11. PROVAS BIOQUÍMICAS 2013.1

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28/8/2013
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Provas Bioquímicas
Isolamento e identificação de 
Enterobactérias
MICROBIOLOGIA I
Enterobactérias
• Família Enterobacteriaceae
– Gêneros: Escherichia, Shigella, Salmonella, 
Edwardsiella, Klebsiella, Proteus, Yersinia, 
Enterobacter, Citrobacter, Morganella, 
Providencia, Serratia…
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• Infecções intestinais
• Infecções extra-intestinais
Provas bioquímicas para 
Enterobactérias
• Após isolados, os bacilos Gram negativos
fermentadores podem ser identificados
através de uma bateria de provas
bioquímicas, para avaliar suas atividades
metabólicas.
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Prova de triagem - TSI
• TSI - Triple sugar iron agar
– Princípio – determinar a capacidade de bastonetes Gram
negativos fermentarem glicose, lactose e/ou sacarose, com
produção de gás (CO2) e gás sulfídrico (H2S).
• Componentes:
– Vermelho de fenol – indicador de pH
– Açúcares – glicose (0,1%), lactose (1%) e sacarose (1%)
– Indicador de H2S – sulfato ferroso de amônia/tiossulfato de sódio
TSI - inoculação
– Perfurar com agulha bacteriológica até a base 
do tubo e fazer estrias em zig-zag na 
superfície do meio.
– Incubar por 18 a 24h, a 35oC-37oC.
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Prova da Glicose: Determina a capacidade do micro-organismo de
fermentar a glicose, e produzir gás, que em caso positivo será
captado pelo tubo de Durhan.
 Indicador de pH – vermelho de fenol.
 Tipo de inoculação: inoculação em meio líquido.
Prova da Urease: Determina se um micro-organismo é capaz de
hidrolisar uréia em duas moléculas de amônia por ação da enzima
urease.
 Indicador de pH – vermelho de fenol.
 Tipo de inoculação: inoculação em meio líquido.
Prova do Citrato: determina se o microrganismo é capaz de utilizar
o citrato como única fonte de carbono, enzima citrato permease.
 Indicador de pH – azul de bromotimol.
 Tipo de inoculação: estrias na superfície.
Prova do Indol: Determina se a bactéria é capaz de produzir indol, a
partir do aminoácido triptofano, através da ação da enzima
triptofanase.
 Revelador do indol – reativo de Kovacs (adicionado no
momento da leitura)
 Tipo de inoculação: inoculação em meio líquido
Prova da Fenilalanina: Determina se a bactéria é capaz de
desaminar a fenilalanina, produzindo ácido fenilpirúvico.
 Revelador do ac. fenilpirúvico – cloreto férrico (adicionado
no momento da leitura).
 Tipo de inoculação: estrias.
Produção de H2S: Determina se ocorre a liberação de ácido
sulfídrico gasoso, pela metabolização bacteriana de aminoácidos
que contém enxofre em sua estrutura.
 Revelador – fita de acetato de chumbo.
 Tipo de inoculação: inoculação em meio líquido.
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• Prova da motilidade – SIM
– Motilidade
– Indol
– H2S
– Tipo de inoculação: punctura em meio 
semi-sólido com agulha (até 2/3 do meio)
Provas bioquímicas - interpretação
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Fermentação da glicose
• Substrato – glicose
• Indicador – vermelho de fenol
• Enzimas – complexo enzimático
• Resultado positivo – produtos ácidos, meio fica amarelo
• Produz gás – bolhas coletadas pelo tubo de Durhan
TSI
Produção de Gás Formação de bolhas e 
rachaduras
Base Produção de H2S Presença de pigmento 
negro de qualquer 
intensidade
Fermentação de glicose Reação positiva: 
coloração amarela
Superfície Fermentação de lactose 
e/ou sacarose
Reação positiva: 
coloração amarela
Base Superfície
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Resultados do TSI
Produção de urease
• Substrato – uréia
• Indicador – vermelho de fenol
• Enzima – urease
• Reação – formação de amônia e CO2
• Resultado positivo – produtos alcalinos,
meio fica rosa
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Prova do citrato
• Substrato – citrato como única fonte de carbono
• Indicador – azul de bromotimol
• Enzima – citrato permease
• Resultado positivo – bactéria cresce,
produzindo carbonatos, meio fica azul
Prova do indol
• Substrato – triptofano
• Enzima – triptofanase
• Produto final – indol, que vai ser revelado pelo
reativo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldeído)
• Resultado positivo – o anel formado pelo
reativo de Kovacs, que é adicionado no
momento da leitura fica vinho.
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Prova da fenilalanina
• Substrato – fenilalanina
• Enzima – fenilalanina desaminase
• Produto final – ácido fenilpirúvico, que vai ser
revelado pelo reativo de cloreto férrico
• Resultado positivo – ao adicionar o cloreto
férrico no momento da leitura, o reativo fica
verde na presença do ácido fenilpirúvico.
Produção de H2S
• Substrato – cisteína (aminoácidos contendo
enxofre)
• Enzima – desulfurase da cisteína
• Produto final – ácido sulfídrico, que vai ser
revelado pelo escurecimento da fita de
acetato de chumbo.
• Resultado positivo – a fita de acetato de
chumbo fica escura, impregnada pelo
ácido sulfídrico.
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Prova da motilidade - SIM
• Para avaliar a motilidade, o princípio não é
bioquímico e sim fisiológico (é móvel a bactéria que
possui flagelo).
• Semeadura em punctura.
• Bactéria imóvel – crescimento apenas no ponto de
inoculação.
• Bactéria móvel – crescimento difuso no meio.
• É possível visualizar a presença de H2S, e a
produção de indol (provas bioquímicas).
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TABELA PARA IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENTEROBACTÉRIAS
Bactérias
Lactose Glicose
com
produção
de gás
H2S Urease Motilidade Indol Citrato
Escherichia coli + + - - - /+ + -
Klebsiella pneumoniae + + - + - - +
Enterobacter cloacae + + - - /+ + - +
Citrobacter freundii - /+ + - /+ - /+ + - / + +
Arizona + + + - + - +
Shigella sp - - - - - - /+ -
Edwardsiella tarda - + - /+ - + + -
Salmonella sp - + + - + - +
Serratia marcescens - + - - /+ + - +
Proteus mirabilis - + -/+ + + - /+ - /+
Providencia rettgeri - + - - + + +
Yersinia enterocolitica - - - + - /+ - / + - /+