Técnicas sorológicas para detecção de antígenos e anticorpos

Prévia do material em texto

Técnicas de 
Imunodiagnóstico 
PATÓGENO 
RESPOSTA IMUNE DO HOSPEDEIRO 
DIAGNÓSTICO DA 
INFECÇÃO 
 Diagnóstico de Doenças Infecciosas 
 Diagnóstico de alterações celulares 
 Dosagem de substâncias no plasma 
Pesquisa de 
Ags ou Acs Ags 
no soro nos tecidos 
Sorologia Imunohistoquímica 
Reações Ag x Ac 
Métodos que permitem a 
visualização destas reações 
SOROLOGIA 
 Detecção e quantificação de Ags / Acs 
IgG é a imunoglobulina indicada a ser mensurada devido à sua 
especificidade 
 
 
 
 
Monitoramento do tratamento 
 
TÍTULO 
maior diluição do Ag ou Ac onde ainda há 
manifestação da reação 
período necessário para o aparecimento de títulos 
de anticorpos detectáveis - janela imunológica 
Infecção assintomática passada 
Vacinação 
Reação cruzada 
Um teste sorológico positivo pode indicar 
Infecção presente 
Infecção crônica 
SOROLOGIA PAREADA 
Conversão sorológica 
doença em curso 
Coleta e análise de nova amostra do indivíduo 
2 semanas após a primeira coleta 
Aumento de 3-4 vezes 
no título do soro 
Testes de formação de rede 
 
Aglutinação 
Aglutinação de antígeno 
particulado 
Aglutinina/hemaglutinina 
 Testes de Aglutinação / hemaglutinação 
Direta: 
• Pesquisa de Acs para infecções (ex. toxoplasmose.) 
 
 
 
 
Ac anti-Ag A 
Hemácias A 
• Tipagem sanguínea 
+ = 
 A B AB O 
Soro do paciente 
Aglutinação / hemaglutinação passiva 
 
Pesquisa de Acs 
Adsorção de Ag solúvel a superfície de partículas 
Hemácias, microesferas de látex 
Ex: VDRL – colesterol / lecitina/ Ag 
(cardiolipina) deTreponema pallidum 
Soro do 
paciente 
Sorodiagnóstico de sífilis (VDRL latex) 
Resultado negativo 
(microscópio óptico x 100) 
Resultado positivo 
(microscópio óptico x 100) 
Testes de formação de rede 
 
Precipitação 
Precipitação de antígeno solúvel 
Formação de imunocomplexo 
insolúvel 
 Método 
– Ag e Ac colocados em poços equidistantes no gel 
Imunodifusão Radial Dupla 
(Ouchterlony) 
Ex: diagnóstico da paracoccidioidomicose 
 Precipitação em 
meio sólido 
TESTE 
 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
RIE 
ELISA 
WESTERNBLOT 
 
 MARCADOR / REVELAÇÃO 
 
 FLUORESCENTE 
 RADIOISÓTOPO 
 ENZIMÁTICO COM SUBSTRATO 
CROMOGÊNICO OU QUIMIOLUMINESCENTE 
 
MÉTODOS QUE UTILIZAM SISTEMAS 
INDICADORES DA REAÇÃO Ag x Ac 
Testes que não dependem da formação de rede 
Pode ser usado qualitativa ou quantitativamente para 
medir a ligação antígeno-anticorpo. Capacidade para 
detectar antígenos (hormônios, citocinas, enzimas, 
ags microbianos, drogas ilícitas) ou anticorpos (anti-
HIV, por exemplo) em fluidos corporais ou 
sobrenadantes de culturas. 
 
ELISA / RIE* 
 pesquisa de Ac 
 ELISA indireto 
 ELISA de captura de IgM 
ELISA / RIE 
pesquisa de Ag 
 ELISA direto 
 ELISA de captura do Ag (sanduíche) 
 ELISA competitivo 
 Método 
• Fixação do Ag específico 
para o Ac pesquisado 
 
• Incubação com o soro 
testado 
 
• Incubação com um anti-
Ac marcado 
 
 Quantidade de anti-Ig 
marcada ligada é 
proporcional a 
quantidade de Ac no soro 
teste 
Pesquisa a presença de um Ac específico em uma amostra 
RIE/ELISA Indireto 
Diagnóstico de HIV 
ELISA 
Captura de IgM – Detecção de IgM 
 Método 
 
• Fixação de Ac anti-IgM 
humano 
 
• Incubação com o soro 
testado 
 
• Incubação com 
complexo Ag + Ac 
marcado 
 
 
Diagnóstico de Dengue Sem necessidade de sorologia pareada 
Western blot é um método baseado no uso de Acs 
específicos para detecção de antígenos 
(proteínas) através do qual obtém-se informações 
acerca do tamanho da proteína. 
WESTERNBLOT 
1) Preparo das amostras: eletroforese (SDS-PAGE): 
Eletrodo 
negativo 
Eletrodo 
positivo 
Amostras 
Poços 
Proteínas grandes 
Proteínas pequenas 
Placas 
Espaçadores 
Gel de empilhamento 
Gel de corrida 
ANODO 
CATODO 
D
ireção da transferência 
Papel 
filtro 
Papel 
filtro 
Membrana 
Gel de poliacrilamida 
2) Transferência das proteínas separadas para uma 
membrana (nitrocelulose ou PVDF): 
3) Incubação com Ac primário: 
4) Incubação com Ac secundário acoplado ao sistema de 
revelação: 
Ac 1º 
Ac 2º 
Revelador 
Ac 1º 
A revelação pode ser feita com um substrato 
colorimétrico ou quimioluminescente 
Janela imunológica 
Pesquisa de Acs 
Pesquisa de Ags associados a células / tecidos 
Imunofluorescência 
Imunofluorescência 
 Direta Indireta 
 
Pesquisa de Ag 
Ag 
Ac específico para o 
Ag conjugado a 
fluorocromo 
Corte de tecido / célula Corte de tecido / célula 
Ag 
Anti-Ig conjugado a 
fluorocromo 
Ac específico 
para o Ag 
Imunofluorescência 
Indireta 
 
 Suspensão do microrganismo / 
Cultura de células infectadas é 
fixada a lâmina 
 
 Soro a ser testado é adicionado 
 
 Anti-Ig conjugado ao 
fluorocromo é adicionado 
Confirmatório para HIV 
Pesquisa de Ac 
Imunofluorescência 
IFI para T. cruzi 
Confirmatório 
FTA- ABS  pesquisa de Ac 
anti-Treponema pallidum 
Confirmatório do VDRL 
Análise multiparamétrica de partículas (uma a uma) 
em suspensão – ANÁLISE DE CÉLULAS 
Citometria de Fluxo 
Informações obtidas pela análise de citometria de fluxo 
• Tamanho (FSC) 
• Granulosidade (densidade das organelas) (SSC) 
• Fluorescência relativa 
As células podem ser separadas em populações 
baseado em combinações destes parâmetros 
APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO 
 
 Hematologia – contagem celular, formula leucocitária, 
análise da medula óssea. 
 
 Imunologia – análise de frequência das subpopulações 
de células T, tipagem tissular, estimulação linfocitária, 
apoptose. 
 
 Oncologia – diagnóstico/prognóstico, monitorar 
tratamento. 
 
 
 
 Células são analisadas em um citômetro de fluxo 
 Fazer passar as partículas em suspensão, de uma 
forma alinhada, por um feixe de luz (frontal e lateral) 
 
 A informação produzida pode ser gerada: 
- Pela dispersão do feixe de luz 
- Pela luz emitida por fluorocromos após excitação 
pelo feixe de luz 
Princípio 
Granulócitos 
Monócitos 
Linfócitos 
Dispersão 
Imunofluorescência 
 Citometria de Fluxo 
 
 Identifica células através de marcadores (Ags) de 
superfície 
 
 Células em suspensão são marcadas com 
fluorocromos 
 
 
Imunofluorescência 
• Citometria de fluxo 
Níveis relativos de expressão dos 
marcadores em cada célula 
1 ponto = 1 célula