h Aula_08_Biorreatores_Processo_Batelada

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<p>Bacharelado em Química Industrial</p><p>Disciplina:</p><p>Introdução à Biotecnologia</p><p>Aula 08</p><p>Fermentação em Batelada (Parte I)</p><p>Professora: Cristiane Pereira Zdradek</p><p>Biorreatores para produção em larga</p><p>escala de células animais.</p><p>Biorreator para cultivo de algas.</p><p>10 000,00 US$ - 200 000,00 US$</p><p>Biorreator para indústria cervejeira</p><p>Biorreatores - Fermentadores</p><p>Fermentador de Estado Sólido Indústrial.</p><p>Utilizado para produção de bactérias.</p><p>https://portuguese.alibaba.com/product-detail/Solid-state-</p><p>fermenter-industrial-fermentor-bioreactor-60823184667.html</p><p>Algumas considerações:</p><p>▪  Controle de variáveis.</p><p>▪  Meio como fonte de nutrientes (C e N).</p><p>▪  Diferentes tipos de biorreatores.</p><p>▪  Diferentes tipos de meio de cultivo.</p><p>▪  Diferentes biocatalisadores.</p><p>▪  Necessidade de otimização do</p><p>bioprocesso</p><p>▪  Características biológicas das células e</p><p>enzimas.</p><p>▪  Termoestabilidade</p><p>▪  Susceptibilidade à inibição pelo</p><p>substrato</p><p>▪  Viscosidade do meio</p><p>▪  Permeabilidade celular</p><p>▪  Meio de cultivo</p><p>Biorreatores - Fermentadores</p><p>Características:</p><p>❑  Recipientes para o crescimento de microrganismos.</p><p>❑  Não permite a contaminação</p><p>❑  Permite o fornecimento das condições necessárias para a</p><p>máxima produção dos produtos desejados;</p><p>❑  pH, temperatura, oxigênio, pressão…...</p><p>Classificação dos Biorreatores</p><p>Forma ou configuração</p><p>❖  líquido</p><p>❖  Sólido</p><p>Tipo de microrganismo</p><p>❖  Aeróbio</p><p>❖  Anaeróbio</p><p>Tipo de Agitação</p><p>❖  Mecânica</p><p>❖  pneumática</p><p>Condução do Processo</p><p>❖  Batelada</p><p>❖  contínuo</p><p>Cultivo em Batelada</p><p>Modo de operação:</p><p>Bioprocessos em Batelada</p><p>Características</p><p>o  Sistema fechado.</p><p>o  Fermentação finalizada em tempo determinado.</p><p>o  Dornas esvaziadas e limpas.</p><p>o  Meio de cultivo esterilizado antes de cada batelada.</p><p>o  Se não houver perdas irá operar em volume constante.</p><p>o  Crescimento típico de um microrganismo em cultivo descontínuo.</p><p>Curva de crescimento bacteriano</p><p>Contagem de viáveis: Placa de petri ou câmara de neubauer</p><p>Curva de crescimento bacteriano</p><p>Turbidez:</p><p>Medida em espectrofotômetro.</p><p>Para os organismos unicelulares, as unidades fotométricas ou densidade ótica</p><p>(DO) são proporcionais (dentro de certos limites) ao número de células.</p><p>Peso Seco:</p><p>Melhor forma de avaliação do crescimento dos fungos filamentosos.</p><p>Vantagens</p><p>o  Menor risco de contaminação.</p><p>o  Flexibilidade operacional.</p><p>o  Estabilidade genética.</p><p>Desvantagens</p><p>o  Perdas por rendimento ou produtividade.</p><p>o  Tempos mortos.</p><p>Bioprocessos em Batelada</p><p>Inóculo</p><p>� Sinônimos de inóculo</p><p>� Manutenção celular</p><p>Técnicas de preservação de microrganismos</p><p>✧  Prevenir contra a contaminação;</p><p>✧  Prevenir contra a perda da viabilidade;</p><p>✧  Prevenir contra a mutação (perda das características fisiológicas).</p><p>Objetivo:</p><p>Preservar uma linhagem é conservar o estado inicial do microrganismo</p><p>evitando mutações indesejáveis, preservação da vitalidade das células e</p><p>do número de células viáveis.</p><p>Técnicas de preservação de microrganismos</p><p>Fundamento</p><p>A conservação de microrganismos está baseada na transição reversível</p><p>entre um estado vital ativo (biose) e um estado inativo (anabiose) ou um</p><p>estado de atividade baixa (hipobiose).</p><p>ANABIOSE: secagem, congelamento a baixas temperaturas e liofilização.</p><p>HIPOBIOSE: repique contínuo, estoque em água estéril ou solução</p><p>fisiológica, resfriamento em temperaturas entre 4 a 8ºC.</p><p>Escolha do método preservação de microrganismos</p><p>CONSIDERAR:</p><p>o  Tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente</p><p>e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento.</p><p>o  Importância do acervo: consequência de sua eventual perda.</p><p>o  Necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades</p><p>adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para</p><p>embalagem de envio e condições de transporte.</p><p>o  Disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros</p><p>Fatores que afetam a preservação de microrganismos</p><p>LEMBRE-SE: A conservação de microrganismos depende da manipulação de</p><p>alguns fatores ambientais de forma a retardar o crescimento.</p><p>Temperatura:</p><p>Influencia a eficiência do método.</p><p>Baixas temperaturas retardam as</p><p>reações químicas, a ação das</p><p>enzimas, e atrasam ou inibem o</p><p>crescimento dos microrganismos.</p><p>Quanto mais baixa a temperatura</p><p>mais lenta serão as reações</p><p>químicas, as ações enzimáticas e</p><p>o crescimento microbiano.</p><p>Composição do meio:</p><p>Afeta a resistência da célula.</p><p>Existem dois conceitos que se opõe sobre</p><p>a propagação no meio: um meio rico em</p><p>nutrientes ou um meio pobre.</p><p>Meio pobre: recomenda-se para evitar o</p><p>crescimento acelerado e geração de</p><p>mutantes indesejáveis. É um sinal para o</p><p>metabolismo da célula reorganizar a</p><p>estocagem de energia.</p><p>Meio rico: é recomendado por causa da</p><p>percentagem de células viáveis ser maior</p><p>em relação ao meio pobre.</p><p>Fatores que afetam a preservação de microrganismos</p><p>Atividade de água (aw):</p><p>Afeta diretamente o crescimento</p><p>de microrganismos.</p><p>Fungos requerem uma atividade</p><p>de água mínima de 0,70 para</p><p>c r e s c e r e m , s e n d o q u e</p><p>e s p o r u l a ç ã o é o b s e r v a d a</p><p>também em aw=0,62.</p><p>As bactérias necessitam de um</p><p>pouco mais de água livre para se</p><p>desenvolverem, com um aw=0,82</p><p>mínimo necessário.</p><p>pH:</p><p>o pH do meio de cultivo influencia a</p><p>propagação celular: há um pH ótimo para</p><p>toda cultura e o crescimento da célula</p><p>pode ser inibido se este fator não for</p><p>adequado.</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Curto prazo:</p><p>▪  repique contínuo</p><p>Médio prazo</p><p>▪  preservação em óleo mineral</p><p>▪  preservação em água estéril</p><p>▪  congelamento a -20°C</p><p>▪  secagem em sílica, solo ou papel de filtro</p><p>Longo prazo</p><p>▪  liofilização</p><p>▪  congelamento a -80°C</p><p>▪  criopreservação em nitrogênio líquido</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Curto prazo:</p><p>▪  repique contínuo</p><p>Consiste na transferência de células para uma placa de Petri com meio sólido. Pode ser</p><p>feito em tubos de ensaio com meio inclinado.</p><p>Período: de 30 dias a até alguns anos em alguns casos. Em média leveduras são</p><p>conservadas de 1 a 3 meses e bactérias podem variar de 5 a 12 meses.</p><p>Temperatura de armazenamento: de 3 a 5ºC.</p><p>Um grande número de transferências (repiques) pode gerar mutações espontâneas e</p><p>contaminação, levando a perda do microrganismo.</p><p>Vantagens</p><p>o  baixo custo</p><p>o  não requer equipamentos especializados</p><p>o  simples manuseio</p><p>Desvantagens</p><p>o  riscos de contaminação e possível perda da linhagem.</p><p>o  perda de características morfológicas e fisiológicas</p><p>o  seleção de células atípicas (variantes ou mutantes).</p><p>o  mão-de-obra,</p><p>o  espaço relativamente grande para a armazenamento.</p><p>Repique contínuo</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Esse método consiste na aplicação de uma camada de</p><p>óleo mineral estéril de 1 cm de altura sobre uma cultura</p><p>de microrganismos em estado sólido ou líquido. O óleo</p><p>também previne a desidratação do meio de cultura.</p><p>Temperatura de armazenamento: de 4°C a 20°C</p><p>Período: 1 a 7 anos para bactérias e leveduras.</p><p>Médio prazo</p><p>▪  preservação em óleo mineral</p><p>Vantagens</p><p>o  menor custo de equipamento,</p><p>o  evita contaminação por ácaros.</p><p>Desvantagens</p><p>o  necessidade de mais transferências até que a cultura</p><p>revigore.</p><p>o  requer espaço para armazenamento.</p><p>Preservação	em	Óleo	Mineral</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Esse método pode ser feito em água estéril ou solução salina. A solução salina é</p><p>utilizada para a preservação de microrganismos sensíveis a baixas pressões</p><p>osmóticas de soluções hipotônicas.</p><p>Uma suspensão de células ou um bloco de ágar (aproximadamente 5 mm x 10</p><p>mm) contendo o microrganismo é adicionado a uma solução de água estéril (10 a</p><p>15 mL) e conservado a baixas temperaturas ou temperatura ambiente.</p><p>Temperatura de armazenamento: 12 a 24°C.</p><p>Período: 1 a 2 anos.</p><p>Médio prazo</p><p>▪  preservação</p><p>em água estéril – Método Castellani</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Médio prazo</p><p>▪  preservação em água estéril – Método Castellani</p><p>Vantagens</p><p>o  boa taxa de viabilidade,</p><p>o  evita contaminação por ácaros.</p><p>Desvantagens</p><p>o  imitado a organismos que aderem ao ágar (Castellani).</p><p>o  dificuldade da retirada dos cubos na reativação</p><p>o  crescimento durante a estocagem.</p><p>o  requer espaço para armazenamento.</p><p>o  riscos de contaminação.</p><p>Preservação	em	água	estéril	–	Método	Castellani</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>O congelamento comum consiste na utilização de freezers comuns que atingem</p><p>temperaturas de 4 a 20ºC negativos.</p><p>Temperatura de armazenamento: de -4°C a -20°C.</p><p>Período: de 1 a 2 anos.</p><p>Médio prazo</p><p>▪  congelamento a -20°C</p><p>Vantagens</p><p>o  períodos de conservação superior ao método de</p><p>repique contínuo.</p><p>o  Baixo custo.</p><p>Desvantagens</p><p>o  a maioria dos organismos não sobrevive em função dos</p><p>danos causados pela formação de cristais de gelo e a da</p><p>flutuação de eletrólitos nessa temperatura.</p><p>o  OBS: É importante observar que o freezer do tipo “frost-free”</p><p>não deve ser utilizado, pois neles ocorrem flutuações de</p><p>temperatura que destroem os microrganismos.</p><p>Congelamento</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>A técnica consiste em uma suspensão do microrganismo que é derramada sobre</p><p>um suporte sólido (areia, lama, solo, carvão ativado, grãos de trigo, esferas de</p><p>vidro, grânulos gelatinosos ou sintéticos, papel-filtro). Esses suportes são bons</p><p>devido a grande superfície e a capacidade de absorver parte da umidade para</p><p>então serem secos à temperatura ambiente ou em aquecimento de 36-40ºC. A</p><p>secagem também pode ser feita na presença de algum composto hidrofílico como a</p><p>sílica-gel e o pentóxido de fósforo (P2O5).</p><p>Médio prazo</p><p>▪  secagem em sílica, solo ou papel de filtro</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Médio prazo</p><p>▪  secagem em sílica, solo ou papel de filtro</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Médio prazo</p><p>▪  secagem em sílica, solo ou papel de filtro</p><p>Vantagens</p><p>o  simples e de baixo custo,</p><p>o  não requer equipamento especial,</p><p>o  ácaros não sobrevivem,</p><p>o  longo período de preservação,</p><p>o  modificações fisiológicas e morfológicas reduzidas.</p><p>Desvantagens</p><p>o  método limitado a bactérias e fungos filamentosos</p><p>esporulados,</p><p>o  dificuldade de perceber contaminações.</p><p>Preservação	com	secagem	em	sílica,	solo	ou	papel	de	filtro</p><p>Método de preservação de microrganismos</p><p>Longo prazo</p><p>▪  liofilização</p><p>▪  congelamento a -80°C</p><p>▪  criopreservação em nitrogênio líquido</p><p>Revitalização dos microrganismos conservados</p><p>▪  Depende do método utilizado e do tipo de</p><p>microrganismo.</p><p>▪  Deve-se ressuspender a amostra no meio de</p><p>cultura utilizado no crescimento.</p><p>▪  A concentração celular do material</p><p>p reservado dependerá da taxa de</p><p>sobrevivência das células ao processo.</p><p>▪  A utilização da concentração inadequada de</p><p>células para a recuperação pode gerar um</p><p>grande crescimento e excessivo número de</p><p>gerações de células, aumentando a</p><p>probabilidade de ocorrência de uma</p><p>mutação.</p><p>Revitalização dos microrganismos conservados</p><p>▪  A adição de água destilada em</p><p>amostras liofilizadas ou secas em</p><p>solo para reidratação pode resultar</p><p>na destruição de grande parte das</p><p>células devido ao grande choque</p><p>osmótico. Deve-se usar o meio de</p><p>cultivo ou soluções isotônicas para</p><p>evitar esse problema.</p><p>▪  D e v e - s e v e r i f i c a r , a p ó s a</p><p>recuperação da amostra, a pureza da</p><p>cultura. Geralmente amostras que</p><p>serão utilizadas em um processo</p><p>industrial são testadas em pequenos</p><p>frascos para verificação desse</p><p>possível problema.</p>