Métodos para estudo da expressão gênica

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Ana Beatriz Coelho 
Métodos para estudo da 
expressão gênica I 
Para que? 
 Clonagem de genes para expressão e afins 
 Modificação genética em animais e plantas 
 Vacina de DNA 
 Diagnóstico de doenças 
 Sequenciamento de genoma 
 Proteoma: conjunto de proteínas de um tecido 
 Entre outras aplicações. 
Reação em cadeia da Polimerase(PCR) 
 Permite a obtenção de um grande número de cópias de uma dada sequência de DNA. 
Baseia-se em determinadas características da replicação 
de DNA 
1. DNA pol. sintetiza DNA a partir de uma fita molde 
2. DNA pol. não inicia a síntese, somente estende a síntese a partir de um primer 
(precisa de 3´OH livre) 
3. Somente na direção 5´3´ 
4. Polimerização requer dNTPs 
Características: 
 Extremidades da sequência a ser amplificada devem ser conhecidas 
 O molde é uma fita simples de DNA para que haja síntese da fita complementar 
 A amplificação requer o uso de 2 primers que anelam nas extremidades de cada fita 
simples (uma para cada fita) 
 
 DNA pol. termoestável de bactérias extremófilas (não desnatura em altas temperaturas) 
Controle da expressão gênica: o que?, 
como?, intensidade?, por quanto tempo? 
Ana Beatriz Coelho 
Como é feito? 
3 fases em um ciclo (que é reproduzido várias vezes) 
Fase 1: Desnaturação 
 Quebra das pontes de hidrogênio  abertura da dupla 
fita. 
Fase 2: Anelamento do primer 
 O primer se liga 
 Pareamento específico (em uma temperatura mais baixa pode 
ocorrer mismatch: pareamento errado de bases) 
Fase 3: Extensão ou polimerização 
 Adição de nucleotídeos  Ligação fosfodiester com base na 
fita molde 
 
 
 Extensão do primer ou sintetiza DNA 
 Fitas de tamanhos diferentes são formadas, porém quanto mais 
ciclos, mais DNA do tamanho que precisa. Os DNAs grandes não atrapalham. 
 
G e C fazem mais 
pontes de H, logo se 
tiver maios quantidade de 
G e C, a temperatura 
pode estar mais alta 
O primer, além de fornecer OH livre, ele delimita a região da 
duplicação, e ainda permanece na cadeia formada, já que ele é 
formado por dexoxiribonucleotídeos. 
Ana Beatriz Coelho 
 
 
Materiais necessários: 
 Termocilador 
 Tubo de parede fina (auxilia a elevação de temperatura, e abaixar também) 
 DNA com a sequência 
 Primers 
 Condições iônicas adequadas 
 DNA pol. de bactéria extremófila 
Aplicações: 
 Amplifica qualquer DNA 
 Produtos de PCR podem ser diretamente sequenciados 
 Monitorar terapia de câncer 
 Detectar infecções virais ou bacterianas 
 Determinar o sexo em células pré-natais 
 Estudo de evolução molecular 
Visualização de PCR  eletroforese 
 O branco (tudo, sem o DNA) é necessário 
 Não é possível ver a quantidade de DNA 
PCR em tempo real 
 À medida que os ciclos vão ocorrendo é medida a amplificação 
 Permite dizer a quantidade 
Westen Blot 
 Eletroforese de polacrilamida (com SDS): separa de acordo com a carga, massa e forma 
 
Anticorpo 1ario específico Anticorpo 2ario antiptn acoplado a uma enzima-reação-detecção