1 MICROSCOPIA

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MICROSCOPIA
A biologia celular iniciou com o microscópio ópitico que continua sendo uma ferrementa essencial devido ao desenvolvimento para a marcação específica e a obtenção de imagem dos constituintes celulares individuais, assim como a reconstrução da sua arquitetura tridimencional.
AO MICROSCÓPIO ÓPITICO: é um instrumento usado para ampliar e regular, com lentes capazes de enxergar através da luz, estruturas impossíveis de visualizar a olho nu.
A doutrina celular, que marca o nascimento formal da microscopia celular, foi à criação da teoria de que todos os tecidos, animais e vegetais, são agregados de células individuais. Descoberta feita somente após a disponibilidade de bons microscópios ópticos.
Na microscopia ópitica a luz é relativamente não-destrutiva. Com a marcação de componentes celulares específicos com sondas fluorescentes podemos observar o movimento, a dinâmica e as interações nas células vivas .
In practice, finding the true PSF is impossible, and usually an approximation of it is used, theoretically calculated [ 4 ] or based on some experimental estimation by using known probes.Tecidos intactos, por serem em sua maioria muito espessos, normalmente são fixados e cortados antes da microscopia para que suas células individuais sejam examinadas diretamente em uma alta resolução.
Devido a natureza de sua onda a luz não segue a tragetória idealizada, as ondas de luz viajam no sistema ópitico por várias rotas levemente diferentes, de maneira que interferem umas com as outras e causam efeito de difração ópitica.
Dois feixes de onda estão em fase alcançando o mesmo ponto por caminhos diferentes, intencificando uma as outra e aumentando a luminosidade; por outro lado, se a sucessão de ondas está fora de fase elas irão interferir entre si de forma a se cancelarem diminuindo a luminosidade.
O limite de resolução depende do comprimento de onda da luz e da abertura numerica do sistema de lentes utilizado.
Detecção é quando um objeto abaixo do limite de resolução emite luz própria e permite sua visialização.
Os Microscópio de contraste de fase e Microscópio de contraste de interferência diferencial permitem visualização de células vivas, através do contraste devido à diferença de fase dos raios luminosos que recombinar trajetos de luz que atravessa as células, dando a célula uma aparência tridimensional.
Uma maneira mais simples de visualizar características de células vivas é observar a luz que é espalhada por seus varios componentes. No Microscópio de campo escuro os raios de luz são direcionados pela lateral, de forma que somente a luz difundida passa pelas lentes do microscópio e como decorrência a célula aparece como um objeto iluminado contra o fundo escuro, já no Microscópio de campo claro a luz que passa através de uma célula em cultura forma a imagem diretamente.
As moléculas específicas podem ser localizadas nas células por Microscopia de fluorescência em que moléculas fluorescentes após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, resultando na emissão de radiação de maior comprimento de onda. Assim, determinadas substâncias absorvem a energia da luz e emitem depois radiação de luz visível.
O equipamento que permite a observação da fluorescência denomina-se microscópio de fluorescência; semelhante a um microscópio óptico, exceto a luz utilizada, originada de uma fonte muito potente e passa através de dois conjuntos de filtros.
Parte integrante desta técnica são os fluorocromos, que poderão ser conjugados com anticorpos, tornando possível a localização e identificação de moléculas individuais que reagem com o anticorpo. Esta aplicação, é designada por imunofluorescência. 
Algumas limitações práticas do microscópio, relacionadas as imperfeições do sitema ópitico, foram em grande parte superados com o sistema eletronico de imagem e a tecnologia de processamento de imagem , e também contornaram limitações fundamentais do olho humano.
Deconvolução de imagem In optics and imaging, the term "deconvolution" is specifically used to refer to the process of reversing the optical distortion that takes place in an optical microscope , electron microscope , telescope , or other imaging instrument, thus creating clearer images. é o processo de reversão da distorção óptica do microscópio, criando assim uma imagens mais nítidas, It is usually done in the digital domain by a software algorithm , as part of a suite of microscope image processing techniques.The usual method is to assume that the optical path through the instrument is optically perfect, convolved with a point spread function (PSF), that is, a mathematical function that describes the distortion in terms of the pathway a theoretical point source of light (or other waves) takes through the instrument. [ 3 ] Usually, such a point source contributes a small area of fuzziness to the final image.o método usual é uma função de propagação do ponto, que descreve a distorção em fonte pontual de luz. 
O microscópio confocal produz secções ópticas excluindo a luz fora do foco, alcançando um resultado similar ao da desconvolução, mais faz pela manipulação da luz antes dela ser medida. É utilizado para aumentar o contraste da imagem microscópica e construir imagens tridimensionais, que permite uma grande definição de imagem em amostras mais espessas que o plano focal.
Proteinas fluorescentes tornam componentes específicos de células vivas visiveis ao microscópio por gene codificante para moléculas de proteinas que são fluorescentes por si só. Muito importante é a proteína fluorescênte verde (GFP), isolada da água-viva, essa proteina é codificada por um gene que pode ser clonado e introduzido em células de outras espécies; essa proteina não é fluorescente mais sofre uma modificação para gerar um centro fluorescente e brilhante. Um dos usos mais simples da GFP é como molécula reporter .
Fotoativação é a sintese de uma forma inativa da molécula fluorescente, sua introdução em uma célula e então a sua ativação repentina em um local escolhido na célula pela incidência de um ponto de luz sobre ela.
Recuperação da fluorescência após fotodegradação normalmente realizada com um microscópio confocal, é usar um feixe de luz focalizado para extinguir a fluorescência da GFP em uma região específica da célula
A diferença básica entre o microscópio óptico e o eletrônico é que neste último não é utilizada a luz, mas sim feixes de elétrons.
AO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO:
Se utilizarmos um feixe de elétrons, na microscopia eletrônica pode observar imagens de complexos moleculares dentro da célula em uma relação quase atômica e em três dimensões.
A Microscopia eletrônica amplia a imagem por meio de feixes de elétrons.
As macromoléculas específicas podem ser localizadas por microscopia eletrônica de imunolocalização com ouro que é a incubação de uma secção fina com anticorpos ao qual foi aclopada uma particula de ouro coloidal, que é eletrodensa e pode ser vista como um ponto preto ao microscópio eletrônico.
O microscópio eletrônico de varredura é um tipo de microscópio eletrônico capaz de produzir imagens de alta resolução da superfície de uma amostra. Devido a maneira com que as imagens são criadas aparências tridimensional característica e são úteis para avaliar a estrutura superficial de uma dada amostra.
Um tipo especial de microscópio eletrônico de varredura é por tunelamento, capaz de oferecer aumentos de até cem milhões de vezes, possibilintando até mesmo a observação da superfície de algumas macromoléculas, como é o caso do DNA.
microscópia eletrônico de transmissão é uma técnica na qual um feixe de elétrons é emitido em direção a uma amostra ultra fina, interagindo com a amostra enquanto a atravessa. Uma imagem é formada na interação dos elétrons transmitidos através da amostra; a imagem é ampliada e focada em um dispositivo de imagem, como uma tela fluorescente, ou uma camada de filme fotográfico, ou detectada por um sensor como uma câmera. 
Coloração negativa é a técnicautilizada para visualizar macromoléculas isoladas sombreadas com um metal pesado para produzir contraste.
Microscopia crioeletrônica é o conjelamento rápido para formar gelo vítrio e permite até mesmo que as caracteristicas internas de estruturas tridimencionais sejam visualizadas diretamente com alta resolução.
Reconstrução de partículas simples é a obtenção de imagens de várias moléculas identicas e recombinalas para produzir uma média das imagens, revelando imagens estruturais que estavam escondidas pelo ruído da imagem original.