Bioquimica de Alimentos - Proteínas e Atividade de Agua

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Desnaturação Protéica
Aula 2
Caracteriza-se:
Qualquer modificação na conformação (estrutura secundária, terciária ou quartenária) sem rompimento das ligações peptídicas envolvidas na estrutura primária
Principais efeitos:
Atividade biológica
Solubilidade
Sensibilidade a proteases
Cristalinização
Aspectos positivos
Processamento de alimentos
Proteínas de leguminosas
Desnaturação térmica melhora acentuadamente a digestibilidade das proteínas, o que resulta da inativação de inibidores de tripsina (enzima que age na proteína)
Aspectos negativos
Perda de algumas propriedades
Muitas proteínas biologicamente ativas perdem sua atividade após desnaturação
Proteínas alimentares: Perda de solubilidade e de algumas propriedades funcionais
Estrutura nativa de uma proteína
Resultado líquido de várias interações atrativas e repulsivas que emanam forças intramoleculares variadas, bem como da interação de vários grupos proteicos com a agua como solvente circundante.
Tambem depende do ambiente da proteína.
Estado Nativo
É o mais estável
Mudança no ambiente
pH, força iônica, temperatura, composição de solvente
FORÇARÁ A MOLÉCULA A ASSUMIR UMA NOVA ESTRUTURA DE EQUILÍBRIO
Desnaturação
É um fenômeno no qual o estado inicial bem definido de uma proteína formada sob condições fisiológicas é transformada em uma estrutura final mal definida sob condições não fisiológicas, usando-se um agente desnaturante.
Não envolve nenhuma mudança química na proteína
Reversível
Depende das ligações que estabilizam sua conformação, da intensidade e do tipo de agente desnaturante
Desnaturação pelo calor: Irreversível
Desnaturação por Uréia: comumente reversível
Agentes de Desnaturação
Físicos
Temperatura, Pressão hidrostática, cisalhamento
Químicos
pH, solventes orgânicos, solutos orgânicos
Agentes de físicos
Calor
Calor não muda a carga das proteínas (cargas ficam mais na superfície – ligação com a agua).
Rompem as ligações de Hidrogênio e ligações eletrostáticas – que estabilizam a sua conformação causando também o desenrolamento da cadeia.
Velocidade de desnaturação – depende da temperatura
Temperaturas:
50 e 100°C – vibrações com rompimento de ligações – Desnaturação é irreversível
Calor
É o agente desnaturante mais utilizado no processamento e preservação de alimentos.
Isso pode afetar suas propriedades funcionais em alimentos, sendo, por isso, importante que se entendam os fatores que afetam a desnaturação protéica.
Temperaturas
-10ºC e -40ºC – desnaturação é irreversível
Nem sempre quanto menor a temperatura maior a estabilidade
Exceto: Enzima (galactosidase) – conserva a sua atividade a -40ºC
Glicinina – proteína de armazenamento da soja
Agrega-se e precipita-se quando armazenada a 2ºC, tornando-se então solúvel quando retorna a temperatura ambiente
Pressão hidrostática
Desnaturação induzida pela pressão pode ocorrer a 25ºC. (relação Temperatura X pressão)
A desnaturação de proteínas por pressão ocorre porque as proteínas são flexíveis e compressíveis.
Proteínas globulares: espaços vazios no interior da proteína.
Proteínas fibrosas: em sua maioria desprovidas de espaços vazios, são mais estáveis a altas pressões.
Cisalhamento
Cisalhamento mecânico
Agitação, amassamento, batimento, etc.
Causa a desnaturação de proteínas
Agentes de químicos
Envolve o rompimento ou formação de ligações covalentes e é geralmente irreversível;
Reações mais usadas são as de oxidação que agem sobre os grupos –SH e S-S.
Agentes de químicos
Ph 
As proteínas são mais estáveis a desnaturação em seus pontos isoelétricos
Energia repulsiva eletrostática líquida é pequena – proteína é estável em ph neutro
Em valores de ph extremos:
Forte repulsão eletrostática intramolecular resulta em expansão e desdobramento
Ph – desnaturam em valores extremos (maiores que 10 e menores que 3)
Solventes Orgânicos
Força Iônica – alteram a constante dielétrica e portanto, as forças eletrostáticas que contribuem para estabilização das proteínas.
Substâncias que rompem interações hidrofóbicas
Solventes apolares penetram nas regiões hidrofóbicas , rompendo essas interações – Desnaturação.
Aditivos de Baixo peso molecular
Sais Neutros (Brometo, Iodeto, perclorato e tiocianato) denominados CAOTRÓPICOS, desestabilizam a estrutura protéica.
Concentrações > 1mol\L, sais tem efeitos iônicos específicos que influenciam a estabilidade estrutural das proteínas.
Estes sais diminuem a hidratação protéica e ligam-se fortemente as proteínas.
Salting-out : Maior atração entre as moléculas protéicas e formação de precipitados
MÉTODOS
MÉTODO DE KJELDAHL
Mais usado
Determina N orgânico total
Em alimentos o teor de N não proteico é baixo
Todos os tipos de alimentos
Relativamente simples e barato
Demorado e trabalhoso
Exato nas mãos de analistas experientes
Método oficial (serve como padrão para novos métodos)
Uso de fator de conversão 
MÉTODOS
MÉTODO DE KJELDAHL
Erros inerentes do método
Assume que todo N da amostra é proteico;
Considera que toda proteína tem em média 16% de N.
ETAPAS: % proteina = % N organico total x Fator
- Digestão, Destilação, Titulação
Método de Biureto
Princípio: Substâncias contendo 3 ou + ligações peptídicas formam complexo de cor violeta-púrpura ao reagirem com sais de em meio alcalino
A absorbância é lida a 540nm
A intensidade da cor é proporcional ao teor de proteína
Reagente: CuSO4.5h20 + NaOH + Tartarato de Na e K
Amostra: solução contendo 1-10mg\ml de proteína
Aplicação: Proteína de soja, cereais, carne e frações protéicas 
Método de Biureto
Vantagens:
Rápido, simples e Barato
Poucos interferentes (pigmentos, altas concentrações de sais de amônia)
Não detecta N não-protéico
Método de Biureto
Desvantagens:
Presença de lipídios ou carboidratos pode tornar a solução opaca;
Não é um método absoluto – cor varia com proteínas diferentes (deve ser padronizada com proteína conhecida – Soroalbumina bovina BSA ou com proteína determinada por Kjeldahl);
Usa curva de calibração
Método de Lowry
Combina a reação de Biureto com a redução de Folin-Ciocalteau
Princípio: substâncias contendo 3 ou mais ligações peptídicas formam complexo colorido com sais de Cu2+ em meio alcalino e se contiverem grupamentos aromáticos, reduzem o reagente fosfomolibdato-fosfotungstato resultando num complexo azul.
A absorbância pode ser lida a 750 nm (Quanto menor a concentração de proteína maior a sensibilidade)
Amostra: conter de 10 a 100 ug de proteína
Aplicação: em bioquímica (proteína pura ou frações).
Método de Lowry
50 – 100x mais sensível que Biureto
10 – 20 x mais sensível que método por leitura direta a 280 nm
Pouco afetado por turbidez da amostra
Específico, poucos interferentes (quanto maior a concentração de açucares redutores, sulfato de amônia e compostos sulfidrilas)
Relativamente simples
Cor varia com proteínas diferentes
A cor não é estritamente proporcional ao teor de proteína
Usa curva de calibração
Método por UV 280 nm
Proteínas absorvem radiação UV a 280 nm devido a presença de TRP, TYR e PHE
Devido a ligação peptídica
Pouco usado em alimentos: purificação e separação de proteínas e peptídeos bioativos
Rápido, relativamente sensível, não destrói as proteínas.
Ácidos nucléicos também absorvem a 280 nm
Solução não deve ter nem cor nem turbidez
Requer solução relativamente pura
Usa curva de calibração
Método de Bradford
Detecta a concentração de proteínas de 1-1,5 ug/ml;
Ready-to-use dye-binding reagent formulation
Fast (almost immediate) color development; read at 595 nm compatible
Refrigerated reagent is stable for 2 years
Superior linear response over the range of 125-1,500 ug/ml
Adaptable to microplates
Micro protocol useful for protein concentrations from 1-25 ug/ml