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1 RESUMO: Biologia celular animal – 3ª unidade: Lílian Schlang, Paula Seixas, Rafaela Sant’Anna. 1- Reparo e replicação 1. REPLICAÇÃO DO DNA O processo biológico da reprodução requer a transmissão fiel da informação genética dos pais para os filhos. Portanto, a replicação do DNA genômico é essencial para a existência de todas as células e organismos. Todas as células, em algum momento terão que se dividir. Algumas fazem a vida toda, outras, param em algum momento. Toda vez que darão origem a células-filhas em que o material genético terá que ser duplicado para que todas informações sejam passadas. Todo o seu genoma é duplicado, sendo necessária uma maquinaria enzimática para copiar grandes moléculas de DNA que constituem os cromossomos de procariotos e eucariotos. Na fase S do ciclo que ocorre a duplicação. Esta fase é controlada, fiel e bastante rigorosa onde existe uma maquinaria complexa em que as enzimas funcionam para diminuir ao máximo o erro e que este erro não seja passado a diante. Havendo erro durante a replicação do DNA existirá outro mecanismo para tentar reparar. Ação de agentes ambientais também pode ser reparadas, tais como radiações. Anormalidades neste processo de reparo podem ter consequências desastrosas como o desenvolvimento do câncer. Considerações sobre replicação: É um processo semiconservativo no qual cada fita parental serve de molde para síntese de uma nova fita-filha (duas fitas antiparalelas onde uma fita é complementar a outra e cada uma serve como molde para duas fitas novas – as duas moléculas de DNA restantes terão sempre uma fita antiga e outra nova). A enzima central envolvida nesse processo é a DNA polimerase que catalisa a junção de desoxirribonucleosídeos 5’ – trifosfatados (dNTPs) para formar a cadeia crescente de DNA. Outras proteínas estão envolvidas e mecanismos de correção de erros são necessários para garantir que a exatidão da replicação seja compatível com a baixa frequência de erros exigida para reprodução celular. As DNA polimerases: A DNA polimerase foi inicialmente identificada em lisados de E. coli, em 1956. Esta enzima tem a capacidade de copiar um molde de DNA e seu isolamento marcou a biologia molecular. Porém, esta primeira DNA polimerase identificada (DNA polimerase I) não é a principal enzima responsável pela duplicação em E. coli. Hoje se sabe que existem vários tipo de DNA polimerases que desempenham diferentes papeis na replicação e reparo do DNA. É semiconservativa: uma das fitas originais é conservada e utilizada como molde para uma nova fita. Cada molécula contém uma fita antiga e uma recém-sintetizada. A dupla-hélice atua como molde para sua própria duplicação Isolamento da DNA polimerase I: (DNA polimerase faz essa duplicação do DNA). Cultivaram E. coli, trataram com um mutagênico e isolaram uma linhagem deficiente em polimerase I. Perceberam que as bactérias deficientes em polimerase I continuavam se multiplicando, mas eram sensíveis a radiação UV. Levou a conclusão que a polimerase I não era essencial para replicação, mas estava envolvida com mecanismos de reparo de danos no DNA. Outros experimentos viram que existiam mais de uma polimerase (DNA polimerase II – reparo do DNA e III – enzima replicativa) e viram porque os isolados deficientes em polimerase I continuavam se replicando. Atualmente se sabe que além da polimerase III a polimerase I também é necessária para replicação de E. coli. Portanto a replicação do DNA em E. coli envolve duas polimerases distintas. 2 DNA polimerases em eucariotos: As células eucarióticas contêm cinco DNA polimerases (alpha - α, beta - β, gama - γ, delta - δ e épsilon - ε). A polimerase gama está localizada na mitocôndria e é responsável pela replicação do DNA mitocondrial. As outras estão no núcleo e estão envolvidas na replicação nuclear. As polimerases alpha, delta e épsilon apresentam maior atividade em células em divisão, o que sugere um envolvimento na replicação. Já a beta é ativa tanto em células em divisão quanto naquelas que não estão o que é consistente com a sua função no reparo de danos no DNA. O papel da épsilon ainda permanece confuso, embora essa enzima provavelmente funcione de maneira semelhante à polimerase delta que é suficiente para replicação na ausência da épsilon tanto em sistemas livres de células quanto em leveduras. Propriedades das DNA polimerases: Todas as polimerases sintetizam DNA na direção 5’ 3’, adicionando um dNTP no grupamento 3’ hidroxil da cadeia nascente. As DNA polimerases só podem adicionar um novo desoxirribonucleotídeo a uma fita de DNA (primer) que esteja ligado por pontes de hidrogênio a uma fita-molde complementar (fazem síntese da fita a partir de um pedaço já pronto (outra enzima que polimeriza esses pequenos fragmentos– primer, ribonucleotídeos) adicionando nucleotídeos complementares, todas as DNA polimerases precisam de um modelo para ir inserindo e pareando). Assim, diferem das RNA polimerases em que iniciam a síntese de uma nova fita de RNA sem necessitar de um primer. Esta propriedade parece ser essencial para manutenção da alta fidelidade de replicação do DNA. Origem de replicação: existem várias origens em todo o genoma e elas são ativadas simultaneamente. Essa variedade de origens possibilita a rapidez da replicação nos eucariotos. A replicação começa em nesses pontos específicos do DNA. A replicação tanto em procariotos quanto em eucariotos se inicia em uma sequência chamada de origem de replicação. Este lugar é específico para as proteínas que iniciam o processo de replicação. A etapa essencial desse processo é a ligação de uma proteína iniciadora em sequências específicas de DNA na origem de replicação. Essa proteína iniciadora começa desenrolando as fitas e recruta outras proteínas envolvidas na síntese de DNA. A helicase e a proteína SBB, então, atuam na continuidade do desenrolamento da dupla fita e exposição da fita-molde, e as primases iniciam a síntese das fitas contínuas. Assim, duas forquilhas de replicação são formadas e movem-se em direções opostas. Em genomas bacterianos ou virais existe uma única origem, porém em genomas maiores existem várias origens de replicação. A velocidade da replicação em procariotos é muito mais rápida do que em eucariotos (empacotamento do DNA na cromatina). Apesar disso, os genomas de mamíferos são replicados em poucas horas devido às milhares de origens de replicação. Química da síntese de DNA: (adição do desoxirribonucleotideo trifosfatado): sempre adicionada da extremidade 5’ para 3’.A quebra desse fosfato (pirofosfato) serve como energia para a ligação fosfodiéster entre as bases da mesma fita. Para isso, já tem que haver as pontes de hidrogênio entre bases de fitas diferentes. 3 Eucariotos: Nos eucariotos a replicação inicia em várias origens de replicação (Ori ou OriC) em um mesmo cromossomo. Essa replicação é rápida, mas como o DNA do eucarioto é bem maior do que o do procarioto ela vai demorar horas para se completar. Regiões ricas em adenina (A) e timina (T) – duas pontes de hidrogênio, mais fácil de romper a ligação. Elas são ativadas, proteínas iniciadoras se ligam ao DNA e abrem as duas fitas para formar a forquilha (duas, de cima e de baixo) de replicação bidirecional (nos dois sentidos) e simultânea. Quando o sentido é 5’ 3 ‘ é de forma contínua. No outro sentido a polimerase vai para trás e corre, mas sempre no sentido 5’ 3 ‘ (fragmentos de Okazaki). Para síntese da fita continua só é necessário 1 primer, para a descontinua necessita de vários primers. As origens de replicação são espaçadas por intervalos de 50 a 300 Kb indicando mais ou menos30000 origens de replicação no genoma humano. Parece que as sequências que definem as origens de replicação variam amplamente entre os eucariotos, embora o papel das proteínas do ORC (ARS - Sequência de replicação autônoma; uma origem de replicação; 100 pares de bases e umnnúcleo central de 11 pares de bases comuns a vários ARS diferentes – é um sítio de ligação de um complexo proteico ORC – complexo de origem de replicação - que é necessário para replicação do DNA e recruta proteínas iniciadoras para iniciar a replicação) como iniciadoras da replicação seja altamente conservado. Procarioto: Somente uma origem. Nos procariotos a replicação começa numa região chamada de Ori ou Ori C que são regiões ricas em adenina e timina que são ligações mais fracas (nestas regiões os pares de bases variam de 100 a 245 pares). Nela uma proteína iniciadora vai se ligar para começar o processo de replicação. Ela vai começar o processo de desenrolamento das fitas e recruta outras que estão envolvias no processo de síntese de DNA. A primeira delas é a helicase que vai quebrar as ligações ponte de hidrogênio entre as bases. Depois da separação das fitas a proteína primase irá sintetizar os primers de RNA que são uma sequência de 15 a 20 nucleotídeos que vão servir para ancorar a proteína DNA polimerase. Estas vão replicar as fitas do DNA em direções opostas. Assim, formam-se duas forquilhas de replicação. OBS: Após a proteína iniciadora começar a desenrolar as fitas do DNA na região OriC vão ser formadas fases de abertura de leitura que vão permitir a inserção das enzimas do processo de replicação. A Escherichia coli para replicar todo o seu genoma leva em torno de 30 minutos. Síntese do RNA iniciador (Primer): Ao invés de timina usa uracila. É realizado pela enzima primase e polimerase alpha. É um pedaço de RNA essencial para iniciar a síntese de DNA. Ele é complementar ao molde. Depois que começa a síntese de DNA ele é removido por uma endonuclease. A polimerase delta substitui o primer e inicia a síntese. Existe uma DNA ligase que liga os fragmentos de DNA (uma vez na continua e inúmeras vezes na descontinua). Portanto, o primer degradado, substituído por um fragmento de DNA e depois esse fragmento é ligado pela DNA ligase. 4 Forquilha de replicação: É bidirecional. Representam regiões ativas na síntese de DNA em que podem ser visualizadas duas fitas de DNA parental separadas e as duas fitas-filhas sendo sintetizadas. Porém, existe um problema. Se as duas fitas parentais são antiparalelas, a síntese contínua das duas novas fitas na forquilha de replicação exigiria que uma delas fosse sintetizada na direção 5’ 3’ e a outra na direção 3’ 5’. Contudo, as DNA polimerases somente catalisam a incorporação de dNTPs na direção 5’3’. Este problema foi resolvido quando descobriu que somente uma fita era sintetizada de modo contínuo na direção da replicação da forquilha, a outra é formada de pedaços curtos e descontínuos de DNA que são sintetizados no sentido inverso em relação à direção da forquilha de replicação. Esses pequenos pedaços são chamados de fragmentos de Okazaki e são unidos pela ação de DNA ligase, formando uma fita intacta. Assim, a fita contínua é chamada de fita líder em que expõe o molde para síntese dos fragmentos de Okazaki e a outra é a fita retardada. Surge uma nova questão: se a DNA polimerase precisa de um primer para iniciar a síntese como é iniciada a síntese dos fragmentos de Okazaki¿ Existem pequenos fragmentos de RNA que servem como primers para replicação do DNA. Ao contrário da síntese de DNA, a síntese de RNA pode ser iniciada de novo e uma enzima chamada primase que sintetiza pequenos fragmentos de RNA complementar a fita descontínua na forquilha. Assim, os fragmentos de Okazaki são sintetizados atrvés da extensão pela DNA polimerase, destes primers de RNA. Para formar a fita síntese descontínua é preciso que esses primers sejam removidos e substituídos por DNA. Em E. coli essa ação é feita pela RNase H (degrada fita de RNA) e pela DNA polimerase I. Essa enzima também age como exonuclease em que hidrolisa DNA (ou RNA), nas duas direções (3’5’ ou 5’3’). A sua ação na direção 5’3’ remove os ribonucleotídeos das extremidades 5’ dos fragmentos de Okazaki permitindo que estes sejam substituídos por desoxirribonucleotídeos, gerando fragmentos somente de DNA. Em eucarioto outras exononucleases fazem o papel da DNA polimerase I e quem faz a síntese dos nucleotídeos que faltam entre os fragmentos de Okazaki é DNA polimerase delta. Nos dois tipos celulares quem une os diferentes fragmentos é a DNA ligase. DNA POLIMERASE EM PROCARIOTO (E. coli) DNA POLIMERASE EM EUCARIOTO A forquilha é assimétrica Remoção dos primers e união dos fragmentos de okazaki Síntese de um fragmento de fita retardada 5 DNA polimerase I: remoção de primers e síntese de DNA (preenche as lacunas) DNA polimerase α: síntese de fragmentos curtos de DNA-RNA (fita descontínua)+ primase DNA polimerase II: reparo do DNA DNA polimerase β: reparo do DNA DNA polimerase III: síntese de DNA (principal) DNA polimerase δ/ε: síntese de DNA (da contínua e da descontínua, preenche as lacunas) DNA polimerase γ: síntese de DNA mitocôndrial OBS: PROTEÍNAS ACESSÓRIAS DA POLIMERASE Um dessas classes se ligam às DNA polimerases, aumentando sua atividade e fazendo com que permaneçam ligadas à fita-molde do DNA de maneira a dar continuidade à síntese da nova fita do DNA. Tanto a polimerase III de E. coli como a polimerase delta e épsilon de eucariotos estão associadas a dois tipos de proteínas acessórias (as proteínas de deslizamento de grampo – PCNA em células de mamíferos, proteína beta em E. coli e antígeno nuclear de células em proliferação em eucariotos; e as proteínas de carregamento de grampo- RFC em células de mamíferos, complexo gama em E. coli e fator replicativo C em eucariotos). Elas posicionam a polimerase sobre o primer a mantêm estavelmente associada a fita molde. As RFC reconhecem e se ligam especificamente ao DNA em junção entre o primer e a fita-molde e as PCNA se ligam às adjacências das RFC, formando um anel em torno da fita molde de DNA e posicionam a DNA polimerase na junção do primer com a fita-molde.O anel formado mantém a associação da DNA polimerase com seu molde é medida que a replicação procede, permitindo a síntese ininterrupta de vários milhares de nucleotídeos de DNA. Outras proteínas desenrolam a fita dubla do DNA e estabilizam regiões de fita simples. As helicases catalisam o desenrolamento do DNA parental, ação associada à hidrólise do ATP (rompem as pontes de hidrogênio) e as proteínas SBB (proteínas de ligação ao DNA fita simples) – fator replicativo A eucariótico (RFA) estabilizam a fita-molde de DNA desenrolada, mantendo-a como fita simples e permitindo que possa ser copiada pela polimerase e impedem que forme um grampo e que ele se enrole em torno dele mesmo. 6 O papel da topoisomerase: À medida que as fitas do DNA parental são desenroladas as regiões do DNA à frente da forquilha são forçadas a rotar. Se não fosse controlado esse processo levaria a moléculas de DNA circular ficarem torcidas sobre elas mesmas, bloqueando a replicação. Este problema é resolvido pela topoisomerase que são enzimas que catalisam a reação reversível de quebra e junção das fitas de DNA. Elas se dividem em dois tipos: topoisomerase I (quebra somente uma das fitas de DNA) e topoisomerase II (quebram ambas as fitas e desentrelaça moléculas de DNA circular recém-sintetizadas bem como está envolvida na condensação do DNA mitótico em eucariotos). Essas quebras servem como pontos de desenrolamentoque permitem que as fitas de DNA girem livremente, e, assim, a replicação corre normalmente sem causar supertorção do DNA à frente da forquilha. No DNA linear de eucariotos também é preciso a ação das topoisomerases, caso contrário os cromossomos teriam de girar continuamente durante a síntese de DNA. O meio de duas origens de replicação fica tensionado e poderia se quebrar. Existem enzimas que quebra as ligações fosfodiésteres para desenrolar o DNA e depois elas ligam novamente. Ação da telomerase: Uma vez que as DNA polimerases estendem os primers somente na direção 5’3’ elas não são capazes de copiar as extremidades 5’ das moléculas lineares de DNA da fita descontínua. Por isso, são necessários mecanismos especiais para replicar as sequências terminais dos cromossomos lineares de células eucarióticas. Essas sequências terminais são os telômeros que ficam nas extremidades dos cromossomos e consistem em repetições de sequências simples do DNA. Essas regiões são replicadas pela ação da telomerase que é capaz de manter os telômeros catalisando suas sínteses na ausência de um molde de DNA. Ela é uma transcriptase reversa que sintetiza DNA a partir de um molde de RNA. Ela leva consigo seu próprio molde de RNA como parte do complexo enzimático, o qual é complementar às sequencias repetitivas presentes no telômero. O uso desse molde de RNA permite que a telomerase gere cópias múltiplas das sequências repetitivas dos telômeros, mantendo-os mesmo na ausência de um molde convencional de DNA para direcionar suas sínteses. O uso do RNA como molde permite que a telomerase estende a extremidade 3’ da fita contínua uma unidade de repetição a mais do seu tamanho original para que assim a fita complementar seja sintetizada pelo complexo polimerase alpha + primase usando o primer convencional de RNA. A remoção do rpimer pode deixar uma extremidade 3’ protuberante no DNA o que pode formar alças nas extremidades dos cromossomos eucarióticos. Como não tem onde colocar primer no OBS: As enzimas envolvidas na replicação atuam de forma coordenada para sintetizam as duas fitas (contínua e descontínua) de maneira simultânea. Essa tarefa é desempenhada pela formação de dímeros de DNA polimerases replicativas cada qual com suas proteínas acessórias em que cada molécula de polimerase atua na síntese de cada uma das fitas. Acredita-se que para formação da fita descontínua haja a formação de uma alça junto da forquilha de replicação de maneira que a subunidade da polimerase envolvida na síntese da fita descontínua se mova na mesma direção que a outra subunidade que está atuando na fita contínua. Mais de dez enzimas estão atuando em conjunto em uma mesma direção para sintetizar uma fita nova da molécula. Parece que há formação de uma alça para que o conjunto de enzimas siga no mesmo sentido. Para que a enzima não vá e volte. Na formação da alça a fita descontínua anda para o mesmo lado da contínua. (postulado) 7 final dos cromossomos, sempre um pedaço do DNA iria diminuir. No telômero não tem gene, mas eles estão entre os telômeros, se houvesse encurtamento ia acabar atingindo o gene e eliminando-os o que poderia ser prejudicial para o desenvolvimento da célula. A telomerase não fica ativa em todas as células somáticas, com o tempo ela vai sendo perdida. CONCLUSÃO: Cada uma das fitas de DNA atua como molde para síntese de outra fita (replicação) – ocorre a transmissão de informação genética. À medida que a molécula de DNA vai sendo sintetizada, suas fitas são afastadas, formando uma ou mais forquilhas de replicação em forma de Y. A enzima DNA polimerase, localizada na forquilha, sintetiza a nova fita de DNA complementar em cada fita original. A enzima remove seus próprios erros de polimerização. Somente uma das fitas na forquilha de replicação é replicada de modo contínuo. A DNA ligase junta os pequenos segmentos de DNA. A síntese de DNA é iniciada por uma RNA polimerase, a primase que sintetiza os primers de RNA, os iniciadores, que serão removidos e substituídos com o DNA. ENTÃO COMO OCORRE A REPLICAÇÃO¿ A DNA polimerase leva o nucleotídeo correto e pareia, percebendo se a distância e o ângulo entre as bases são corretos, com a fita-molde. Antes de levar o seguinte ela checa se o que ela colocou está certo (elimina a capacidade de crescimento da fita, se não fizesse isso inúmeros erros no DNA iam ser gerados e isto não seria compatível para vida da célula). Se não tiver correto ela já faz a troca do nucleotídeo para garantir a auto fidelidade – requer essa correção pela DNA polimerase e isso só pode ser feito se ele for adicionado da extremidade 3’ . Em bactéria a polimerase que faz replicação é a DNA polimerase III, a remoção do primer é a polimerase I e quem faz o reparo é a polimerase II. Em eucarioto (delta – síntese; épsilon trabalha com a delta, mas não está bem definido embora as duas sejam importantes porque se remover a ultima a primeira dar conta; reparo – gama; alfa – produção de primer + primase) 2. REPARO DO DNA A fidelidade da replicação: a exatidão da replicação do DNA é essencial para a reprodução celular, sendo que estimativas para frequências de mutações de diferentes genes indicam que os erros durante a replicação correspondem a somente uma única base incorreta a cada 10 a nona ou 10 a décima nucleotídeos incorporados. A DNA polimerase aumenta a fidelidade de replicação e se dá pela seleção da base correta para inserir na fita sendo sintetizada. Ela não catalisa simplesmente a incorporação de qualquer nucleotídeo que esteja pareado por pontes de hidrogênio. Ao invés disto, ela evita ativamente a incorporação de uma base malpareada pela adaptação à conformação da base correta. Estudos dizem que a ligação correta de dNTPs induz mudança conformacional na polimerase o que leva a incorporação deste nucleotídeo ao DNA. Isto aumenta a exatidão da replicação em 1000 vezes, reduzindo a frequência de erros. Outro mecanismo é a correção de erros feita pela DNA polimerase. A exonuclease 3’5’ atua na correção dos erros que porventura ocorram na fita recém-sintetizada. Portanto, quando uma base incorreta é incorporada ela será preferencialmente removida pela atividade da exonuclease 3’5’, a qual requer um primer unido por pontes de hidrogênio à fita-molde para que a síntese continue, em vez de ser usada para continuar a síntese (aumenta a exatidão da replicação em 100 a 1000 vezes). A atividade de correção de erros da DNA polimerase combinada com a habilidade em evitar a introdução de bases incorreta é suficiente para reduzir 8 à frequência de erros na replicação em 10 a nona. Portanto, há uma seleção dos nucleotídeos, uma revisão se eles foram colocados errado, e, se ainda houver erro, as enzimas que atuam no mau pareamento trocam esse que foi colocado errado por outro certo. OBS: A importância do mecanismo de correção de erros pode explicar o fato de que as DNAS polimerases exigirem a presença de um primer e catalisarem somente na direção 5’3’. Quando o DNA é sintetizado na direção 5’3’ a energia necessária para a polimerização deriva da hidrólise do grupo 5’-trifosfato de um dNTP livre e ele é adicionado a um grupo 3’ hidroxil da cadeia nascente. Se a DNA fosse sintetizado na direção 3’5’ a energia da polimerização deveria ser derivada da hidrólise de um grupo 5’-trisfosfato do nucleotídeo terminal já incorporado ao DNA. Com isso, ficaria eliminada a possibilidade da edição de erros, já que a remoção do nucleotídeo erroneamente pareado também removeria o grupo 5’ trifosfato necessário como fonte de energia para extensão da cadeia. Alterações espontâneas no DNA: depurinação (perda de 5000 bases púricas por dia); desaminação (100 bases por célula por dia); bases danificadaspor metabolitos reativos ou produtos químicos; formação de dímeros de pirimidinas (radiação UV). Depurinação , desaminação e agentes químicos: Na primeira a guanina é perdida e fica apenas o açúcar e o fosfato. Na segunda há perda da amina da citosina que se transforma em uracil ou da adenina que se transforma em hipoxantina. A timina não perde amina. Agentes químicos também alteram a estrutura química da molécula como com a adição do radical metila que faz com que a guanina faça um pareamento com a timina ao invés da citosina, mudando muda a sequência de nucleotídeo da molécula, além de também pode distorcer a molécula causando quebra. Mutações produzidas pela ausência de reparo no DNA: dasaminação da citosina convertida em uracila, se não houver reparo vai haver mal pareamento (troca de pareamento). Nesse caso o dano não é tão grave, a troca pode até nem mudar a proteína produzida. Na depurinação há uma remoção ficando somente 3 nucleotídeos, podendo influenciar em toda sequencia seguinte produzindo, a partir daquele ponto da mutação, proteínas totalmente diferentes – a leitura será toda errada. O DNA, assim como qualquer outra molécula pode sofrer uma variedade de reações químicas. Contudo, uma vez que o DNA serve que cópia permanente do genoma celular, mudanças na sua estrutura são de consequências muito mais profundas do que alterações em outros componentes celulares, tais como RNA e proteínas. As mutações podem ser resultantes de incorporações incorretas de bases durante a replicação, além de alterações químicas de maneira 9 espontânea ou como resultado da exposição a agentes químicos ou radiação ionizante. Essas lesões podem bloquear a replicação ou a transcrição, podendo resultar em uma alta frequência de mutações que são inaceitáveis para a reprodução celular. Portanto, as células desenvolveram mecanismos de reparo para as lesões que podem ser geradas no DNA. Os mecanismos de reparo do DNA podem ocorrer de forma espontânea, natural, direta, por enzimas já no sistema ou pode ser por reversão direta ou excisão. Eles podem ser divididos em duas classes: REVERSÃO DIRETA DA REAÇÃO QUÍMICA RESPONSÁVEL PELO DANO NO DNA Somente alguns poucos tipos de lesões no DNA são reparados desta maneira, particularmente os dímeros de pirimidina que resultam da exposição à luz UV e resíduos de guanina alquilados que foram modificados pela adição de grupos metila ou etila na posição O6 do anel purínico. A luz UV é uma das principais fontes de dano ao DNA e a exposição a essa radiação UV solar é a cauda da maioria dos tipos de câncer de pele humano. DÍMEROS DE PIRIMIDINA/TIMINA: principal tipo de lesão induzida por luz UV. As pirimidinas adjacentes de uma mesma fita de DNA são unidas pela formação de um anel ciclobutano, anel este resultante da situação de duplas entre carbonos 5 e 6. Esses dímeros distorce a cadeia de DNA e bloqueia a transcrição ou a replicação local podendo provocar uma distorção na molécula e quebra no DNA. O reparo está relacionado com a à habilidade das células de sobreviverem à irradiação com luz UV, nossas células tem que reparar essas alterações que acontecem espontaneamente. O reparo se dá pela reversão direta da reação de dimerização por fotorreativação em que a energia derivada da luz visível é utilizada para quebrar a estrutura do anel ciclobutano. A fotorreativação não é universal, muitas espécies não apresentam este tipo de mecanismo de reparo do DNA lesado. E. coli, leveduras, fazem esse reparo diretamente na lesão provocada por UV nós, humanos, não conseguimos realizar esse reparo espontâneo, por isso pode levar ao câncer de pele. REAÇÃO DE AGENTES ALQUILANTES/AGENTES QUÍMICOS: agentes alquilantes são reativos capazes de transferir grupos metila ou etila para base do DNA, modificando quimicamente essa base. Um tipo importante é a metilação na posição O6 da guanina, uma vez que o produto resultante, O6- metilguanina, forma pareamento com a timina em vez de citosina. Esta lesão pode ser reparada por uma enzima chamada de O6-metilguanina metiltransferase que transfere o grupo metil para um resíduo de cisteína em seu centro ativo. Assim, a guanina original é restaurada. Essas enzimas estão disseminadas tanto em procariotos quanto em eucariotos, incluindo humanos. 10 REMOÇÃO DE BASES ALTERADAS SEGUIDA POR SUBSTITUIÇÃO COM DNA RECÉM-SINTETIZADO o REPARO POR EXCISÃO: forma mais geral de reparar uma ampla variedade de alterações químicas no DNA. Neste reparo o DNA lesado é identificado e removido como bases livres ou nucleotídeos. A falha resultante é preenchida através de uma nova fita de DNA, usando a fita complementar intacta como molde. Três tipos de reparo por excisão: Excisão de base: reparo de DNA contendo uracil. Uma única base lesada é identificada e removida da molécula de DNA. O uracil pode aparecer no DNA por 2 formas: pode ser incorporado no lugar da timina durante a síntese do DNA ou pode ser formado no DNA pela desaminação da citosina. O segundo mecanismo é mais importante porque altera o padrão normal de complementaridade do pareamento de bases, representando um evento mutagênico. A excisão do uracil é feita pela enzima DNA glicosilase que cliva a ligação entre a uracil e a desoxirribose. Esta reação produz um açúcar+fosfato sem a base correspondente ligada. Essa enzima também removem outras bases anormais incluindo a hipoxantina formada pela desaminação da adenima, dímeros de primidina, purinas alquiladas e bases lesadas por oxidação ou radiações ionizantes. Sítios AP (apurínico) são formados como resultado de perdas espontâneas das bases púricas o que ocorre com grande frequência em células normais. Esses sítios são reparados por uma endonuclease que cliva regiões adjacentes ao sítio AP. A porção desoxirribose restante é removida (desoxirribose fosfodiesterase) e a falha de uma base é preenchida pela ação da DNA polimerase e da ligase. Excisão de nucleotídeo: Identifica uma variedade maior de bases lesadas que distorcem a molécula de DNA, incluindo dímeros de pirimidina induzidos por UV e grupos volumosos adicionados às bases como resultado da reação de muitos carcinógenos com o DNA. Neste tipo de reparo as bases lesadas são removidas como parte de um oligonucleotídeo contendo a lesão. Este reparo é catalisado por enzimas. Primeiro há a identificação da lesão e clivagem por uma nuclease 3’5’ adjacentes ao sítio lesado, respectivamente, excisando um nucleotídeo que consiste em 12 ou 13 bases (excinuclease). Depois a helicase vai entrar em ação para desenrolar a fita e posterior remoção do oligonucleotídeo contendo a lesão da estrutura de fita dupla do DNA. Por fim, a DNA polimerase preenche a falha e a selada pela ligase. Quando, em humanos, existem defeitos nos genes que codificam essas proteínas de reparo a pessoa desenvolve a doença (xeroderma pigmentoso – pessoas sensíveis a luz UV e desenvolvem câncer de pele múltiplos nas regiões do corpo expostas a luz solar). OBS: O reparo também pode ocorrer ao mesmo tempo em que ocorre a transcrição onde a RNA polimerase é bloqueada e assim proteínas de excisão do nucleotídeo são recrutadas para reparar o dano (reparo acoplado à transcrição). Reparo de malpareamento, de mismatch repair: identifica bases malpareadas que são incorporadas durante a replicação do DNA. Muitas dessas bases malpareadas são removidas pela atividade de correção de erros da DNA polimerase. Aquelas que escapam a este mecanismo são mais tarde corrigidas pelo sistema de reparo de malpareamento que faz uma varredura do DNA recém-replicado. As enzimas deste sistema são capazes de identificar e remover especificamente a base malpareada da fita recém-sintetizada,permitindo que o erro seja corrigido e a sequência original, restaurada. Em E. coli a habilidade do sistema em distinguir entre as fitas parental e recém-sintetizada está baseada no fato que o DNA desta bactéria é modificado por metilação dos resíduos de adenina presentes na sequência GATC. Uma vez que a metilação ocorre após a replicação, as fitas recém-sintetizadas não estão 11 metiladas e podem ser identificadas pelas enzimas do sistema de malpereamento. A proteína MutS identifica o malpareamento e forma um complexo formado por outras duas proteínas (MutL e MutH). A última é uma endonuclease que cliva a fita de DNA não metilada na sequência GATC. MutL e MutS agem conjuntamente como uma exonuclease e uma helicase para remover o DNA sendo a falha preenchida pela DNA polimerase e ligase. Em eucarioto, o mecanismo é similar apesar da forma de identificação das fitas recém-sintetizada ser diferente da de E. coli. A identificação ocorre por quebras em uma única fita (que estariam presentes em DNA recém-replicado) ou de associações dos homólogos eucarióticos de MutS e MutL com a maquinaria de replicação que indica a fita a ser reparada. Os homólogos se ligam a base malpareada e direcionam a remoção do DNA entra a quebra na fita e o malpareamento. Mutações nesses homólogos são responsáveis por um tipo hereditário de câncer de cólon, o HNPCC. PORTANTO: Um nucleotídeo é mal pareado com o outro – mas qual a fita que ta pareando errado¿ Em E. coli a fita velha sofre metilação em alguns pontos e esse sinal de ausência de metilação que indica o mal pareamento. No eucarioto ocorre uma quebra na fita induzida por uma distorção – que é onde tem a base mal pareada. As proteínas de reparo identificam em qual das duas fitas ocorreu o mal pareamento para reparar o dano. REPARO SUJEITO A ERRO: Se os sistemas anteriores falharem, ou seja, se mesmo depois da replicação ainda permaneçam erros, a célula possui mecanismos alternativos para lidar com o DNA danificado, na forquilha de replicação. As células possuem DNA polimerases especializadas que são capazes de replicar sobre um sítios de dano de DNA. A replicação do DNA danificado por essas polimerases especializadas pode levar a frequente incorporação de bases incorretas, por isso, essa forma de lidar com o dano é denominada reparo sujeito a erro. Essa enzima, denominada polimerase V é induzida em resposta a extensa irradiação com UV e pode sintetizar uma nova fita de DNA sobre um dímero de timina. Elas são especializadas em inserir a base correta na posição complementar às lesões específicas do DNA danificado, sendo, por isso, capazes de sintetizar corretamente uma nova fita, usando como molde algumas formas de DNA danificado. Dímeros de timina replicação bloqueada polimerase sujeita a erro insere AA na fita complementar retomada da replicação por uma polimerase normal dímero de timina removido por excisão de nucleotídeo. São capazes de inserir bases corretas somente a algumas formas de dano. REPARO POR RECOMBINAÇÃO: substituição do DNA danificado por recombinação com uma molécula íntegra. Usado para reparar danos durante a replicação como dímeros de timina ou outras lesões que não podem ser copiadas pelas DNA polimerases replicativas normais em que bloqueia o avanço de uma forquilha de replicação. Ele é dependente de uma das fitas do DNA parental estar íntegra e ter sido copiada durante a replicação para gerar uma molécula-filha normal, que então pode ser usada para reparar a fita danificada. A replicação normal é bloqueada por um dímero de timina em uma das fitas de DNA. Na região posterior ao sítio lesado a replicação pode ser iniciada mediante síntese de um fragmento de Okazaki e prosseguir ao longo da fita-molde lesada. Como resultado é formada uma fita-filha que apresenta uma falha na região oposta ao sítio lesado, por recombinação entre as sequências homólogas do DNA. Uma vez que a falha na região previamente intacta está localizada oposta à outra região íntegra, esta pode ser preenchida pela DNA polimerase. Apesar da outra fita parental ainda apresentar lesão original, a lesão agora está em uma região oposta a fita normal, podendo se alvo do mecanismo de reparo por excisão. Importante para reparar quebras das fitas duplas 12 2- Transcrição do DNA INTRODUÇÃO: O DNA genômico não direciona a síntese proteica diretamente, mas utiliza o RNA como uma molécula intermediária. Quando a célula necessita de uma proteína específica, a sequência de nucleotídeos da região apropriada de uma molécula de DNA em um cromossomo é inicialmente copiada na forma de RNA (transcrição). As cópias de RNA a partir do segmento de DNA são usadas diretamente como moldes para direcionar a síntese proteica (tradução). Ou seja, DNA RNA Proteína (Dogma Central da Biologia Molecular). A transcrição e a tradução são os meios que as células leem e expressam as instruções genéticas dos seus genes. O primeiro passo da célula para ler a informação necessária a partir de suas instruções genéticas é a cópia de uma parcela específica da sequência de nucleotídeos de um gene (DNA) sob a forma de uma sequência de nucleotídeos de RNA. Há diferenças químicas entre a informação na forma de RNA e DNA, mas a linguagem de ambos é a mesma. O QUE É O RNA? O RNA é um polímero linear composto de 4 tipos diferentes de subunidades nucleotídicas unidas entre si por ligações fosfodiéster. A diferença química entre o RNA e o DNA são: 1) os nucleotídeos do RNA são ribonucleotídeos (contém o açúcar ribose em vez de desoxirribose); 2) o RNA contém as bases adenina(A), guanina(G), citosina(C) e uracila(U), ao invés de timina(T). OBS: As propriedades de complementaridade por pareamento de bases descritas para o DNA também se aplicam para o RNA (G-C, A-U). DNA X RNA: Apesar da diferença química ser pequena, a diferença estrutural entre o DNA e o RNA é muito grande. O DNA sempre se encontra nas células sob a forma de uma hélice de fita dupla e longa, já o RNA se apresenta como fita simples e curta. Essa conformação do RNA lhe confere liberdade de dobrar- se sob diversas formas. Sendo assim, essa capacidade forma estruturas tridimensionais complexas que serão responsáveis por funções estruturais e catalíticas. feitas por radiação ionizante (raio X) e por algumas substâncias químicas. Os genes responsáveis pelo câncer de mama hereditário codificam proteínas envolvidas no reparo de quebra da fita dupla por recombinação homóloga. Ocorre um “empréstimo” da fita parental. 13 TRANSCRIÇÃO: A transcrição difere da replicação em vários aspectos: 1) a fita de RNA não permanece ligada por ligações de hidrogênio à fita de DNA-molde; 2) imediatamente após a região onde os ribonucleotídeos foram adicionados, a cadeia de RNA é deslocada e a hélice de DNA se reassocia e dessa forma, as moléculas de RNA produzidas pela transcrição são liberadas do DNA-molde sob a forma de fita simples; e 3) como esses RNAs são copiados unicamente de uma região definida do DNA, as moléculas de RNA são muito menores que as moléculas de DNA. ENZIMAS QUE REALIZAM A TRANSCRIÇÃO: A principal enzima responsável pela síntese do RNA é a RNA-polimerase. É uma enzima complexa composta de múltiplas cadeias polipeptídicas. A enzima completa da E. coli é composta pelas subunidades: α, β, β’, ω e σ. A subunidade σ está ligada de forma relativamente fraca e pode dissociar-se das demais subunidades e essa subunidade não é necessária para a atividade básica catalítica da enzima. As enzimas que realizam a transcrição são as RNA-polimerases. Essas enzimas catalisam a formação de ligações fosfodiéster que conectam os nucleotídeosentre si. A RNA-polimerase move-se sobre o DNA desespiralizando a dupla-hélice expondo novas regiões para o pareamento de bases por complementaridade. A cadeia de RNA é estendida em um nucleotídeo por vez na direção 5’-3’. OBS: A hidrólise de ligações altamente energéticas fornece energia necessária para impulsionar a reação. OBS: A medida que o RNA está sendo sintetizado, sua liberação é quase imediata da fita de DNA, fazendo com que muitas cópias de RNA podem ser produzidas a partir de um mesmo gene em um período de tempo pequeno. A sequência de DNA na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição de um gene é chamada de promotor. A subunidade σ liga-se especificamente a sequências presentes tanto na região promotora -35 quanto na região -10. Durante o alogamento, a polimerase permanece associada com o seu molde enquanto continua a síntese de RNAs. À medida que se move, a polimerase desenrola o DNA-molde à sua frente e o enrola novamente após a sua passagem. A síntese de RNA prossegue até que a polimerase encontre um sinal de terminação, ponto no qual a transcrição pára, o RNA é liberado da enzima que se dissocia do molde do DNA. DNA X RNA-POLIMERASE: RNA e DNA-polimerase: 1)a RNA-polimerase catalisa ligação de ribonucleotídeos; 2)diferentemente da DNA-polimerase, a RNA-polimerase pode começar a síntese de uma cadeia de RNA sem precisar de um iniciador (primer). Essas diferenças ocorrem porque o RNA, diferentemente do DNA, não estoca informação genética permanentemente nas células e as consequências de um erro na transcrição do RNA são muito menos significativos do que aquelas na replicação do DNA. OBS: Embora as RNA-polimerases não sejam tão exatas quanto as DNA-polimerases, elas têm um pequeno mecanismo de correção Se um ribonucleotídeo for adicionado incorretamente, a polimerase pode retornar e o sítio ativo da enzima pode realizar um mecanismo de excisão e o ribonucleotídeo é liberado. TIPOS DE RNA: 14 As células produzem diversos tipos de RNA: 1)RNA-mensageiro (mRNA): moléculas que são copiadas a partir dos genes (DNA) e que definem a síntese de proteínas; 2)RNA-nuclear (snRNA): pequenos RNAs que direcionam o splicing (excisão de íntrons) do pré-RNA para formar o mRNA; 3)RNA- ribossomal (rRNA): forma o cerne dos ribossomos e catalisam a síntese proteica; 4)RNA-transportador (tRNA): formam os adaptadores que selecionam aminoácidos e os colocam no local adequado nos ribossomos para serem incorporados em proteínas; 5)RNA-citoplasmatico (scRNA): participa do transporte intracelular de proteínas; 6)RNA-de interferência (siRNA): participa na regulação da expressão gênica. Cada segmento transcrito de DNA é chamado de unidade de transcrição. Nos eucariotos, uma unidade de transcrição carrega apenas a informação de um único gene, portanto codifica para uma única molécula de RNA ou para uma única proteína. Já nos procariotos, um conjunto de genes adjacentes é transcrito como uma unidade e a molécula de mRNA resultante carrega informação para várias proteínas distintas. Para transcrever um gene com precisão, a RNA-polimerase deve reconhecer onde ela inicia e termina no genoma. A maneira que isso é feito difere nos organismos eucariotos e procariotos. OBS: A iniciação da transcrição é extremamente importante, uma vez que regula quais as proteínas que devem ser produzidas e com que frequência. TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS: TRANSCRIÇÃO PROCARIOTOS A transcrição em procariotos se inicia com a associação de um fator sigma que se associa à RNA-polimerase, formando a holoenzima RNA- polimerase. Esse complexo enzimático se adere fracamente ao DNA bacteriano até chegar a uma região denominada de promotor (sequência especial de nucleotídeos indicando o ponto inicial para a síntese de RNA), na qual a RNA-polimerase adere-se fortemente ao DNA. OBS: Quem reconhece o sítio de iniciação é o fator sigma. Após a RNA-polimerase aderir-se firmemente ao DNA, ela abre a dupla-hélice para expor uma pequena quantidade de nucleotídeos em cada fita e uma das fitas serve de molde para o início da transcrição. Alguns nucleotídeos são adicionados e após cerca de 10 nucleotídeos de RNA serem sintetizados, a enzima quebra as interações com o promotor e o fator sigma é liberado. A partir desse momento, a RNA-polimerase desliza sobre o DNA e vai sintetizando RNA e, quando se depara com o terminador (segundo sinal), a polimerase para e libera tanto a cadeia molde de DNA quanto a cadeia de RNA sintetizada. OBS: Em bactérias, moléculas de RNA são sintetizadas por um único tipo de RNA-polimerase. OBS: Tanto a polimerase quanto o fator sigma são recicláveis e podem se reassociar para começar outro processo de transcrição. 15 O sinal de terminação consiste de uma fita de pares de nucleotídeos A-T, precedida por uma sequência de DNA duplamente simétrica, a qual, quando transcrita em RNA, dobra-se em uma estrutura de grampo de cabelo. Essa conformação auxilia a empurrar o sítio ativo da RNA-polimerase, impedindo a síntese do RNA e fazendo com que essa enzima se desligue do DNA. A escolha da fita molde depende da direção da enzima RNA-polimerase. No caso dessa figura, como a RNA-polimerase está indo para a esquerda, a fita molde é a de cima e na figura abaixo, como a RNA-polimerase está indo para a direita, a fita molde é a de baixo. TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS: A transcrição em eucariotos é mais complexa e pode ser realizada a partir de 3 enzimas diferentes: a RNA-polimerase I, RNA-polimerase II e RNA-polimerase III. As 3 são estruturalmente similares mas transcrevem diferentes tipos de genes. As RNA-polimerases I e III transcrevem os genes que codificam o tRNA, rRNA e vários pequenos RNAs. A RNA-polimerase II transcreve a grande maioria dos genes, inclusive todos aqueles que codificam proteínas. Para que a RNA-polimerase procariótica funcione transcrevendo o DNA, ela necessita apenas do fator sigma (proteína adicional), no entanto a RNA- polimerase eucariótica requer diversas proteínas adicionais (coletivamente denominadas de fatores gerais de transcrição). Além dessa diferença, a iniciação da transcrição eucariótica precisa lidar com o DNA empacotado em nucleossomos e sob outras formas de estruturação da cromatina, características ausentes dos cromossomos bacterianos. Os fatores gerais de transcrição ajudam a posicionar a RNA-polimerase eucariótica corretamente sobre o promotor, auxiliam na separação das duas fitas de DNA para permitir que a transcrição se inicie e liberam a RNA-polimerase do promotor para deslizar sobre a fita de DNA. 16 O fator de transcrição TFIID, a partir da sua subunidade TBP, reconhece e se liga ao promotor (que contém uma sequência de DNA denominada de TATA box) e que está localizado a 25 nucleotídeos do início da transcrição. Essa ligação provoca uma mudança conformacional na molécula de DNA que faz com que outros fatores gerais de transcrição se associem no promotor, inclusive a RNA-polimerase II. Um fator importante que se liga posteriormente é o TFIIH que contém uma DNA-helicase que hidrolisa o ATP e permite que a fita dupla se desespiralize e também contém uma cinase que fosforila a cauda (CTD) da RNA- polimerase II para que ela seja liberada dos fatores gerais de transcrição e possa deslizar na fita molde de DNA. OBS: A RNA- polimerase II sofre diversas mudanças conformacionais nesse processo que auxiliam no fortalecimento da sua interação com o DNA e adquire novas proteínas que lhe permitem transcrever por longas distâncias (porvárias horas) sem se dissociar do DNA. 17 A polimerase II também precisa de proteínas modificadoras de cromatina, ativadoras e mediadoras para iniciar a transcrição. As proteínas reguladoras de genes (ativadores transcricionais) se ligam a sequências específicas no DNA e ajudam a atrair a RNA-polimerase II para o ponto de início da transcrição. Além dessas proteínas, a iniciação da transcrição necessita de um complexo proteico denominado mediador, o qual permite que as proteínas ativadoras se liguem adequadamente com a polimerase II e com os fatores gerais de transcrição. O recrutamento de enzimas modificadoras de cromatina (complexos remodeladores de cromatina e enzimas modificadoras de histonas) é necessário para que a transcrição possa ocorrer. Nas células eucarióticas, a molécula de RNA produzida por transcrição contém tanto sequências codificantes (éxons) e não-codificantes (íntrons). Antes da molécula de RNA ser traduzida em proteína, as duas extremidades do RNA são modificadas, os íntrons são removidos por reação de RNA splicing catalisada enzimaticamente e o mRNA resultante é exportado para o citoplasma (onde será traduzido). OBS: O splicing pode ser simultâneo à transcrição do RNA. Já nos procariotos, a extremidade 5’ do mRNA é produzida a partir da iniciação da transcrição e a extremidade 3’ é produzida a partir da terminação da transcrição. Como as células procarióticas não contém núcleo, a transcrição e tradução ocorrem no mesmo lugar. REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO GÊNICA: OS REPRESSORES E O CONTROLE NEGATIVO DA TRANSCRIÇÃO (Procariotos): 18 Controle negativo – Operon lac. O gene i codifica para um repressor que, na ausência de lactose, liga-se ao operador (o) e interfere com a ligação da RNA polimerase ao promotor, bloqueando a transcrição dos três genes estruturais (z-β galactosidade, y- lactose permease ou a-transacetilase). A lactose induz a expressão do operon por ligação ao repressor impedindo, assim, que o repressor se ligue ao operador. Controle negativo – Operon Triptofano Presença de triptofano repressor ativo; Ausência de triptofano RNA polimerase consegue transcrever o gene. CONTROLE POSITIVO DA TRANSCRIÇÃO (Operon lac): Controle positivo – Operon lac. O AMP cíclico liga-se à proteína ativadora de catabólito (CAP) e estimula vários operons relacionados com o metabolismo de açúcares alternativos, como a lactose. A proteína CAP interage com a subunidade α da RNA polimerase para facilitar a ligação da polimerase ao promotor. 19 SPLICING DO PRÉ-mRNA: Os genes eucarióticos são encontrados sob a forma de pequenos pedaços de sequências codificantes (sequências expressas ou éxons) intercaladas por sequências muito mais longas, as sequências intervenientes ou íntrons. Dessa forma, a porção codificante de um gene eucariótico é, em geral, apenas uma pequena fração de comprimento do gene. Todas as sequências de íntrons e éxons são transcritas em RNA. As sequências dos íntrons são removidas do RNA recentemente sintetizado por meio de um processo denominado de splicing de RNA (splicing do precursor de mRNA ou pré-mRNA). OBS: Somente após o splicing e o processamento das extremidades 5’ e 3’ esse RNA será denominado mRNA. Reação de splicing do pré-mRNA. No primeiro passo, um nucleotídeo de adenina específico na sequência do íntron ataca a região 5’ de splicing e corta a estrutura de açúcar-fosfato do RNA nesse ponto. A extremidade 5’ cortada do íntron torna-se covalentemente ligada ao nucleotídeo de adenina, criando assim uma alça na molécula de RNA. A extremidade 3’ OH livre liberada da sequência do éxon reage com o início da sequência do éxon seguinte, unindo os dois éxons e liberando a sequência do intron em forma de laço. Os dois éxons se unem formando uma sequência codificante contínua e a sequência do íntron é liberada e degradada no momento adequado. OBS: A maquinaria que catalisa o splicing do pré-RNA é complexa. Essa complexidade é necessária para assegurar que o splicing seja exato. O splicing de RNA também apresenta uma vantagem. Os transcritos de muitos genes eucarióticos sofrem splicing de diferentes maneiras (splicing alternativo), permitindo que um mesmo gene produza um grupo correspondente de diferentes proteínas. Isso permite aos eucariotos incrementar o já enorme potencial codificante de seus genomas. O mecanismo de splicing de pré-mRNA implica que a maquinaria de splicing deve reconhecer 3 regiões: a região de splicing 5’, a região de splicing 3’ e o ponto da forquilha na sequência do íntron que forma a base do fragmento em laço a ser excisado. Cada um desses 3 sítios tem uma sequência nucleotídica consenso, que é similar entre os íntrons e fornece para a célula dicas a respeito do local de onde deve ocorrer o splicing. 20 Sequências consenso de nucleotídeos em uma molécula de RNA que sinalizam o início e o final da maioria dos íntrons humanos. Apenas 3 blocos de sequência de nucleotídeos são suficientes para a remoção de um íntron; o restante do íntron pode ser ocupado por qualquer nucleotídeo. A, G, U e C são os nucleotídeos padrão do RNA; R representa uma purina (A ou G) e Y representa uma pirimidina (C ou U). O A em vermelho forma o ponto de forquilha do laço produzido pelo splicing. Somente GU no início do íntron e AG no seu final são nucleotídeos invariantes nas sequências consenso do splicing. SPLICEOSSOMO: As etapas-chave do splicing do RNA são realizadas por moléculas de RNA e não por proteínas. Moléculas especializadas de RNA reconhecem as sequências nucleotídicas que especificam onde o splicing deve ocorrer e também participam na química do splicing. Essas moléculas, conhecidas como snRNAs são relativamente pequenas e existem 5 delas: U1, U2, U4, U5 e U6, envolvidas na principal forma de splicing do pré-mRNA. OBS: Cada molécula de snRNA é complexada com pelo menos 7 subunidades proteicas para formar uma snRNPs (pequena ribonucleoproteína nuclear). As snRNPs formam o cerne do spliceossomo. 21 Mecanismo de splicing do pré- mRNA. No primeiro momento a snRNP U1 se liga com a junção 5’ do splicing, posteriormente a snRNP U2 se liga à base nitrogenada adenina (região do ponto de forquilha) e logo após o complexo U4/U6 e U5 formam o laço. O complexo U4 e U6 estão unidos firmemente pelas interações de pares de bases. Após a formação do laço, o sítio 5’ é clivado e, posteriormente, o complexo U5 liga- se ao sítio 3’ do splicing e cliva-o. O íntron é removido, restando apenas os éxons, formando o mRNA. Os estágios iniciais do splicing ocorrem à medida que as moléculas de pré-mRNA estão sendo sintetizadas por uma RNA-polimerase II. Enquanto a transcrição ocorre, a cauda fosforilada da RNA- polimerase carreia vários componentes do spliceossomo e esses componentes são diretamente transferidos da polimerase para o RNA, à medida que esse RNA é sintetizado. OBS: Essa coordenação entre transcrição e splicing é extremamente importante para evitar a retirada inadequada de éxons. OBS: Existem vários sistemas de controle de qualidade que rapidamente destroem mRNAs cujo splicing ocorreu de forma inadequada. 22 PROCESSAMENTO DO RNA: A polimerase não somente transcreve DNA em RNA, mas também transporta proteínas processadoras do pré-mRNAem sua cauda que serão transferidas para o RNA no momento especifico. Quando a cauda da RNA-polimerase for fosforilada, as proteínas de capeamento se ligam à molécula de RNA na extremidade 5’ que está sendo sintetizada. OBS: A cauda da RNA-polimerase é extensivamente fosforilada, fazendo com que proteínas de splicing e de processamento 3’ sejam posicionadas para agir sobre o RNA. OBS: Uma vez que a polimerase II termina de transcrever, ela é liberada do DNA, seus fosfatos são removidos e ela pode reiniciar a transcrição. Apenas essa forma desfosforilada que pode iniciar a transcrição. A extremidade 5’ de um pré-mRNA produzido pela RNA-polimerase II é capeada quase que imediatamente à sua saída da RNA-polimerase. À medida que a polimerase continua seu movimento ao longo de um gene, os componentes do spliceossomo reúnem-se sobre o RNA e determinam os limites entre os éxons e os íntrons. Quando a RNA-polimerase se aproxima do final de um gene, um mecanismo similar assegura que a extremidade 3’ do pré-mRNA seja corretamente processada. A extremidade 3’ de cada molécula de RNA é especificada por um sinal codificado no genoma. Duas proteínas são extremamente importantes nesse processo: fator de estimulação à clivagem (CstF) e fator de especificidade de clivagem e poliadenilação (CPSF). O RNA é clivado e uma enzima chamada de poli-A- polimerase (PAP) adiciona, um a um, aproximadamente 200 nucleotídeos à extremidade 3’ (produzida pela clivagem, a partir das duas proteínas já citadas). OBS: A PAP não necessita de um molde, portanto a cauda de poli-A dos mRNAs eucarióticos não está diretamente codificada no genoma. Abaixo, imagem para ilustrar. 23 3-TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DNA - DNA: Replicação DNA - RNA: Transcrição RNA - Proteína: Tradução Tradução: De RNA à Proteína – Síntese protéica: Tradução é o nome utilizado para designar o processo de síntese de proteínas. É um processo biológico no qual a sequência nucleotídica de uma molécula de mRNA (RNA mensageiro) é utilizada para ordenar (servir como molde p/) a síntese de uma cadeia polipeptídica com sequência de aminoácidos que determina uma proteína. Ocorre no citoplasma. As proteínas são os efetores da maioria dos processos celulares, executando uma grande quantidade de tarefas que são dirigidas pela informação codificada no DNA genômico. A tradução é a etapa final da expressão gênica. Após a tradução do DNAm a cadeia polipeptídica dobra-se na conformação tridimensional e sofre varias etapas de processamento até chegar a sua forma ativa. Todos os RNAs mensageiros são lidos na direção de 5’ para 3 ’ e as cadeias polipeptídicas são sintetizadas da extremidade amina para a carboxila terminal, cada aminoácido é especificado por 3 bases nitrogenadas que é igual a um Códon no RNAm, por exemplo as bases Uracila, citosina e uracila unidas nessa ordem formam um códon UCU que corresponde ao aminoácido serina, a união de uma sequência de aminoácidos formará uma proteína. A tradução é realizada nos ribossomos com os RNAs transportadores servindo como adaptadores entre o molde de RNAm e os aminoácidos que estão sendo incorporados a proteína. Envolve interações com RNAm, RNAr, RNAt e proteínas necessárias para tradução. Obs: Existem enzimas como: Aminoacil-RNAt sintetase – cujo nome real (esse é um nome genérico) vai depender do aminoácido que está associado. (sintetiza) ela funciona como um adaptador, sua função é inserir e a enzima Peptidil transferase que cliva o aminoácido (RNAr) O Código Genético: cada códon lido vai determinar um aminoácido, o códon AUG sempre codifica o aminoácido metilamina e sempre vai estar presente em qualquer proteína. Os códons são universais. O códon de terminação não codifica nada (UAA, UAG e UGA), só sinaliza a terminação. É de extrema importância a presença de um códon iniciador para definir um início e para definir como se dará a leitura da proteína para que essa não seja traduzida aleatoriamente. Obs: A direção é sempre 5’- 3’. O CÓDIGO GENÉTICO O genoma mitocondrial humano 24 CÓDON CÓDIGO UNIVERSAL CÓDIGO MITOCONDRIAL HUMANO UGA PARADA Try AGA Arg PARADA AGG Arg PARADA AUA Ile Met Etapas da síntese protéica • Início: AUG • Alongamento • Término: UAA, UAG, UGA 1. RNAs transportadores Neste processo, moléculas de RNA transportador (tRNA) operam a tradução reconhecendo as sequências nucleotídicas do RNAm e correlacionando-as com a sequência que corresponde a determinados aminoácidos. RNAs transportadores, RNAt. Assim chamados porque serão os responsáveis pelo transporte de aminoácidos até o local onde se dará a síntese de proteínas junto aos ribossomos. São moléculas de RNA de fita simples, de pequeno tamanho, contendo, cada uma, cerca de 75 a 85 nucleotídeos. Cada fita de RNAt torce-se sobre si mesma, adquirindo o aspecto de trevo, visto na figura ao lado. Duas regiões se destacam em cada transportador: uma é o local em que se ligará o aminoácido a ser transportado (que se caracteriza por uma sequencia CCA no seu 3’ terminal) e a outra corresponde ao trio de bases complementares do RNAt, chamado anticódon, que forma uma “alça” que se encaixará no códon correspondente do RNAm. Anticódon é o trio de bases do RNAt, complementar do códon do RNAm. Sítios de Ligação do RNAt: Sítios de Ligação: RNA – Ribossomo 25 A – Aminoacil insere a metilamina P – é o sítio da Peptidil, onde ela vai clivar o aminoácido para que ele possa ser inserido E – Saída Alguns nucleotídeos incomuns nos RNAt Estrutura do RNAt 2. O ribossomo e o RNAr Estrutura dos ribossomos: São designados de acordo com sua taxa de sedimentação. Procarioto- 70s e Eucarioto-80s Na célula a tradução é processada em estruturas chamadas de ribossomos, que posicionam corretamente RNAs transportadores com RNAs mensageiros e catalisam as ligações peptídicas entre aminoácidos para a síntese de proteínas. Os ribossomos são compostos por duas subunidades e agem de maneira a percorrer a totalidade da cadeia de RNA mensageiro. O papel do RNA transportador nesse processo seria o de conectar os códons do RNA mensageiro com os devidos aminoácidos espalhados pelo citoplasma. Ao efetuar tal processo, o ribossomo fará a ligação peptídica entre os códons trazidos pelo RNA transportador, gerando a fita protéica. 26 Montagem das Unidades Ribossomais: RNA ribossômico associando-se a proteínas interagem formando o ribossomo propriamente dito. As fitas de RNAr formarão os ribossomos, orgânulos responsáveis pela leitura da mensagem contida no RNA mensageiro; Pareamento Oscilante (pareamento de códon-anticódon atípico) O pareamento de bases na terceira posição é relaxado, permitindo que o G parei com o U, e a inosina (I) no anticóndon parei com U, C ou A. Nas figuras estão dois exemplos de pareamento anormal de bases permitindo que o RNAt da fenilalanina (Phe) reconheça códons UUC ou UUU e o RNAt da alanina (Ala) reconheça GCU, GCC ou GCA. Tradução: Síntese de Proteínas A molécula que fornece a informação genética a ser traduzida é o RNA mensageiro. Este contém uma sequência de nucleotídeos que é lida, pelo RNA transportador (que possui uma série de anticódons) de três em três bases. Cada trinca de bases do RNA mensageiro representa um códon e está relacionada a um aminoácido específico. A inserção de aminoácidos na cadeia polipeptídicacrescente ocorre na mesma ordem em que os seus respectivos códons aparecem na molécula de RNA mensageiro. O RNA produzido que contém uma seqüência de bases nitrogenadas transcrita do DNA é um RNA mensageiro. 27 No citoplasma, ele será um dos componentes participantes da síntese de proteínas, juntamente com outros dois tipos de RNA, todos de fita simples e produzidos segundo o mesmo processo descrito para o RNA mensageiro. A organização de RNAm A tradução não inicia na extremidade 5’ do RNAm, ela começa em sítios específicos de iniciação. As porções terminal 5’ de RNAm de procariontes e eucariontes são sequencias não codificadoras (regiões 5’ não-traduzida). Os RNAm eucariontes eucarióticos usualmente codificam para uma única cadeia polipeptídica, mas muitos RNAs mensageiros procarióticos codificam para múltiplos polipeptídeos que são sintetizados a partir de sítios de iniciação distintos. Em ambos tipos celulares a tradução sempre inicia a partir do aminoácido metionina (AUG). Algumas bactérias usam o GUC, que geralmente codifica valina, mas quando se encontram no começo de uma cadeia polipeptídica vai direcionar a incorporação de metionina. Na maioria das bactérias e mitocôndrias a síntese proteica é iniciada pela metionina modificada, enquanto que nos eucariotos pela não modificada. RNAm monocistrônico e policistrônico Os RNAsm que codificam múltiplos polipeptídeos são chamados de policistrônicos. E os que codificam para uma única cadeia polipeptídica são chamados monocistrônicos. A correspondência entre uma trinca de nucleotídeos e um aminoácido é chamada de código genético. Combinando os 4 nucleotídeos em triplas obtém-se 64 combinações. Embora esse número seja superior aos 20 aminoácidos existentes, mais do que um códon pode representar um mesmo aminoácido. Dentre os códons possíveis, 3 não especificam aminoácidos, e referem-se a sinais de terminação da síntese de um cadeia de aminoácidos. Esses códons são chamados de códons de parada. O código genético estabelece também um códon de início AUG, pelo qual começa o processo de tradução do mRNA. Na maioria das 28 proteínas o códon de início especifica o aminoácido metionina, que também está presente no interior das cadeias. Os sinais que identificam os códons de iniciação são diferentes em procariotos e eucariotos. Os códons de iniciação em RNAs mensageiros bacterianos são precedidos por uma sequência especifica (shine-delgarno) que alinha o RNAm no ribossomo para a tradução pelo pareamento de bases com uma sequencia complementar próxima ao 3’ terminal do RNAr 16S. Essa interação permite que o ribossomo bacteriano inicie a tradução não só pela extremidade 5’, mas também nos sítios de iniciação internos de mensagens policistrônicas. Os ribossomos reconhecem os RNAsm eucarióticos pela ligação ao cap 7 metilguanosina em sua extremidade 5’. Os ribossomos, então, procuram a partir co cap 5’ um códon de iniciação AUG. Sequencias que rodeiam AUG afetam a eficiência da iniciação, de modo que, quando o 1º códon AUG é desviado a tradução inicia a partir do AUG posterior. Sumariamente, o processo de tradução é realizado da seguinte maneira: ao combinar-se com os ribossomos, o RNAm tem sua seqüência de códons lida, e para cada codon o respectivo tRNA é atraído até os ribossomos, e pela complementariedade de bases é feita a ligação entre o codon (do mRNA) e o anticodon (do RNAt), liberando o aminoácido carregado pelo tRNA que é então ligado à cadeia crescente do polipeptideo. Moléculas de RNA transportador (=transfer RNA) agem como adaptadores entre a seqüência codificante dos nucleotídeos do mRNA e o aminoácido que é codificado. Uma ponta dessa molécula carrega o aminoácido e uma outra ponta consiste de uma seqüência de três nucleotídeos conhecida como anticódon. A síntese da proteína é encerrada quando os ribossomos encontram um códon de parada no mRNA. Os processos de transcrição e tradução dos procariotos e eucariotos apresentam diferenças entre si. Dentre essas diferenças há duas principais. A primeira é que em procariotos o processo de tradução de um mRNA inicia-se antes que a transcrição do mesmo tenha se encerrado (a transcrição e a tradução ocorrem concomitantemente). Já nos eucariotos, a tradução é iniciada somente após a finalização da transcrição, e nesse caso o mRNA sai do núcleo para o citoplasma onde é realizada a tradução. A segunda diferença é que nos eucariotos o mRNA sofre modificações antes de ser traduzido. O produto da transcrição (o mRNA), chamado de transcrito primário, sofre mudanças e somente após estas mudanças este mRNA agora “maduro” pode ser transportado do núcleo da célula para o citoplasma onde ocorrerá o processo de tradução. Uma mudança importante sofrida pelo mRNA antes de sair do núcleo é a retirada dos introns. Os introns são pequenos pedaços de um gene que são transcritos mas não participam do processo de tradução. Somente participarão da montagem da proteína os pedaços de um gene chamados de exons. Além das duas grandes diferenças acima, uma diferença mais peculiar é que em eucariotos, um transcrito contém apenas o produto de um único gene, jé em procariotos, um transcrito pode conter mais de um gene pelo fato da grande maioria dos genes de procariotos estarem organizados na forma de operons. O processo de tradução (mecanismo) De um modo geral, durante o processo de tradução, ocorre em primeiro lugar a ligação da molécula de RNA mensageiro ao ribossoma. De seguida o transporte de aminoácidos até ao ribossoma pelas aminoacil 29 tRNA sintetases, formam-se as ligações peptídicas entre aminoácidos e assim a cadeia polipeptídica vai crescendo. Na presença de um codão stop, o complexo dissocia-se e a tradução termina. A informação contida na molécula de mRNA, ou seja, a sua sequência de bases, é organizada em codões, isto é, cada codão (3 bases) é específico para um aminoácido. O código genético define a atribuição entre codões e aminoácidos. O mecanismo de tradução pode ser dividido em três passos principais: iniciação, alongamento e terminação. Iniciação Primeiro passo: ligação de iniciador especifico de RNAt metionil e do RNAm à subunidade ribossomal pequena. A subunidade grande liga o complexo, formando um ribossomo funcional. Para iniciar a tradução em bacterias, é necessária a participação de vários factores chamados de factores de iniciação: IF1, IF2 e IF3 que se liga a subunidade ribossomal 30S. Então o aminoácido o RNAm e o RNAt N-formilmetionina iniciador se unem ao complexo, com IF2 (ligado a GTP) reconhecendo especificamente o RNAt iniciador. O IF3 é liberado permite associação da subunidade 50S ao complexo hidrolise de GTP ligado ao IF2 liberação de IF1 e IF2 ligado a GDP formação de um complexo de iniciação 70S. Em eucariotas, são necessários mais do que 3 factores de iniciação, requer no mínimo 10 preteínas, são designados por eIFs (fatores eucarióticos de iniciação. A tradução inicia com os fatores eIF-1, eIF-1A, eIF-3, eIF-5 ligados a subunidade 40S e o eIF-2 (em complexo com GTP) associado com o RNAt metionil iniciador RNAm reconhecido é levado ao ribossomo pelo grupo eIF- 4. O cap da extremidade 5’ do mRNA é reconhecido pelo eIF-4E. O fator eIF-4G liga-se ao eIF-4E e a uma proteína PABP (de ligação ao poli-A) associada com a cauda de poli-A na extremidade 3’ do RNAm. Dessa forma, os fatores de iniciação reconhecem tanto a extremidade 5’ como a 3’ dos RNAm e são responsáveis pelo efeito estimulatório da poliadenilação na tradução. Os fatores de iniciaçãoeIF-4E e eIF-4G associado a eIF-4ª e eIF-4B levam o RNAm a subunidade 40S, com eIF-4G interagindo com eIF-3. Subunidade 40S + RNAt metionil e eIFs ligados, percorre o RNAm, até encontrar o primeiro códon de iniciação AUG eIF-5 desencadeia a hidrolise de GTP ligado ao eIF-2 fatores de iniciação liberados unidade 60S une-se à 40S complexo de iniciação 80S de células eucariótica. Alongamento 30 O crescimento da cadeia polipeptídica é ajudado por factores proteicos de alongamento designados por EF-Tu, EF-Ts e EF-G. O ribossomo tem 3 sítios para ligação do RNAt (P-peptidil, A-aminoacil e E-saída). O tRNA metionil iniciador é ligado ao sítio P. Ligação do RNAt aminoacil ao sítio A pelo pareamento do segundo códon do RNAm. é acompanhado até o ribossomo pelo fator de alongamento (EF-tu em procariotos r eEF-1α em eucariotos) ligado a GTP. A seleção correta do RNAt aminoacil em uma cadeia em crescimento é a etapa crítica que determina a precisão da síntese proteica. A taxa de erro é de, aproximadamente, 0,001 isso se deve também por um centro de decodificação (na subunidade pequena) que identifica os pares de bases corretos no códon-anticódon e discrimina os pareamentos incorretos. A inserção correta de um aminoacil- RNAt no sitio A desencadeia uma mudança conformacional induz a hidrolise de GTP ligado ao EF-tu (eEF-1α) e a liberação do fator de alongamento ligado ao GDP. EF-tu (eEF-1α) deixa o ribossomo ligação peptídica entreRNAt metionil iniciador no sitio Pe o segundo RNAt aminoacil no sitio A (reação catalisada pela subunidade grande e participação do RNAr fazendo a identificação do pareamento correto entre o códon-anticódon) transferência da metionina para o RNAt aminoacil no sitio A formando um RNAt peptidil nesta posição RNAt iniciador descarregado no sitio P. Ocorre a translocação que necessita de outro fator de alongamento (EF-G procarioto e eEF-2 em eucarioto) acoplado a hidrólise de GTP. Durante a translocação o ribossomo move-se 3 nucleotídeos sobre o RNAm posicionando o próximo códon em um siti A vazio translocação do RNAt peptidil do sítio A para o P RNAt descarregado vai do sitio P para o E. Novo RNAt aminoacil ligado ao sitio A liberação do RNAt descarregado do sitio E Ribossomo pronto para inserção do próximo aminoácido. Conversão requer outro fator de alongamento EF-Ts (eEF-1βγ) que se une ao complexo EF-Tu GDP troca de GDP ligado por um GTP resultado da regeneração de EF-Tu GTP (que está pronto para acompanhar um novo RNAt aminoacil ao sitio A) começando um novo ciclo de alongamento. A regulação de EF-Tu pela ligação e hidrolise de GTP ilustra um modo comum de regulação das atividades proteicas. (não cai na prova). O alongamento continua até que um códon de parada seja translocado no sítio A do ribossomo. As células não tem RNAt com anticódons complementares a esses, ao invés disso, elas tem fatores de liberação que reconhecem os sinais e terminam a síntese proteica. 31 Regeneração do EF-Tu/GTP: Esse complexo acompanha o RNAt aminoacil ao ribossomo. O GTP ligado é hidrolisado quando o RNAt correto é inserido, sendo que o EF-Tu/GTP é liberado. O complexo EF-Tu/GDP é inativado e incapaz de ligar outro RNAt. Para que a tradução continue, o complexo EF-Tu/GTP ativo deve ser regenerado por outro fator, EF-Ts, que troca GDP ligado pelo GTP livre. Terminação Os codões de terminação são: UAG, UAA e UGA. Estes tripletos não são reconhecidos por um tRNA mas sim por factores proteicos chamados de fatores de terminação, que abreviando, se designam de RF-1 (UAA ou UAG) e RF-2 (UAA ou UGA). Em eucariotas, existe um único fator de terminação que reconhece os três códons Stop, UAG, UAA e UGA que é o eRF-1. Tem também os fatores de liberação RF-3 e eRF-3 que não reconhecem códons de terminação, mas, agem juntamente com o RF-1 (eRF-3) e RF-2. Esses fatores unem-se a códons de terminação no sitio A e estimulam a hidrolise da ligação entre o RNAt e a cadeia polipeptídica no sítio P liberação do polipeptídeo completo ribossomo dissocia-se nas subunidades 30S e 50S, libertando o último RNAt e o RNAm molde. Fatores de tradução 32 RNA - Tradução passo a passo A tradução é um processo no qual haverá a leitura da mensagem contida na molécula de RNAm pelos ribossomos, decodificando a linguagem de ácido nucléico para a linguagem de proteína. Cada RNAt em solução liga-se a um determinado aminoácido, formando-se uma molécula chamada aminoacil-RNAt, que conterá, na extremidade correspondente ao anticódon, um trio de códon do RNAm. Para entendermos bem este processo, vamos admitir que ocorra a síntese de um peptídeo contendo apenas sete aminoácidos, o que se dará a partir da leitura de um RNAm contendo sete códons (21 bases hidrogenadas). A leitura (tradução) será efetuada por um ribossomo que se deslocará ao longo do RNAm. Esquematicamente na síntese protéica teríamos: Um RNAm, processado no núcleo, contendo sete códons (21 bases hidrogenadas) se dirige ao citoplasma. No citoplasma, um ribossomo se liga ao RNAm na extremidade correspondente ao início da leitura. Dois RNAt, carregando os seus respectivos aminoácidos (metionina e alanina), prendem-se ao ribossomo. Cada RNAt liga-se ao seu trio de bases (anticódon) ao trio de bases correspondentes ao códon do RNAm. Uma ligação peptídica une a metionina à alanina. O ribossomo se desloca ao longo do RNAm. O RNAt que carregava a metionina se desliga do ribossomo. O quarto RNAt, transportando o aminoácido leucina, une o seu anticódon ao códon correspondente do RNAm. Uma ligação peptídica é feita entre a leucina e a alanina. O ribossomo novamente se desloca. O RNAt que carregava a alanina se desliga do ribossomo. O quarto RNAt, transportando o aminoácido ácido glutâmico encaixa-se no ribossomo. Ocorre a união do anticódon desse RNAt com o códon correspondente do RNAm. Uma ligação peptídica une o ácido glutâmico à leucina. Novo deslocamento do ribossomo. O quinto RNAt, carregando a aminoácido glicina, se encaixa no ribossomo. Ocorre a ligação peptídica da glicina com o ácido glutâmico. Continua o deslocamento do ribossomo ao longo do RNAm. O sexto RNAt, carregando o aminoácido serina, se encaixa no ribossomo. Uma ligação peptídica une a serina à glicina. Fim do deslocamento do ribossomo. O último transportador, carregando o aminoácido triptofano, encaixa-se no ribossomo. Ocorre a ligação peptídica do triptofano com a serina. O RNAt que carrega o triptofano se separa do ribossomo. O mesmo ocorre com o transportador que portava a serina. 33 O peptídeo contendo sete aminoácidos fica livre no citoplasma. Claro que outro ribossomo pode se ligar ao RNAm, reiniciando o processo de tradução, que resultará em um novo peptídio. Perceba, assim, que o RNAm contendo sete códons (21 bases nitrogenadas) conduziu a síntese de um peptídeo formado por sete aminoácidos. Os polirribossomos e a economia celular Em algumas células, certas proteínas são produzidas em grande quantidade. Por exemplo, a observação de glândulas secretoras de certos hormônios de natureza proteica (que são liberados para o sangue, indo atuar em outros órgãos do mesmo organismo) mostra, em certos locais, uma fileira de ribossomos efetuando a leitura do mesmo RNA mensageiro. Assim, grandes quantidades da mesma proteína são produzidas. Ao conjunto de ribossomos, atuando ao longo se um RNAm, dá-se o nome de polirribossomos. Possíveis destinos das proteínas O RNAm,
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