Histologia e seus Métodos de Estudo

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Histologia e seus métodos de estudo
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Analisar no microscópio
Amostra
Amostra
Obtenção de cortes
Amostra
Obtenção de cortes
Inclusão em resina
Amostra
Possui água
Inclusão em resina
Parafina/Embed 
NÃO mistura em água
Principais passos para um preparo histológico
Amostra
Fixar
Fixar
Fixar
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 Colocados nas lâminas
Corados
Desidratados
A lâmina deve ser montada com lâmina
Amostra
Obtenção de cortes
Inclusão 
em parafina
Embeber a amostra em um solvente de parafina
Desidratar
Fixar
Principais passos para um preparo histológico
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Obtenção da peça
Escolha do espécime a ser estudado: rato, coelho, camundongo, cão, gato etc.
Biópsia: retira-se uma amostra do tecido desejado do animal com ou sem anestesia (punções ou esfregaços)
Necrópsia: retirada do órgão com o animal já morto
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Fixação
Uma boa preparação histológica depende de um fixação completa e adequada
A fixação pode ser física (calor) ou química (formol)
O que é o fixador?
É uma substância química que mantém a integridade dos tecidos após a morte sem qualquer alteração da estrutura celular
Funções:
Inibe ou para a autólise
Impede a atividade ou proliferação bacteriana
Preserva e enrigece os tecido 
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Fixação
Características do fixador:
Velocidade de fixação
Finalidade do protocolo que será realizado (paraformaldeido, formol, metanol, etanol e acetona)
Na hora de fixar você deve se atentar para:
Tempo entre coleta e fixação
Volume do fixador
Evitar que a peça fique coladas na parede do recipiente
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Desidratação
Retirada da água do material
A parafina não se mistura em água
O reagente mais usado é o álcool etílico
O volume usado é de 10 a 20 vezes maior que o volume da peça
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Diafanização ou clarificação
Infriltração dos tecido com um solvente de parafina:
O reagente mais usado é o xilol
Retira completamente a água, o álcool e a gordura
O material torna-se translúcido
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Inclusão em parafina
O material deve ser incluído na parafina
A parafina deve penetrar no tecido e ocupar todo espaço deixado pela água e pela gordura
Nessa etapa o material se torna mais rígido para que possa ser cortado
Deve-se ter uma recipiente apropriado
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Corte fino do material
Para se obter cortes do material é necessário um micrótomo
Geralmente os cortes são feitos coma espessura de 4 a 6 µm
É feito uma “fita” de cortes
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Distensão do corte em banho maria
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Coloração
Evidenciar estruturas com o uso de um corante
Os corantes podem ser:
Ácidos: coram elementos básicos (elementos acidófilos)
Básicos: coram elementos ácidos (elementos basófilos)
Corantes fluorescentes
Metais pesados
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Microscopia de luz (MO)
Micrografia de campo claro
Fibroblasto de galinha infectado com T. cruzi
DIC
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Microscopia de fluorescência
Moléculas específicas podem ser detectadas na célula
 Iluminado em um determinado comprimento de onda
 Filtro
 Fundo é escuro
 Esse microscopio é parecido com o MO, mas possui 2 conjuntos filtros, um para filtrar a luz que chega na amostra e outro para filtra a luz que a luz obtida da amostra
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Filamentos de actina em verde
Núcleo em azul
Merge
Microscopia de fluorescência
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Vantagens:
 Detecção de moléculas em células ou em tecidos
 Uso de moléculas fluorêscente para amplificar o sinal
Microscopia de fluorescência
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Microscopia de fluorescência
Imunomarcação - imunofluorescência
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A lectina rArtinM não colocaliza com lisossomos em células da linhagem K562. Na linhagem U937 é possivel identificar alguns pontos de colocalização
Microscopia de fluorescência
Imunofluorescência
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Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Necessidade (curiosidade) de saber como é a célula e suas estruturas internas
 O microscópio óptico - resolução de 0.4µm a 0.7µm
 O microscópio eletrônico de transmissão - resolução de 0.1nm (1Å)
Utilização de elétrons que atravessaram a amostra para formar a imagem 
Figure 9-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
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Preparo da amostra para MET 
Fixação com glutaraldeido/paraformoldeido
Fixação com ósmio
Desidratação com álcool/acetona
Impregnação com metal pesado (urânio ou chumbo)
Inclusão em resina apropriada
Figure 9-44 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Corte ultrafinos (50 a 100nm ou seja uma células pode ser cortada em 200 fatias) com navalha de vidro ou de diamante
Esses cortes ultrafinos são colocados em grades para serem então levados ao MET
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Microscopia eletrônica de transmissão
A fonte de iluminação é um filamento (cátodo)
Emissão de elétrons no vácuo
O ânodo acelera a saída de elétrons 
Bobinas magnéticas convergem os elétrons (lentes convergem a luz)
A amostra é colocada no vácuo (câmara de compressão) na trajetória do feixe de elétrons
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Figure 9-42 (part 2 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
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Imagem por MET
Microscopia eletrônica de transmissão
Alguns elétrons que atravessam a amostra são espalhados
O restante é focado em um filme
Áreas elétron lúcidas são regiões em que o feixe de elétron, após passar pela amostra, se manteve e impressionou o filme
Regiões densas da amostra são áreas de fluxo reduzido (elétrons são espalhados) e são chamadas de elétron densas 
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Imagem por MET
Microscopia eletrônica de transmissão
Mitocrôndria
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Microscopia eletrônica de varredura
Utiliza os elétrons que foram espalhados ou emitido a partir da superfície da amostra
Produz uma imagem da estrutura tridimensional da superfície da amostra
O MEV é normalmente menor, mais simples e mais barato que o MET
Flor de milho em desenvolvimento
Essa espiga delicada foi congelada rapidamente, coberta com metal e observada ao MEV
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Fixação com glutaraldeido
Fixação com ósmio
Desidratação com álcool
Desidratacão combina temperatura e pressão – Ponto crítico
Cobertura da amostra com ouro – aumento da condutividade
Guardar as lamínulas no vácuo ou em ambiente o mais seco possível
Preparo da amostra para MEV 
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Microscopia eletrônica de varredura
Canhão de elétrons - emissão de elétrons no vácuo
O ânodo acelera a saída de elétrons 
Bobinas magnéticas convergem os elétrons (lentes convergem a luz)
Um rastreador (gerador da varredura) faz a varredura do feixe de elétrons
A amostra é colocada no vácuo (câmara de compressão) na trajetória do feixe de elétrons
Os elétrons refletidos pela superfície metálica da amostra são detectados
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Imagem por MEV
Embrião humano na 3o semana do desenvolvimento
Formação da mesoderme
Presença da linha primitiva 
Os três folhetos embrionários já formados
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Microscopia eletrônica de varredura
Estimulada com a lectina ArtinM
Não estimulada
Células K562. A linhagem celular K562 foi estabelecida a partir da efusão pleural de paciente com leucemia mielocitica crônica (CML) (LOZZIO & LOZZIO, 1975)
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Comparação entre as imagens de MO, MET e MEV
Micrografia óptica (contraste de interferência diferencial) 
Micrografia eletrônica de transmissão
Cílio de uma célula do ouvido interno de um sapo boi
Micrografia eletrônica de varredura
Desenho global semelhante ao do MO
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Glutaraldeido –as moléculas de proteínas façam ligação covalente cruzada com as moléculas vizinhas.
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Desenho global semelhante ao do MO
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