Doseamento Microbiológico - Profa. Elisana Moura

Prévia do material em texto

29/10/2016
1
João Pessoa-PB
Dosagem Microbiológica
de Antibióticos
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA: CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE QUALIDADE
Profa. Dra. Elisana A. Moura Pires
9000-8000 a.c. 
INTRODUÇÃO
Penicillium notatum
ANTIBIÓTICOS 
INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS MAIS UTILIZADOS
o Método da diluição em série
o Macrodiluição
o Microdiluição
o Método turbidimétrico
o Método de difusão em ágar
9000-8000 a.c. 
INTRODUÇÃO
29/10/2016
2
9000-8000 a.c. 
INTRODUÇÃO
ATCC FIOCRUZ
DILUIÇÃO EM SÉRIE - MACRODILUIÇÃO
Resposta:“tudo ou nada” (1 a 10 mL)
MIC
MIC
MO teste
DILUIÇÃO EM SÉRIE - MICRODILUIÇÃO
Resposta:“tudo ou nada” (0,1a 0,2mL)
• Reprodutível;
• Dispersão do MO
DILUIÇÃO EM SÉRIE
Potência
Testa-se concomitantementepadrão e amostra:
P = CIMA
CIMP
Para maior precisão, ensaia-se concentrações
intermediárias entre o tubo com concentração
inibitória mínima e o imediatamente anterior.
X 100
DILUIÇÃO EM SÉRIE
Vantagens
o Mais sensível a baixas concentrações que outros
métodos
o Fornece a CIM ativa da substância analisada
Desvantagens
o A precisão está relacionada ao intervalo de
concentração utilizada
o Há interferência de soluções turvas ou coradas
o Contaminações grosseiras
MENOS USADO QUE O TURBIDIMÉTRICO E DE DIFUSÃO EM AGAR
9000-8000 a.c. 
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Considerações gerais
o Relacion a o tamanho d a zona de inibiç ão com a dose d a
substância ensaiada.
o O método emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído
em placas, em sistema d e bicamad a, através do qual a substância
teste se difunde.
29/10/2016
3
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Preparo das placas
Ágar
Papel de filtro
21 mL
Ágar inoculado 
(47 ºC)
4 mL
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Preparo das placas
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Antibiótico Microrganismo
Meio de cultura
a ser usado
(conforme 3.
Meios de
cultura).
Volume (mL) de
meio a ser
aplicado nas
camadas.
Volume 
de 
inóculo 
mL/100
ml
Temperatura 
de incubação 
das placas ºC
Base Superfície Base Superfície
Amoxilina Micrococcus luteus
(ATCC- 9341)
11 11 21 4 0,5 32 a 35
Ampicílina Micrococcus luteus
(ATCC - 9341)
11 11 21 4 0,5 32 a 35
Anfomicina Micrococcus flavus 
resistente à 
neomicina (ATCC -
14452)
2 1 21 4 0,5 36 a 38
Bacitracina Micrococcus luteus
(ATCC - 7468)
2 1 21 4 0,3 32 a 35
Bacitracina Micrococcus luteus
(ATCC - 10240)
2 1 21 4 0,3 32 a 35
9000-8000 a.c. 
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Método - Testes preliminares
A partir de parâmetros especificados em ensaios
anteriores e referentes a determinação da potência de
antibióticos descritos pela Farm. Bras. IV, USP e FDA, são
realizados testes preliminares para padronizar as
condições a serem utilizadas verificando parâmetros
como:
Microrganismo
Meio de cultura
Solução diluente
Concentração do inóculo
Concentração do fármaco
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Cultura de manutenção:
Repique deve ser feito a cada 7 dias
Conservação: refrigerador a - 4 ºC
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Repique do microrganismo para utilização no doseamento
35 ± 2 ºC
20-24 h
Sol. fisiológica
35 ± 2 ºC
20-24 h
+
25% transmitância 
580 nm
29/10/2016
4
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
o Utilizando placas de Petri, em capela de fluxo laminar,
transfere-se 21,0 mL de meio para cada placa (camada base).
o Após a solidificação desta camada, adiciona-se 4,0 mL de meio
inoculado. Assim que esta camada se solidificar, distribuir os
cilindros ou templates de aço inoxidável.
o Com auxílio de pipetador automático transfere-se as alíquotas
de padrões e amostras, 200 µL, para cada orifício.
P1
P3 P2
A1
A2
A3
As placas d evem ser incubadas a 35ºC ± 2ºC e
após 16-18 horas medem-se os diâmetros dos
halos de inibição com auxílio de um paquímetro.
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Delineamento para ensaio do tipo quantitativo:
P1 P2
A1 A2
P
A1
P1
P3 P2
A1
A2
A3
A5
A2 A4
A3
5 X 1
3 X 3
2 X 2
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
E. coli
S. luteus
o Diâmetro do halo é função d a
concentração da substância;
o Relaç ão linear : diâmetro do
halo (mm) X log da
concentração
B. subtilis
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
o Técnicas utilizadas para difusão em ágar:
o Técnica de cilindros em placas
o Técnica de template ou moldes de aço
o Técnica de orifícios ou poçinhos
o Técnica de disco ou papel
o Técnica de gotas ou depósito em superfície
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR – CILINDROS EM PLACA
o Cilindros de vidro, porcelana, aço inoxidável, alumínio
etc.
o Diâmetro interno: 6,0 mm ± 0,1 mm
o Diâmetro externo: 8,0 mm ± 0,1 mm
o Altura: 10,0 mm ± 0,1 mm
29/10/2016
5
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR - TEMPLATE OU MOLDES DE AÇO
o São moldes de aço inoxidável com orifícios nos quais
são colocados as soluções padrão e amostra
o É o mesmo princípio da técnica cilindros em placa,
porém o manuseio é mais prático
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR - ORIFÍCIOS OU POÇINHOS
o São perfurados pequenos poços no meio de cultura
através de instrumento adequado de maneira que
forme um cilindro embutido no meiosólido
o Os halos podem ser irregulares se o instrumento que
servirá para a construção dos orifícios não for
padronizado
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR - DISCO DE PAPEL
o Discos de papel com 8 mm de diâmetro;
o 60 µL;
o Solução P e A com pipeta ou imersão por tempo pré
definido;
o Os discos podem ser colocados manualmente com
auxílio de pinça estéril sobre a superfície do meio;
o Amostra com alta concentração de solvente orgânico.
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR - GOTAS OU DEPÓSITO EM SUPERFÍCIE
o Adiciona-se 2 a 3 µL da solução P e A na superfície do
ágar com microsseringa
o Permite automação
o Pouco utilizado
o A superfície do gel deve estar seca
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Vantagens
o Em todas as técnicas deste método as amostras não
precisam estar estéreis
o As técnicas de cilindro e de orifício mostram-se mais
sensíveis à pequenas concentrações que a de disco
o Técnica de disco é mais simples, rápida e de melhor
precisão, além de permitir o ensaio com altas
concentrações de solvente orgânico
Desvantagens
o As técnicas de cilindro e de orifício são mais trabalhosas e
necessitam de cuidados extremos no manuseio das placas
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Produto em análise: Cefalexina.
Forma farmacêutica: Drágeas
Método empregado: Difusão em ágar
Microrganismo teste: Micrococcus luteus
Solução diluente: Tampão fosfato de potássio pH 6,0
Meios de cultura – Camada base - Ágar Muller Hinton
Camada semeada - Ágar Muller Hinton
Volume do inóculo: 0,2 mL
Concentrações finais: 8, 16 e 32 l/mL
Temperatura de incubação: 35-37 °C
Tempo de incubação: 18 horas
29/10/2016
6
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
10mg do padrão primário ou o equivalente em relação ao 
peso médio
BV 100mL
[100µg/mL]
BV 10mL
BV 10mL
BV 10mL
[32µg/mL][8µg/mL] [16µg/mL]
0,8mL 1,6mL 3,2mL
Preparo das soluções padrão e amostra
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Cálculo dos resultados
P1 
(8um/mL)
P2
(16um/mL)
P3 
(32um/mL)
A1 
(8um/mL)
A2 
(16um/mL)
A3 
(32um/mL)
I 14,0 15,5 16,4 13,2 15,2 17,0
II 13,0 15,3 16,6 13,3 15,0 16,3
III 13,0 15,2 16,4 13,2 15,0 16,0
IV 13,2 15,4 16,6 13,1 15,3 16,4
V 13,0 15,0 16,6 13,2 15,2 16,2
VI 13,2 15,4 16,2 13,2 15,1 16,6
Soma 79,4 91,8 98,8 79,2 90,8 98,5
Média 13,23 15,30 16,47 13,20 15,13 16,42
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
P
Potência
D
iâ
m
e
tr
o
 d
o
 h
a
lo
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Cálculo dos resultados
M = F/b
Diferença da 
potência
Pot =Antilog M x 100
E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)]
b = E/I
Aumento/Dose
I = log R
Proporção 
das doses
F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)]
MÉTODO DIFUSÃO EM ÁGAR
Cálculo dos resultados
I = log R (R=2)
I = log 2
I = 0,301
E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)]
E = ¼[(32,88-26,43)]
E = 1,6125
F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)]
F = 1/3[(44,75-45,00)]
F = -0,0833
b = E/I
b = 1,6125/0,301
b = 5,3571
M = F/b
M = -0,0833/5,3571
M = -0,01556
Pot = Antilog M x 100
Pot = Antilog - 0,01556 x 100
Pot = 96,49%
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
o Baseia-se na inibição ou no crescimento
microbiano medido através da turbidez
(transmitância ou absorvância) da suspensão de
microrganismos adequados/sensíveis ao
composto contido em um meio com o antibiótico
ou fator de crescimento.
o A resposta do microrganismo é função direta da
concentraçãoda substância.
29/10/2016
7
ANTIBIÓTICO
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Padronização do microrganismo para utilização no doseamento
Sol. fisiológica
35 ± 2 ºC
20-24 h
+ 25% transmitância 
580 nm
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Triplicata
Progressão geométrica
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
35 ºC ( 2 ºC)
3 a 4 horas
λ = 530 nm
0,5 mL de formaldeído 12%
• Agitação
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
P
Calcula-se a potência através de métodos estatísticos
Potência
29/10/2016
8
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Vantagens
o Mais rápido; Meio líquido.
Desvantagens
o Há interferência d e soluções turvas ou coradas (padrão e
amostra não devem precipitar em contato com o meio)
o Padrão e amostra devem ser solúveis em águ a ou em solventes
miscíveis em concentração tal que não interfira no crescimento
o Há necessidade de equipamento específico
o Contaminações grosseiras
ANTIBIÓTICO
FATOR DE CRESCIMENTO
Doseamento Microbiológico
Ref erência