Preservação de Culturas bacterianos e de fungos

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PRESERVAÇÃO DE CULTURAS 
MICROBIANAS 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA 
OBJETIVOS 
Discutir sobre diversos métodos de 
conservação de micro-organismos. 
 
Demonstrar alguns procedimentos de 
preservação para fungos e bactérias. 
 
INTRODUÇÃO 
Uma vez obtida uma cultura satisfatória, a mesma 
deve ser mantida pura e viável e para isso é 
preciso: 
 transferir periodicamente a cultura em um meio de 
cultura adequado (repiques). 
incubar até que a cultura atinja a fase máxima de 
crescimento (final da fase logarítmica, início da fase 
estacionária). 
 estocar em temperatura apropriada para impedir 
maior crescimento (concentração de células 
recomendada = 108 1010 céls/mL). 
INTRODUÇÃO 
A manutenção e preservação de culturas puras no 
laboratório apresentam grande importância. 
 
Manter a bacterioteca requer técnicas 
especializadas com objetivo de preservar as 
bactérias viáveis e com suas características 
típicas por meses (manutenção) ou anos 
(preservação). 
 
Isolamento e melhoramento são processos caros. 
Vantagens de manter culturas-estoques 
As culturas estão disponíveis para repique sem interferir nas 
culturas-estoques. 
Método pode ser aplicado para colônias ou biomassa de 
culturas. 
Nenhum selamento com rolhas de borracha é necessário. 
Nenhum equipamento especial é requerido. 
As primeiras tentativas de Coleções de Culturas 
remontam o início do século XX, por um professor tcheco 
(Frantisesk Kral). 
Em 1915, sua coleção foi transferida para a Universidade 
de Viena e perdeu-se toda na Segunda Guerra Mundial. 
Exceto o que havia sido levado para Chicago. 
Em 1970, foi formada a World Federation of Culture 
Collections com informações de 329 coleções de 52 
países. 
INTRODUÇÃO 
Objetivos da Preservação 
Um dos objetivos principais da conservação  evitar a 
formação excessiva de mutações que mudem as características 
do micro-organismo. 
O repique contínuo pode gerar mutações. 
↓ número de gerações filhas dos micro-organismos conservados 
permitem que não haja grande variação da célula-mãe. 
Conservar micro-organismos selecionados e melhorados 
geneticamente de forma a evitar a perda da modificação. 
Além de evitar mutações indesejáveis, também favorece a 
máxima preservação da vitalidade das células e o bom 
número de células viáveis. 
Importância de uma Coleção de Culturas 
Pesquisa 
 Indústria / Biotecnologia 
Ex: fermentações 
 Valor didático 
No caso de um laboratório acadêmico, a tendência é 
comprar espécies “padronizadas”, utilizá-las para 
fins didáticos, e eventualmente manter uma 
bacterioteca e uma micoteca. 
 
Problemas com o cultivo 
Contaminação 
 Perda de viabilidade 
 Mutação 
 Resíduos metabólicos 
Solução: metodologia de preservação 
Diminuir o crescimento e as atividades metabólicas 
Manipulação de fatores ambientais: 
Meio de cultura 
Temperatura 
pH 
Aeração, etc. 
 Meio mínimo 
 Preservação em longo prazo: 
Evita problemas com novo isolamento. 
Economia de tempo, mão de obra e custos. 
A composição do meio de cultura pode afetar a 
resistência da célula. 
Meio rico x meio pobre. 
Meio pobre: 
evita o crescimento acelerado e geração de mutantes 
indesejáveis. 
É um sinal para reorganização do metabolismo da 
célula  estocagem de energia 
em alguns casos o meio de cultivo rico é recomendado por 
causa da percentagem de células viáveis ser maior em 
relação ao meio pobre. 
Acúmulo de proteínas, carboidratos e lipídios podem 
também aumentar a resistência das células ao tratamento 
por liofilização. 
Escolha do método de preservação 
PONTOS A SEREM CONSIDERADOS: 
Manutenção da viabilidade. 
Manutenção das propriedades originais. 
Custos de preservação e manutenção. 
Tamanho estimado do acervo. 
Importância do acervo. 
Necessidade de acesso e uso da cultura. 
Disponibilidade de equipamentos e de recursos 
humanos e financeiros. 
Métodos de preservação 
CURTO PRAZO: 
 Repique contínuo 
 MÉDIO PRAZO: 
 Preservação sob óleo mineral 
 Preservação em água (método de Castellani) 
 Congelamento a -20°C 
 Secagem em solo 
 Secagem em papel de filtro 
 Secagem em sílica 
LONGO PRAZO: 
 Liofilização 
 Congelamento a -80°C 
 Criopreservação em nitrogênio líquido 
Repique contínuo 
Princípio: Diminuição do metabolismo. 
 Fatores a serem considerados: 
Meio adequado. 
Temperatura de estocagem. 
Frequência entre as transferências. 
Minimizar o n° de repiques. 
Examinar a pureza em cada transferência. 
Conservar em duplicata. 
Repique contínuo 
Repique contínuo 
Vantagens 
Baixo custo. 
Não requer equipamentos especializados. 
O manuseio é simples. 
Desvantagens 
Riscos de contaminação e possível perda da linhagem. 
Perda de características morfológicas, fisiológicas ou 
patogenicidade. 
Seleção de células atípicas (variantes ou mutantes). 
Mão-de-obra. 
Espaço relativamente grande para a armazenamento. 
 
Preservação em água (Castellani) 
Princípio: Diminuição da atividade metabólica 
 Fatores a serem considerado (Castellani): 
Espessura do ágar 
 
Número de blocos na água 
Blocos de ágar de 4-6 mm3 
Preservação em água (Castellani) 
Geladeira 
Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada 
Preservação em água (Castellani) 
VANTAGENS 
 boa taxa de viabilidade 
 evita contaminação por ácaros 
DESVANTAGENS 
 limitado a organismos que aderem ao ágar 
(Castellani) 
 dificuldade da retirada dos cubos na 
reativação (Castellani) 
 crescimento durante a estocagem 
 requer espaço para armazenamento 
 riscos de contaminação 
armazenamento em geladeira 
Preservação em óleo mineral 
Princípio: Diminuição da atividade metabólica 
 
Preservação sob óleo mineral 
Tubo em camada alta 
Preservação em óleo mineral 
Preservação em óleo 
armazenamento em geladeira 
 Princípio 
diminuição da atividade metabólica 
Vantagens 
 ↓ custo de equipamento 
 evita contaminação por ácaros 
 Desvantagens 
 necessidade de mais transferências 
 até que a cultura revigore 
 requer espaço para armazenamento 
OBS: quando micro-organismos são 
submetidos a uma temperatura inferior à 
mínima de crescimento, ainda conseguem 
sobreviver, já a temperatura acima da máxima, 
tem efeito letal. 
Os micro-organismos permanecem vivos em 
estado latente a baixas temperaturas por longos 
períodos de tempo. 
Secagem 
Princípio: Diminuição do metabolismo por 
desidratação e conservação em geladeira. 
 Fatores a serem considerados: 
Tipo de célula 
Idade da cultura 
Concentração celular 
Condições de estocagem 
Secagem 
Vantagens 
Simples e de baixo custo 
Não requer equipamento especial 
Estabilidade elevada 
Ácaros não sobrevivem 
Desvantagens 
Métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos 
esporulados 
Risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo 
Papel: poucos dados sobre o sucesso do método 
PRESERVAÇÃO EM SOLO 
PRESERVAÇÃO EM SOLO 
Secagem em discos ou tiras de papel 
Vantagens: 
simples e de baixo custo 
não requer equipamento especial 
estabilidade elevada 
 
Desvantagens 
risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo 
 
Secagem em discos ou tiras de 
papel 
PRESERVAÇÃO EM SÍLICA GEL 
Métodos de Longo Prazo: Liofilização e 
congelamentos em ultrafreezer e N2 líquido 
Princípio: 
Remoção da água por sublimação (liofilização)Indução da dormência do micro-organismo 
Armazenamento a - 80°C e -196 °C 
 
Liofilização 
Princípio 
Remoção da água por sublimação 
Fatores a serem considerados 
Tipo de células 
Idade da cultura 
Concentração celular 
Agentes crioprotetores 
Condições de estocagem 
Método de reidratação 
Liofilização 
 
Agentes crioprotetores 
Reduzem danos durante o congelamento e 
descongelamento 
Estabilidade ao micro-organismo contra os efeitos 
adversos da estocagem 
• Leite desnatado (skim milk) 10% 
• Leite desnatado 10% + inositol 5% 
• Sacarose 7% + peptona 7% 
• Inositol 5% em soro de sangue de cavalo 
 
Liofilização 
3 mL 
Skim Milk 
Cultura pura 0,2 mL 
 na ampola 
Maçarico Liofilizador 
Maçarico 
Liofilização - reativação 
Liofilização 
Vantagens 
 Vedação total da amostra 
 Longa viabilidade 
 Estabilidade elevada em muitas espécies 
 Produção em larga escala 
 Não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz) 
 Fácil distribuição e transporte 
Desvantagens 
 Muitas espécies não sobrevivem ao processo 
 Viabilidade ocasionalmente insatisfatória 
 Mão-de-obra especializada 
 Requer equipamentos sofisticado 
Congelamento em ultrafreezer 
Princípio 
 Indução da dormência do micro-organismo 
 Armazenamento a - 80˚C 
Fatores a serem considerados 
 Tipo de micro-organismo 
 Idade da cultura 
 Concentração celular 
 Agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou 
concentração maior) 
 Condições de estocagem 
 Método de descongelamento 
Congelamento 
10 mL 
Fungos filamentosos não esporulados 
Bactérias, arqueas e leveduras 
Fungos filamentosos esporulados 
7 mL 
1 mL 
1 mL 1 mL 
Congelamento em nitrogênio líquido 
Princípio 
 Indução da dormência do micro-organismo 
 armazenamento a - 196˚C 
 
Fatores a serem considerados 
 tipo de micro-organismo 
 idade da cultura 
 concentração celular 
 agente crioprotetor 
 condições de estocagem 
 método de descongelamento 
Congelamento em nitrogênio líquido 
Congelamento em nitrogênio líquido 
Vantagens 
Condições estáveis por longos períodos 
Vedação completa, evitando contaminação 
Utilização para esporulados e não esporulados 
Desvantagens 
Viabilidade ocasionalmente insatisfatória 
Requer equipamento sofisticado 
Suprimento contínuo de N2 
Boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento 
Controle de qualidade da preservação 
 
Contagem de população viável antes e após 
preservação. 
Determinar a taxa de mortalidade do micro-organismo 
específico no protocolo utilizado. 
Aplicável a métodos de médio e longo-termo. 
 Imprescindível para garantia de preservação de longo-termo. 
Viabilidade. 
Primeira: até um mês após o processamento. 
Segunda: anualmente. 
 
Controle de qualidade de preservação 
 
 
 
 Suspensão de células 
em crioprotetor 
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 
(10-8) (10-6) (10-4) (10-2) 
9,9 mL água 
+ 0,1% ágar 
10-2 10-4 
10-8 10-6 
no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL 
Coleções de Cultura de Referência 
Cepas de referência 
 
Provedores de cepas de referência: 
 ATCC (American Type Culture Collection). 
 CECT (Colección española de cultivos tipos). 
 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) 
lNSTITUT PASTEUR 
Segunda opção: 
 Provedores creditados por ISO 9001 que realizam repiques a partir 
cepas adquiridas em coleções reconhecidas.