Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico - Profa. Elisana Moura

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06/08/2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE 
CIÊNCIAS FAMACÊUTICAS
Profa. Dra. Elisana Moura
João Pessoa, 2016
MÉTODOS DE ANÁLISE
AMOSTRAGEM : Coleta, transporte e preparo
CONTAGEM DAS FORMAS VIÁVEIS
ISOLAMENTO DE IDENTIFICAÇÂO DOS MICROORGANISMOS
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
MÉTODOS DE ANÁLISE
 MÉTODOS DE CONTAGEM DOS MICRORGANISMOS
Em meio sólido, com semeadura da amostra em
profundidade (Pour Plate).
Em meio sólido, com semeadura da amostra em
superfície (Stread Plate).
Membrana filtrante.
Número mais provável.
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
Para contagem total de bactérias os meios oficialmente
recomendados são principalmente ágar caseína-soja e
ágar nutriente;
Para fungos, ágar Sabouraud-
dextrose e ágar batata;
MÉTODOS DE ANÁLISE
 MÉTODOS DE CONTAGEM DOS MICRORGANISMOS
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
 Permite estimar o
número de células
viáveis.
MÉTODOS DE ANÁLISE
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
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O meio de cultura é preparado e distribuído previamente
em placas de Petri.
Empregando-se pipetas estéreis, volumes de 0,1 a 0,5
mL de cada diluição considerada são distribuídos na
superfície do gel já solidificado, sendo o espalhamento
efetuado com movimentos cuidadosos ou com o auxílio
de bastão de vidro ou alça de Drigalski;
SPREAD PLATE 
MÉTODOS DE ANÁLISE
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
2 a 3 réplicas de cada diluição
O meio de cultura estéril fundido e resfriado a 45 – 48°C,
em quantidade de cerca de 20 mL.
MÉTODOS DE ANÁLISE
O meio de cultura estéril fundido e resfriado a 45 – 48°C,
é vertido sobre cada uma das placas, seguido de
homogeneização com movimentos em S ou 8 sobre a
bancada de trabalho, as quais permanecem até
solidificação a temperatura ambiente;
POUR PLATE
Consiste na transferência de alíquota de 1 a 2 mL da
diluição da amostra (de cada diluição a ser considerada)
para réplicas de placas de Petri estéreis;
MÉTODOS DE ANÁLISE
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
 Permite estimar o número de células viáveis.
1 a 2 mL da amostra
MÉTODOS DE ANÁLISE
Pour Plate:
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
MÉTODOS DE ANÁLISE
Segue-se incubação das
placas, em estufa, na
posição invertida;
Após 2 a 5 dias de
incubação a 30 – 35°C,
para bactérias e 5 a 7 dias
para bolores e leveduras, a
20 – 25°C, as colônias são
contadas;
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
MÉTODOS DE ANÁLISE
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Alíquotas do produto sob forma líquida ou suas
diluições são filtradas através de membranas apropriadas
(0,45 mm ou 0,20 mm de poro e 47 mm de diâmetro,
constituídas em derivados celulósicos);
Esta metodologia é vantajosa por
permitir volumes elevados na
amostragem e pela acuidade.
MEMBRANA FILTRANTE
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
MÉTODOS DE ANÁLISE
a) Remoção do filtro de membrana da embalagem;
b) Colocação da amostra no funil contendo o filtro de membrana;
c) Remoção da membrana filtrante contendo microrganismos;
d) Colocação dos filtros nas placas de Petri contendo meio de cultura;
e) Crescimento dos microrganismos;
a b
c d e
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
A determinação do NMP de microrganismos se baseia
em estimativa fundamentada em probabilidade. Assim,
indica o valor dentro de uma faixa que reflete o número
de microrganismos presente.
NÚMERO MAIS PROVÁVEL - NMP
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
MÉTODOS DE ANÁLISE
Vantagem da método
Permitir melhor revitalização dos microrganismos
debilitados, em função do perfeito contato da amostra
com o meio de cultura.
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
MÉTODOS DE ANÁLISE
Exige a disponibilidade de tabelas estatísticas específicas
para obtenção de resultados a partir das leituras;
O número de réplicas empregadas a cada diluição pode
variar, sendo mais comuns tabelas construídas a partir de 3
ou 5 réplicas. No cálculo de contaminantes da amostra deve
ser considerado ainda o fator de diluição utilizado;
MÉTODOS DE ANÁLISE
NÚMERO MAIS PROVÁVEL - NMP
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
Número mais 
provável
(NMP)
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• Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos
microrganismos.
• Além dos principais nutrientes oferecem outras condições
indispensáveis ao desenvolvimento dos microrganismos, como
por exemplo, pH, e agentes inibidores a microbiota de
associação.
Meios de cultura
Os meios desidratados são higroscópicos e muito sensíveis a
umidade, temperatura, ao calor e a luz.
 Instruções completas para o preparo do meio são dadas no
rótulo do frasco.
 Como regra geral, é interessante preparar uma quantidade
suficiente para no máximo, uma semana.
Meios de cultura
Verificar os controles de resíduos na vidraria, antes
do uso.
Para permitir uma homogeneização adequada,
preparar o meio em frasco com capacidade igual a
duas vezes o volume final do meio.
Abrir o frasco do meio de cultura longe de correntes de
ar e umidade. Evitar inalar o pó e o contato
prolongado com a pele. Pesar o meio rapidamente de
maneira precisa, sem criar “nuvens de poeira”. Fechar
novamente o frasco, tão logo seja possível.
Reconstituição dos meios desidratados
Meios contendo ágar devem ser aquecidos antes da
autoclavagem para completa dissolução. Ferver o meio
sem queimá-lo.
Meios que não podem ser autoclavados estarão prontos
para serem distribuídos em placas ou em outros
materiais após o aquecimento necessário. Para o
preparo desses meios, usar todo o material estéril.
A maioria dos meios de cultura requer esterilização
final em autoclave a 121°C por 15 minutos.
Reconstituição dos meios desidratados
SÓLIDOS 
• Usa-se normalmente o Agar (1,0 a 2,0%), se
funde por volta de 49°C.
Agar Nutriente em placa de Petri
Meios de cultura: Quanto a consistência
• Possuem uma baixa porcentagem
de ágar (0,4%). São usados para
verificar a motilidade das
bactérias. Ex: Agar motilidade.
SEMI-SÓLIDOS
Agar Motilidade
Meios de cultura: Quanto a consistência
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Agem como diluentes iniciais, permitindo a
manutenção e moderado desenvolvimento de um
ou mais microrganismos.
LÍQUIDOS
Caldo tioglicolato
Meios de cultura: Quanto a consistência
ENRIQUECIMENTO
Meio rico em nutrientes, eficiente para o crescimento de
um grande número de microrganismos.
Caldo caseína-soja
Meios de cultura: Quanto a composição
Caldo Rappaport 
Para Salmonella
tiphymurium e enteritidis
ENRIQUECIMENTO SELETIVO
Possuem nutrientes básicos para o desenvolvimento do
microrganismo desejado, e agentes seletivos capazes de inibir
o desenvolvimento dos contaminantes.
Meios de cultura: Quanto a composição
VERDE MALAQUITA E 
CLORETO DE 
MAGNÉSIO.
EX: Ágar sangue: 5% de sangue de carneiro.
• Diferenciar as bactérias hemolíticas (produzem enzimas 
que lisam as hemácias formando uma zona clara ao redor 
da colônia);
• das não hemolíticas (que não lisam as hemácias, e 
portanto não formam este halo ao redor das colônias).
Meios de cultura: Quanto a finalidade
H
e
m
ó
lis
e
 B
e
ta
, 
a
lf
a
 e
 g
a
m
a
.
Streptococcus pyogenes ou Staphylococcus aureus 
Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae
Enterococcus faecalis ou Staphylococcus epidermidis
Ex.: Ágar MacConkey – contém sais biliares e corante cristal violeta e 
vermelho neutro, os quais:
• Inibem o crescimento deGram +
• Não inibem as Gram – (produtoras de ácido a partir do açúcar
tornam-se vermelhas e as não produtoras de ácido ou produtoras
de ácidos fracos formam colônias rosa-pálido ou colônias que são
claras na periferia e têm o centro rosado).
Meios de cultura: Quanto a finalidade
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Colônias em ágar MacConkey
(lactose positiva), após 18 horas 
de incubação a 35±2ºC
Colônias em ágar MacConkey, no 
mesmo tempo e temperatura 
(lactose negativa)
PROCEDIMENTOS DE ANÁLISE
 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE NUTRITIVA DOS MEIOS DE 
CULTURA;
 INOCULAÇÃO DOS MICRORGANISMOS TESTES NA 
AMOSTRA;
 RECUPERAÇÃO DOS MICRORGANISMOS NA AMOSTRA
 CONTROLE NEGATIVO
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
9000-8000 a.c. 
MICRORGANISMOS PADRÃO
9000-8000 a.c. 
ATCC FIOCRUZ
MICRORGANISMOS PADRÃO
9000-8000 a.c. 
oHidratação: água destilada, solução salina
ou tampão pH 7,2;
oVerte a solução no meio de cultura (caldo
nutritivo) e incuba (24 – 48h);
oAlçada para meio caldo nutriente estéril +
glicerol 10% em tubos criogênicos em torno
de 2 mL;
oTemperatura de -40 ºC ou nitrogênio
líquido.
Cultura 
de Reserva
MICRORGANISMOS PADRÃO
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MICRORGANISMOS PADRÃO MÉTODOS DE ANÁLISE
TÉCNICAS ASSÉPTICAS NA AMOSTRAGEM E 
EXECUÇÃO DO TESTE
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
Métodos de Esterilização
Remover, ou destruir todas as formas de vida do produto
considerado.
 Procedimento selecionado
o Natureza do material;
o Tipo, quantidade e fonte de contaminantes nos produtos
o Condições de emprego do método
Métodos de Controle de Qualidade Microbiológico
Métodos 
Físicos
Métodos 
Químicos
Calor Úmido
Calor Seco
Filtração
Irradiação
Líquido
Gases
Térmico
Ionizante
Não Ionizante
Métodos de Esterilização
 Processos Esterilizantes:
Esterilização Térmica
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Métodos 
Físicos
Calor Úmido
Calor Seco
 Inativação dos microrganismos depende do grau de
aquecimento, do tempo de exposição, e da presença de
água;
 Processos oxidativos e coagulação e desnaturação das
proteínas e enzimas essenciais.
Métodos de Esterilização
Térmico Métodos 
Físicos
Calor Úmido
Calor Seco
 A esterilização por calor úmido é indicada somente no
caso de materiais permeáveis ao vapor e de soluções
aquosas. Ex. Autoclave;
 A esterilização por calor seco pode ser adequada para
líquidos não aquosos ou produtos em pó. Ex. Estufa.
Métodos de Esterilização
Térmico
Métodos de Esterilização - Estufa Métodos de Esterilização - Estufa
 Distribuir os artigos no interior da câmara de forma 
adequada;
 Embalagem adequada: caixa metálica, papel alumínio e 
frasco de vidro refratário;
 Materiais não termoresistentes: tecido, borracha, papel;
 Calibração do equipamento (Monitoramento).
Métodos de Esterilização - Estufa
Indicador Químico
Métodos de Esterilização - Estufa
Indicador Biológico
Bacillus atrophaeus ATCC 9372 
(48h)
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Métodos de Esterilização - Autoclave
121 ºC por 15 min, 
1 atm.
Utilização do Autoclave
Embalagem dos materiais
Tecidos: Algodão e manta de polipropileno 100%
Porosidade : 0,22 µm/ Gramatura: 60g/m2
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Métodos de Esterilização - Autoclave
132oC por 3 a 4 minutos
Primeira geração – tiras de
papel impregnado com
Bacillus Subtillis e
Stearothermophillus, o
material é encaminhado ao
laboratório para incubação e
o resultado sai em um
período de 5 a 7 dias.
Indicadores Biológico
Segunda geração – ampolas
contendo esporos do Bacillus
stearothermophillus, com leitura
final de 48 horas.
Terceira geração – A leitura é
realizada no máximo em 3 horas.
Mudança de coloração
de roxo para amarelo
Indicadores Biológico
Referência