Aula de Sequenciamento do DNA

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Sequenciamento do DNA 
Prof. Msc. Fernando Mello 
Disciplina: Biologia Molecular 
 
Visão geral 
• Técnica pela qual a ordem exata dos nucleotídeos em um segmento de 
DNA pode ser determinada. 
 
• Realizada pela 1ª vez em 1976 → 5.386 nucleotídeos do fago X174. 
 
• Hoje → centenas de vírus, mais de 200 plasmídeos, 200 cloroplastos e 
mitocôndrias, mais de 200 bactérias e cerca de 30 eucariotos. 
• Os procedimentos de sequenciamento de DNA 
necessitam: 
 
 Que haja a geração de uma população de fragmentos de DNA; 
 
 Todos começam exatamente no mesmo nucleotídeo (todos com uma 
ponta em comum – ponta 5´ do primer); 
 
 E terminam em todas as posições possíveis (cada nucleotídeo 
consecutivo). 
 
 Esses fragmentos são separados com base no tamanho por 
eletroforese em gel de poliacrilamida. 
 
 São realizadas 4 reações bioquímicas separadas, simultaneamente 
(cada uma gera um fragmento terminando em uma das 4 bases). 
 
 
Procedimento de Sanger 
• Necessita de DNA fita simples. 
 
• Utiliza apenas um dos primers (sense ou antisense). 
 
• Utiliza 2´, 3´- Didesoxirribonucleosídeo-trifosfatos marcados 
radioativamente (32P). 
 
 
• Usando ddTTP, ddCTP, ddATP e ddGTP como finalizadores de cadeia em 4 
reações separadas, são geradas 4 populações de fragmentos de DNA 
diferentes (cada população com todos os fragmentos terminando na 
mesma base). 
 
• Proporção de 100 dNTPs para 1 ddNTP → produz população de 
fragmentos que terminam em todos os nucleotídeos do fragmento. 
 
• Fragmentos separados por eletroforese em gel de poliacrilamida. 
 
• Posições detectadas por auto-radiografia. 
 
• Cada banda sucessiva conterá cadeias que são um nucleotídeos maior do 
que as cadeias na banda precedente. 
 
• O nucleotídeo 3´-terminal de cada banda será o ddNTP finalizador de 
cadeia presente em cada reação. 
• Atualmente, todo o procedimento é 
automatizado → sequenciadores. 
 
 
• Uso de corantes fluorescentes ao 
invés de isótopos radioativos. 
 
• Separação dos produtos de todas as 
4 reações feita por eletroforese em 
gel em um único poço ou um único 
tubo capilar. 
 
• Uso de fotocélula para detectar a 
fluorescência dos corantes a 
medida que passam pelo gel ou 
tubo capilar. 
 
• Transferência direta do que passou 
pela fotocélula para um 
computador → analisa, registra e 
imprime a sequência 
(eletroferograma). 
 
• Bibliografia 
 
 SNUSTAD, D. Peter; SIMMONS, Michael J. 
Fundamentos de genética. 4ª ed. Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 2008.