Xenopus laevis eggs. Deve-
lopment 112:107-117.
Houliston, E. and Elinson, R. P. 1991b.
Evidence for the involvement of microtubu-
les, endoplasmic reticulum, and kinesin in
cortical rotation of fertilized frog eggs. J. Cell
Biol. 114: 1017-1028.
Humphreys, T. 1971. Measurements of mes-
senger RNA entering polysomes upon fertiliza-
tion in sea urchins. Dev. Biol. 26: 201-208.
Hunter, R. H. F. 1989. Ovarian programming
of gamete progression and maturation in the
female genital tract. Zool. J. Linn. Soc. 95:
117-124.
Hylander, B. L. and Summers, R. G. 1982. An
ultrastructural and immunocytochemical locali-
zation of hyaline in the sea urchin egg. Dev.
Biol. 93: 368-380.
Iwao, Y. and Jaffe, L. A. 1989. Evidence that
the voltage-dependent component in the ferti-
lization porcess is contributed by the sperm. Dev.
Biol. 134: 446-451.
Jacobs, P. A., Wilson, C. M., Sprenkle, J. A.,
Rosenshein, N. B. and Migeon, B. R. 1980.
Mechanism of origin of complete hydatidiform
moles. Nature 286: 714-716.
Jaffe, L. A. 1976. Fast block to polyspermy
in sea urchins is electrically mediated. Nature
261: 68-71.
Jaffe, L. A. 1980. Electrical polyspermy block
in sea urchins: Nicotine and low sodium
experiments. Dev. Growth Differ. 22: 503-507.
Jaffe, L. A. 1996. Egg membranes during fertili-
zation. In S. G. Schultz et al. (eds.), Molecular
Biology of Membrane Transport Disorders.
Plenum, NY, pp. 367-378.
Jaffe, L. A. and Cross, N. L. 1983. Electrical
properties of vertebrate oocyte membranes. Biol.
Reprod. 30: 50-54.
Jaffe, L. A. and Gould, M. 1985. Polyspermy-
preventing mechanisms. Biol. Fert. 3: 223-250.
Jaffe, L. F. 1983. Sources of calcium in egg
activation: A review and hypothesis. Dev, Biol.
99: 265-276.
Jones, R., Brown, C. R. and Lancaster, R. T.
1988. Carbohydrate-binding properties o boar
sperm proacrosin and assessment of its role in
sperm-egg recognition and adhesion during fer-
tilization. Development 102: 781-792.
Just, E. E. 1919. The fertilization reaction in
Echinarachinus parma. Biol. Bull. 36: 1-10.
Kaufman, M. H., Barton, S.C. and Surani, M. A.
H. 1977. Normal postimplantation development
of mouse parthenogenetic embryos to the
forelimb bud stage. Nature 265: 53-55.
Keller, S. H. and Vacquier, V. D. 1994a. Nlinked
oligosaccharides of sea urchin egg jelly induces
the sperm acrosome reaction. Dev. Growth
Differ. 36: 551-556.
Keller, S. H. and Vacquier, V. D. 1994b. The
isolation of acrosome-reaction-inducing
glycoproteins from sea urchin egg jelly. Dev.
Biol. 162: 304-312.
Klag, J. J. and Ubbels, G. A. 1975. Regional
morphological and cytochemical differentiati-
on of the fertilized egg of Discoglossus pictus
(Anura). Differentiation 3: 15-20.
Kline, D. 1988. Calcium-dependent events
at fertilization of the frog egg: Injection of
a calcium buffer blocks ion channel opening,
exocytosis, and formation of pronuclei. Dev.
Biol. 126: 346-361.
Kline, D., Simoncini, L., Mandel, G., Maue, R., Kado,
R. T. and Jaffe. L. A. 1988. Fertilization events
induced by neurotransmitters after injection of
mRNA into Xenopus eggs. Science 241: 464-467.
Kline, D, Kopf, G., Muncy, L. F. and Jaffe, L. A.
1991. Evidence for the involvement of a pertussis
toxin-insensitive G-protem in egg activation of
the frog Xenopus laevis. Dev. Biol. 143: 218-229.
Kvist, U., Afzelius, B. A. and Nilsson, L. 1980.
The intrinsic mechanism of chromatin decon-
densation and its activation in human sperma-
tozoa. Dev. Growth Differ. 22: 543-554.
Langlais, J., Kan, F. W. K., Granger, L.,
Raymond, L., Bleau, G. and Roberts, K. D.
1988. Identification of sterol acceptors that
stimulate cholesterol efflux from human
spermatozoa during in vitro capacitation.
Gamete Res, 20: 185-201.
Lechleiter, J. D. and Clapham, D. E. 1992. Molecular
mechanisms of intracellular calcium excitability in
X. laevis oocytes. Cell 69: 283-294.
Leeuwenhoek, A. van. 1685. Letter to the Royal
Society of London. Quoted in E. G. Ruestow,
1983, Images and ideas: Leeuwenhoek’s
perception of the spermatozoa. J. Hist. Biol.
16:185-224.
Levine, A. E., Walsh, K. A. and Fodor, E. J. B.
1978. Evidence of an acrosin-like enzyme in
sea urchin sperm. Dev. Biol. 63: 299-306.
Leyton, L. and Saling, P. 1989a. 95 kd sperm
proteins bind ZP3 and serve as tyrosine kinase
substrates in response to zona binding. Cell 57:
1123-1130.
Leyton, L. and Saling, P. 1989b. Evidence that
aggregation of mouse sperm receptors by ZP3
triggers the acrosome reaction. J. Cell Biol. 108:
2163-2168.
Leyton, L., Leguen, P., Bunch, D. and Saling, P.
M. 1992. Regulation of mouse gametic interac-
tion by a sperm tyrosine kinase. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 1164-1169.
Longo, F. J. 1986. Surface changes at fertilizati-
on: Integration of sea urchin (Arbacia punctu-
lata) sperm and oocyte plasma membranes. Dev.
Biol. 116: 143-159.
Longo, F. J. and Kunkle, M. 1978. Transforma-
tion of sperm nuclei upon insemination. In A.
A. Moscona and A. Monroy (eds.), Current Topics
in Developmental Biology, Vol. 12. Academic
Press, New York, pp. 149-184.
Longo, F. J., Lynn, J. W., McCulloh, D. H. and
Chambers, E. L. 1986. Correlative ultrastructural
and electrophysiological studies of sperm-egg
interactions of the sea urchin Lytechinus
variegatus. Dev. Biol. 118: 155-166.
Lopez, L. C., Bayna, E. M., Litoff, D., Shaper,
N. L., Shaper, J. H. and Shur, B. D. 1985. Recep-
tor function of mouse sperm surface galactosyl-
transferase during fertilization. I. Cell Biol. 101:
1501-1510.
Luttmer, S. and Longo, F. J. 1985. Ultrastructural
and morphometric observations of cortical
endoplasmic reticulum in Arbacia, Spisula, and
mouse eggs. Dev. Growth Differ. 27: 349-359.
Manes, M.E. and Elinson, R.P. 1980. Ultraviolet
light inhibits gray crescent formation in the frog
egg. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 189: 73-76.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 163
Manes, M. E., Elinson, R. P. and Barbieri, F. D.
1978. Formation of the amphibian gray crescent:
Effects of colchicine and cytochalasin-B.
Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 185: 99-104.
McCulloh, D. H. and Chambers, E. L. 1992.
Fusion of membranes during fertilization. J. Gen.
Physiol. 99:137-175.
McGrath, J. and Solter, D. 1984. Completion of
mouse embryogenesis requires both the mater-
nal and paternal genome. Cell 37: 179-183.
McPherson, S. M., McPherson, P. S., Mathews,
L., Campbell, K. P. and Longo, F. J. 1992.
Cortical localization of a calcium release channel
in sea urchin eggs. J. Cell Biol. 116: 111-1121.
Mead, K. S. and Epel, D. 1995. Beakers and
breakers:how fertisation in the laboratory differs
from fertisation in nature. Zygote 3: 95-99.
Meizel, S. 1984. The importance of hydro-
lytic enzymes to an exocytotic event, the
mammalian sperm acrosome reaction. Biol.
Rev. 59: 125-157.
Metz, C. B. 1978. Sperm and egg receptors
involved in fertilization. Curr. Top. Dev. Biol.
12:107-148.
Miller, D. J., Macek, M. B. and Shur, B. D. 1992.
Complementarity between sperm surface β-1,4-
galactosyltransferase and egg-coat ZP3 mediates
sperm-egg binding. Nature 357: 589-593.
Miller, D.L., Gong, X., Decker, G. and Shur, B.
D. 1993. Egg cortical granule N-acetylglucosa-
minidase is required for the mouse zona block to
polyspermy. J. Cell Biol. 123: 1431-1440.
Miller, R. L. 1978. Site-specific agglutination
and the timed release of a sperm chemoattractant
by the egg of the leptomedusan, Orthopyxis
caliculata. J. Exp. Zool. 205: 385-392.
Miller, R. L. 1985. Sperm chemo-orientation in
the metazoa. In C. B. Metz, Jr. and A. Monroy
(eds.), Biology of Fertilization, Vol. 2. Academic
Press, New York, pp. 275-337.
Miyazaki, S. and Igusa, Y. 1981. Fertilizati-
on potential in golden hamster eggs consists
of recurring hyperpolarizations. Nature 290:
702-704.
Miyazaki, S.-I, Yuzaki, M., Nakada, K.,
Shirakawa, H., Nakanishi, S., Nakade, S. and
Mikoshiba, K. 1992. Block of Ca2+ wave and
Ca2+ oscillation by antibody to the inositol 1,4,5-
trisphosphate receptor in fertilized hamster eggs.
Science 257: 251-255.
Mohri, T., Ivonnet, P. I. and Chambers, E.
L. 1995. Effect of sperm-induced activation
current and increase of cytosolic Ca2+ by
agents that modify the mobilization of
[Ca2+]
i
 I. Heparin and pentosan polysulfate.
Dev. Biol. 172: 139-157.
Moller, C. C. and Wassarman, P. M. 1989. Cha-
racterization of a proteinase that cleaves zona
pellucida glycoprotein ZP2 following activation
of mouse eggs. Dev. Biol. 132: 103-112.
Moore, G. D., Kopf, G. S. and Schultz, R M. 1993.
Complete mouse egg activation in the absence of
sperm by stimulation of an exogenous G protein-
coupled receptor. Dev. Biol. 159: 669-678.
Moore, G. D., Ayabe, T., Visconti, P. E., Schultz,
R. M. and Kopf, G. 1994. Roles of heteromeric
and monomeric G proteins in sperm-induced
activation of mouse eggs. Development 120:
3313-3323.
Moy, G. W. and Vacquier, V. D. 1979. Immuno-
peroxidase localization of bindin during the
adhesion of sperm to sea urchin eggs. Curr. Top.
Dev. Biol. 13: 31-44.
Mozingo, N. M. and Chandler, D. E. 1991.
Evidence for the existence of two assembly
domains within the sea urchin fertilization en-
velope. Dev. Biol. 146: 148-157.
Multigner, L., Gagnon, J., Dorsselaer, A. van
and Job, D. 1992. Stabilization of sea urchin
flagellar microtubules by histone H1. Nature 360:
33-39.
Myles, D. G., Kimmel, L. H., Blobel, C. P.,
White, J. M. and Primakoff, P. 1994. Identifi-
cation of a binding site in the disintegrin domain
of fertilin required for sperm-egg fusion. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 4195-4198.
Nishizuka, Y. 1986. Studies and perspectives of
protein kinase C. Science 233: 305-312.
Ogawa, K., Mohri, T. and Mohri, H. 1977. Iden-
tification of dynein as the outer arms of sea
urchin sperm axonomes. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74: 5006-5010.
Ohama, K., Kajii, T., Okamoto, E., Fukada Y.,
Imaizumi, K., Tsukahara, M., Kobayashi, K. and
Hagiwara, K. 1981. Dispermic origin of XY
hydaticliform moles. Nature 292: 551-552.
Olds, J. L. and thirteen others. 1995. Imaging
protein kinase C activation in living sea urchin
eggs after fertilization. Dev. Biol. 172: 675-682.
Parrington, J., Swann, K., Shevchenko V. I., Sesay,
A. K. and Lai, F. A. 1996. Calcium os cillations
in mammalian eggs triggered by a soluble sperm
protein. Nature 379: 364-368.
Perreault, S. D., Barbee, R. R., and Slott, V. L.
1988. Importance of glutathione in the acquisi-
tion and maintainance of sperm nuclear
decondensing activity in maturing hamster
oocytes. Dev. Biol. 125: 181-186.
Pinto-Correia, C. 1997. The Ovary of Eve: Eggs
and Sperm and Preformation. University of
Chicago Press, Chicago.
Poccia, D., Salik, J. and Krystal, G. 1981.
Transitions in histone variants of the male
pronucleus following fertilization and evidence
for a maternal store of cleavagestage histones
in the sea urchin egg. Dev. Biol. 82: 287-296.
Poirier, G. R. and Jackson, J. 1981. Isolation
and characterization of two proteinase inhibitors
from the male reproductive tract of mice.
Gamete Res. 4: 555-569.
Porter, D. C. and Vacquier, V. D. 1986. Phos-
phorylation of sperm histone HI is induced by
the egg jelly layer in the sea urchin Strongylo-
centrotus purpuratus. Dev. Biol. 116: 203-212.
Prevost , J . L. and Dumas, J . B. 1824.
Deuxieme mémoire sur la génération. Ann.
Sci. Nat. 2: 129-149.
Primakoff, P., Hyatt, H. and Tredick-Kline, J.
1987. Identification and purification of a sperm
cell surface protein with a potential role in
sperm-egg membrane fusion. 1. Cell Biol. 104:
141-149.
Primakoff, P., Lathrop, W., Woolman, L.,
Cowan, A. and Myles, D. 1988. Fully effective
contraception in male and female guinea pigs
immunized with the sperm protein PH-20.
Nature 335: 543-546.
Ralt, D. and eight others. 1991. Sperm attraction
to a follicular factor(s) correlates with human
egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 2840-2844.
Ramarao, C. S. and Garbers, D. L. 1985. Recep-
tor-mediated regulation of guanylate cyclase
activity in spermatozoa. J. Biol. Chem. 260:
8390-8396.
Ravnik, S. E., Zarutskie, P. W. and Muller, C. H.
1992. Purification and characterization of a
human follicular fluid lipid transfer protein that
stimulates human sperm capacitation. Biol.
Reprod. 47: 1126-1133.
Roegiers, F., McDougall, A. and Sardet, C. 1995.
The sperm entry point defines the orientation
of the calcium-induced contraction wave that
directs the first phase of cytoplasmic reorgani-
zation in the ascidian egg. Development 121:
3457-3466.
Rossignol, D. P., Earles, B. J., Decker, G. L. and
Lennarz, W. J. 1984. Characterization of the sperm
receptor on the surface of eggs of Strongylocen-
trotus purpuratus. Dev. Biol. 104: 308-321.
Roux, W. 1887. Beiträge zur Entwicklungsmecha-
nik des Embryo. Arch. Mikrosk. Anat. 29: 157-212.
Saling, P. M. 1989. Mammalian sperm interac-
tion with extracellular matrices of the egg.
Oxford Rev. Reprod. Biol. 11: 339-388.
Saling, P. M., Sowinski, J. and Storey, B. T. 1979.
An ultrastructural study of epididymal mouse
spermatozoa binding to zonae pellucida in vitro:
Sequential relationship to acrosome reaction. J.
Exp. Zool. 209: 229-238.
Sawada, T. and Schatten, G. 1989. Effects of
cytoskeletal inhibitors on ooplasmic segregation
and microtubule organization during fertilizati-
on and early development in the ascidian
Molgula occidentalis. Dev. Biol. 132: 331-342.
164 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Schackmann, R. W. and Shapiro, B. M. 1981. A
partial sequence of ionic changes associated with
the acrosome reaction of Strongylocentrotus
purpuratus. Dev. Biol. 81: 145-154.
Schatten, G. and Mazia, D. 1976. The penetration
of the spermatozoan through the sea urchin egg
surface at fertilization: Observations from the
outside on whole eggs and from the inside on isolated
surfaces. Exp. Cell Res. 98: 325-337.
Schatten, G. and Schatten, H. 1983. The
energetic egg. The Sciences 23(5): 28-35.
Schatten, H. and Schatten, G. 1980. Surface activity
at the plasma membrane during sperm incorporation
and its cytochalasin-B sensitivity: Scanning electron
micrography and time-lapse video microscopy du-
ring fertilization of the sea urchin Lytechinus
variegatus. Dev. Biol. 78: 435-449.
Schroeder, T. E. 1979. Surface area change at
fertilization: Resorption of the mosaic
membrane. Dev. Biol. 70: 306-326.
SeGall, G. K. and Lennarz, W. J. 1979. Chemical
characterizationof the component of the jelly
coat from sea urchin eggs responsible for
induction of the acrosome reaction. Dev. Biol.
71: 33-48.
Shen, S. S. and Buck, W. R. 1990. A synthestic
peptide of the pseudosubstrate domain of protein
kinase C blocks cytoplasmic alakalinization du-
ring activation of the sea urchin egg. Dev. Biol.
140: 272-280.
Shen, S. S. and Burgart, L. J. 1986. 1,2-
Diacylglycerols mimic phorbol 12-myristate 13-
acetate activation of the sea urchin egg. J. Cell.
Physiol. 127: 330-340.
Shen, S. S. and Steinhardt, R. A. 1978. Direct
measurement of intracellular pH during meta-
bolic depression of the sea urchin egg. Nature
272: 253-254.
Shilling, F. M., Carroll, D. J., Muslin, A. J.,
Escobodo, J. A., Williams, L. T. and Jaffe, L. A.
1994. Evidence for both tyrosine kinase and G-
protein-coupled pathways leading to starfish egg
activation. Dev. Biol. 162: 590-599.
Shimomura, H., Dangott, L. J. and Garbers,
D. L. 1986. Covalent coupling of a resact
analogue to guanylate cyclase. J. Biol. Chem.
261: 15778-15782.
Shur, B. D. and Hall, N. G. 1982a. Sperm surface
galactosyltransferase activities during in vitro
capacitation. J. Cell Biol. 95: 567-573.
Shur, B. D. and Hall, N. G. 1982b. A role for
mouse sperm surface galactosyltransferase in
sperm binding for the egg zona pellucida. J. Cell
Biol. 95: 574-579.
Shur, B. D. and Neely, C. A. 1988. Plasma
membrane association, purification, and
partial characterization of mouse sperm β
1,4-galactosyltransferase. J. Biol. Chem.
263: 17706-17714.
Simerly, C. and ten others. 1994. The paternal
inheritance of the centrosome, the cell’s micro-
tubule-organizing center, in humans, and the
implications for infertility. Nat. Med. 1: 1-10.
Sluder, G., Miller, F. J., Lewis, K., K., Davison,
E. D. and Reider, C. L. 1989. Centrosome
inheritance in starfish zygotes: Selective loss of
the maternal centrosome after fertilization. Dev.
Biol. 131: 567-579.
Sluder, G., Miller, F. J. and Lewis, K. 1993.
Centrosome inheritance in starfish zygotes II.
Selective suppression of the maternal centrosome
during meiosis. Dev. Biol. 155: 58-67.
Snell, W. J. and White, J. M. 1996. The molecules
of mammalian fertilization. Cell 85: 629-637.
Speksnijder, J. E., Sardet, C. and Jaffe, L. F. 1990.
The activation wave of calcium in the ascidian
egg and its role in ooplasmic segregation. J. Cell
Biol. 110: 1589-1598.
Steinhardt, R. A. and Epel, D. 1974. Activation
of sea urchin eggs by a calcium ionophore. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 71: 1915-1919.
Steinhardt, R., Zucker, R. and Schatten, G. 1977.
Intracellular calcium release at fertilization in
the sea urchin egg. Dev. Biol. 58: 185-196.
Storey, B. T. 1995. Interactions between gametes
leading to fertilization: The sperm’s eye view.
Reprod. Fert. Dev. 7: 927-942.
Suarez, S. S. and Dai, X. 1995. Intracellular
calcium reaches different levels of elevation in
hyperactivated and ac rosome-reacted hamster
sperm. Mol. Reprod. Dev. 42: 325-333.
Suarez, S. S., Katz, D. F., Owen, D. H., Andrew, J.
B. and Powell, R. L. 1991. Evidence for the
function of hyperactivated motility in sperm.
Biol. Reprod. 44: 375-381.
Summers, R. G. and Hylander, B. L. 1974. An
ultrastructural analysis of early fertilization in
the sand dollar, Echinarachnius parma. Cell Tiss.
Res. 150: 343-368.
Summers, R. G. and Hylander, B. L. 1975.
Species-specificity of acrosome reaction and
primary gamete binding in echinoids. Exp. Cell
Res. 96: 63-68.
Summers, R. G., Hylander, B. L., Colwin L H.
and Colwin, A. L. 1975. The functional anatomy
of the echinoderm spermatozoon and its inte-
raction with the egg at fertilization. Am. Zool.
15: 523-551.
Surani, M. A. H. and Barton, S. C. 1983. Deve-
lopment of gynogenetic eggs in the mouse: Im-
plications for parthenogenetic embryos. Science
222: 1034-1036.
Surani, M. A. H., Barton, S. C. and Norris, M. L.
1986. Nuclear transplantation in the mouse:
Hereditable differences between parental
genomes after activation of the embryonic
genome. Cell 45: 127-136.
Swann, K. and Whitaker, M. 1986. The part
played by inositol trisphosphate and calcium in
the propagation of the fertilization wave in sea
urchin eggs. J. Cell Biol. 103: 2333-2342.
Terasaki, M. and Sardet, C. 1991. Demonstrati-
on of calcium uptake and release by sea urchin
egg cortical endoplasmic reticulum. J. Cell Biol.
115: 1031-1037.
Tilney, L. G., Bryan, J., Bush, D. J., Fujiwara, K.,
Mooseker, M. S., Murphy, D. B. and Snyder, D.
H. 1973. Microtubules: Evidence for 13
protofilaments. J. Cell Biol. 59: 267-275.
Tilney, L. G., Kiehart, D. P., Sardet, C. and
Tilney, M. 1978. Polymerization of actin.
IV. Role of Ca2+ and H+ in the assembly of
act in and in membrane fusion in the
acrosomal reaction of echinoderm sperm. J.
Cell Biol. 77: 536-560.
Tombes, R. M. and Shapiro, B. M. 1985.
Metabolite channeling: A phosphocreatine
shuttle to mediate high-energy phosphate
transport between sperm mitochondrion and tail.
Cell 41: 325-334.
Turner, P. R., Jaffe, L. A. and Fein,A. 1986.
Regulation of cortical vesicle exocytosis in sea
urchin eggs by inositol 1,4,5-trisphosphate and
GTP-binding protein. J. Cell Biel. 102: 70-76.
Turner, P. R., Jaffe, L. A. and Primakoff, P.
1987. A cholera toxin-sensitive G-protein
stimulates exocytosis in sea urchin eggs. Dev.
Biol. 120: 577-583.
Uzzell, T. M. 1964. Relations of the diploid and
triploid species of the Ambystoma jeffersonia-
num complex. Copeia 1964: 257-300.
Vacquier, V D. 1979. The interaction of sea
urchin gametes during fertilization. Am.
Zool. 19: 839-849.
Vacquier, V. D. and Moy, G. W. 1977. Isolation
of bindin: The protein responsible for adhesion
of sperm to sea urchin eggs. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74: 2456-2460.
Vacquier, V. D. and Payne, J. E. 1973. Methods
for quantitating sea urchin sperm in egg binding.
Exp. Cell Res. 82: 227-235.
Vacquier, V. D., Tegner, M. J. and Epel, D.
1973. Protease release from sea urchin eggs
at fertilization alters the vitelline layer and
aids in preventing polyspermy. Exp. Cell Res.
80: 111-119.
Vincent, J. P., Oster, G. F. and Gerhart, J. C.
1986. Kinematics of gray crescent formation in
Xenopus eggs. The displacement of subcortical
cytoplasm relative to the egg surface. Dev. Biol,
113: 484-500.
Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D.,
Olds-Clarke, P. and Kopf, G. S. 1995a. Capacitation
of mouse spermatozoa I. Correlation between
capacitation state and protein tyrosine phospho-
rylation. Development 121: 1129-1137.
CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 165
Visconti, P. E. and seven others. 1995b.
Capacitation of mouse spermatozoa II. Protein
tyrosine phosphorylation and capacitation are
regulated by a cAMP-dependent pathway. De-
velopment 121: 1139-1150.
von Kolliker, A. 1841. Beiträge zur Kenntnis
der Geschlectverhdltnisse und der Samenflüssi-
gkeit wirbelloser Thiere, nebst einem Versuch
Über Wesen und die Bedeutung der sogenannten
Samenthiere, Berlin.
Ward, C. R. and Kopf, G. S. 1993. Molecular
events mediating sperm activation. Dev. Biol.
158: 9-34.
Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L. and
Vacquier, V. D. 1985. Chemotaxis of Arbacia
punctulata spermatozoa to resact, a pepticle from
the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101: 2324-2329.
Wassarman, P. 1987. The biology and chemistry
of fertilization. Science 235: 553-560.
Wassarman, P. M. 1989. Fertilization in mam-
mals. Sci. Am. 256(6): 78-84.
Watanabe, N., Hunt, T., Ikawa, Y. and Sagata,
N. 1991. Independent inactivation of MPF and
cytostatic factor (Mos) upon fertilization of
Xenopus eggs. Nature 352: 247-249.
Whitaker, M. and Irvine, R. F. 1984. Inositol
1,4,5-triphosphate microinjection activates sea
urchin eggs. Nature 312: 636-639.
Whitaker, M. and Steinhardt, R. 1982. Ionic
regulation of egg activation. Q. Rev. Biophys.
15:593-666.
Wilcox, A. J., Weinberg, C. R. and Baird, D. D.
1995. Timing of sexual intercourse in relation
to ovulation: Effects on the probability of con-
ception, survival of pregnancy, and the sex of
the baby. N. Engl. J. Med. 333: 1517-121.
Williams, C. J., Schultz, R. M. and Kopf, G. S.
1992. Role of G proteins in mouse egg activation:
Stimulatory effects of acetylcholine on the ZP2
to ZP2f conversion and pronuclear formation
in eggs expressing a functional ml muscarinic
receptor. Dev. Biol. 151: 288-296.
Wilson, W. L. and Oliphant, G. 1987. Isolation
and biochemical characterization of the subunits
of the rabbit sperm acrosome stabilizing factor.
Biol. Reprod. 37: 159-169.
Winkler, M. M., Steinhardt, R. A., Grainger, J.
L. and Minning, L. 1980. Dual ionic controls
for the activation of protein synthesis at ferti-
lization. Nature 287: 558-560.
Xu, Z., Kopf, G. S. and Schultz, R. M. 1994.
Involvement of inositol-1,4,5-trisphospha-
te-mediated Ca2+ release in early and late
events of mouse egg activation. Develop-
ment 120: 1851-1859.
Yanagimachi, R. 1994. Mammalian fertilizati-
on. In E. Knobil and J. D. Neill (eds.), The
Physiology of Reproduction, 2nd Ed. Raven
Press, NY.
Yanagimachi, R. and Noda, Y. D. 1970.
Electron microscope s tudies of sperm
incorporation into the golden hamster egg.
Am. J. Anat. 128: 429-462.
Yirn, D. L., Opresko, L. K., Wiley, H. S. and
Nuccitelli, R. 1994. Highly polarized EGF re-
ceptor tyrosine kinase activity initiates egg
activation in Xenopus. Dev. Biol. 162: 41-55.
Yoshida, M., Inabar, K. and Morisawa, M. 1993.
Sperm chemotaxis during the process of fertili-
zation in the ascidians Ciona savignyi and Ciona
intestinalis. Dev. Biol. 157: 497-506.
Zeng, Y., Clark, E. N. and Florman, H. M.
1995. Sperm membrane potential: Hyper-
polarization during capacitation regulates
zona pellucida-dependent acrosomal secre-
tion. Dev. Biol, 171: 554-563.