Bioquímica Ação Enzimática

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Introdução
Era já sabido, entre o final do século XVII e início do século XVIII, que secreções estomacais eram capazes de digerir a carne;  era também conhecida a conversão de amido a açúcares pela saliva e extractos vegetais. O mecanismo subjacente a estas transformações não era, no entanto, conhecido.  
As enzimas foram descobertas no século XIX, aparentemente por Pasteur, que concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura é catalisada por fermentos. Ele postulou que esses fermentos (as enzimas) eram inseparáveis da estrutura das células vivas do levedo. Pasteur declarou que "a fermentação alcoólica é um acto correlacionado com a vida e organização das células do fermento, e não com a sua morte ou putrefacção".
As enzimas convertem uma substância, chamada de substrato, noutra denominada produto, e são extremamente específicas para a reacção que catalisam. Isso significa que, em geral, uma enzima catalisa um e só um tipo de reacção química. Consequentemente, o tipo de enzimas encontradas numa célula determina o tipo de metabolismo que a célula efetua.
Muitas enzimas possuem, além da porção protéica propriamente dita, constituída por uma seqüência de aminoácidos, uma porção não-protéica.
A parte protéica é a apoenzima e a não protéica é o co-fator. Quando o co-fator é uma molécula orgânica, é chamado de coenzima. O mecanismo de atuação da enzima se inicia quando ela se liga ao reagente, mais propriamente conhecido como substrato. É formado um complexo enzima-substrato, instável, que logo se desfaz, liberando os produtos da reação a enzima, que permanece intacta embora tenha participado da reação
	
 
Mas para que ocorra uma reação química entre duas substâncias orgânicas que estão na mesma solução é preciso fornecer uma certa quantidade de energia, geralmente, na forma de calor, que favoreça o encontro e a colisão entre elas. A energia também é necessária para romper ligações químicas existentes entre os átomos de cada substância, favorecendo, assim a ocorrência de outras ligações químicas e a síntese de uma nova substância a partir das duas iniciais. Essa energia de partida, que dá um “empurrão” para que uma reação química aconteça, é chamada de energia de ativação e possui um determinado valor.
A velocidade da reacção catalisada por uma enzima é aumentada devido ao abaixamento da energia de ativação necessária para converter o substrato no produto. O aceleramento da reação pode ser da ordem dos milhões de vezes: por exemplo, a enzima orotidina-5'-fosfato descarboxilase diminui o tempo da reação por ela catalisada de 78 milhões de anos para 25 milissegundos.2
Como são catalisadores, as enzimas não são consumidas na reação e não alteram o equilíbrio químico dela.
A atividade enzimática pode depender da presença de determinadas moléculas, genericamente chamadas cofactores. A natureza química dos cofactores é muito variável, podendo ser, por exemplo, um ou mais iões metálicos (como o ferro), ou uma molécula orgânica (como a vitamina B12). Estes cofactores podem participar ou não directamente na reacção enzimática.
Determinadas substâncias, podem inibir a actividade de algumas enzimas, diminuindo-a ou eliminando-a totalmente; são os chamados inibidores enzimáticos.
Inibição Enzimática Reversível
A inibição de enzimas reversível diminui a atividade enzimática através de interação reversível. Ou seja, o inibidor estabelece com a enzima um complexo com uma ligação instável, não covalente. Como a ligação é instável, após a dissociação com o inibidor, a enzima pode retomar sua atividade. Existem três tipos de inibição enzimática reversível: competitiva, não competitiva e incompetitiva. Esses tipos podem ser distinguidos experimentalmente pelos efeitos do inibidor sobre a cinética de reação da enzima.
Inibição Competitiva
A molécula inibidora apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima que se liga para realizar a catálise. Ela liga-se ao sítio ativo da enzima, que não pode realizar o processo catalítico, pois seu sítio ativo está ocupado para poder ligar-se ao substrato correto. Portanto o inibidor compete como substrato pelo sítio de ação.
O inibidor forma com a enzima o complexo enzima-inibidor EI, que é análogo ao complexo enzima substrato ES.
A molécula do inibidor não é modificada pela enzima.
O efeito da reação modifica o Km, mas não altera a velocidade.
Um exemplo de enzima que sofre esse tipo de inibição é a enzima succinato desidrogenase, que é a responsável pela transformação do succinato em fumarato, mas quando a ela se liga o malonato, não ocorre reação, ou seja, o malonato é o agente inibidor dessa enzima.
Inibição não competitiva
Um inibidor não competitivo pode se combinar com a enzima livre ou com o complexo ES, interferindo na ação de ambos. Esses inibidores ligam-se a um sítio da enzima diferente do sítio ativo, muitas vezes ocasionando deformação da mesma de forma que ela não forme o complexo ES na velocidade usual e, uma vez formado, ele não se desdobra na velocidade normal para originar o produto.
Ocorre quando uma molécula ou íon pode se ligar em um segundo local na superfície enzimática, que não seja o sítio ativo. Isto pode distorcer a enzima tornando o processo catalítico ineficiente.
O inibidor não competitivo pode ser uma molécula que não se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima. É o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porque inibe a ligação do complexo ES e não da enzima livre.
O efeito da reação modifica a velocidade e o Km permanece constante.
Como exemplo, há a proteína α1-antitripsina que liga-se à tripsina e inibi a ação desta. 
Inibição Incompetitiva
A inibição incompetitiva caracteriza-se pelo fato de o inibidor não se combinar com a enzima livre, nem afetar sua reação com o substrato normal; contudo ele se combina com o complexo Enzima-suvstrato para originar um complexo ternário inativo Enzima-substrato-inibidor, incapaz de sofrer a etapa subsequente da reação para produzir o produto.
Essas interrelações indicam que o grau de inibição pode aumentar à medida que se aumenta a concentração do substrato.
Podem ser observada em reações catalisadas por enzimas que possuem mais de um substrato.
Reduz igualmente a Vmax e Km.
Inibição Enzimática Irreversível
Os inibidores irreversíveis são aqueles inibidores que se ligam no sítio ativo da enzima, de modo a formar um complexo estável, ou seja, há a formação de uma ligação covalente entre o inibidor e a enzima, o que pode promover uma destruição dos grupos funcionais essenciais da enzima. Essa inibição é progressiva, aumentando com o tempo até que atinja uma máxima inibição. As substâncias que modificam quimicamente os resíduos de aminoácidos específicos podem agir como inibidores irreversíveis. Os inibidores irreversíveis são muito úteis em estudos de mecanismo de reação.
A cinética do inativador irreversível é comparável à de um inibidor não competitivo puro. Nesse tipo de inibição há inibidores chamados de inibidores suicidas ou inibidores com base no mecanismo, os quais são compostos geralmente pouco ativos, até que se liguem à enzima. Eles agem de duas formas, ou é convertido em um composto muito reativo que se combina irreversivelmente com a enzima ou forma um produto que é um potente inibidor do passo seguinte da via metabólica.
Materiais e reagentes 
· Tubos de ensaio 10 X 150 mm;
· Banho de água à 37ºC;
· Banho de água fervente;
· Banho de gelo;
· Pipetas de 2, 5 e 10 ml;
· Becheres de 400 e 600 ml;
· Estante para tubos de ensaio.
· Enzima invertase;
· Tampão acetato pH 5,0;
· Solução de sacarose a 25 mmol/l (9,5 g/l) em tampão acetato pH 5,0;
· Solução de ácido 3,5-di-nitro-salicílico (DNS);
· Água destilada.
· Solução de sacarose a 0,2 mol/l (6,8 g/100 ml) em diferentes tampões (acetato pH 3,6; acetato pH 5,0 e fosfato pH 8,0.
Procedimentos 
Influência da concentração de substrato:
Em sete tubos de ensaio com tampa, enumerados de 1 a 7 , adicionou-se tampãoacético e sacarose 25 mmol/L, seguindo o seguinte padrão:
	Reagentes 
	Tubo 1
	Tubo 2
	Tubo 3
	Tubo 4
	Tubo 5
	Tubo 6
	Tubo 7
	Tampão acético ph= 5(ml)
	2,0
	1,8
	1,6
	1,0
	0,5
	0,2
	0,0
	Sacarose 25mmol/L (ml)
	0,0
	0,2
	0,4
	1,0
	1,5
	1,8
	2,0
Colocou-se 7 tubos com o tubo da enzima em banho de água para aclimatar a 37 graus durante 5 minutos. Feito isso transferiu-se cerca de 0,5 ml de enzima para cada tudo de ensaio dando um intervalo de 30 segundos de diferença nos tubos já aclimatados. Aguardou-se 15 minutos desde o primeiro tubo adicionado enquanto ao hidrolise ocorria e em seguida adicionou-se 1 ml de DNS, respeitando a ordem de 30 segundos para cada tubo.
 Terminado de adicionar DNS no ultimo tubo, retirou-os da água e esperou até que os tubos se resfriassem. Após resfriado, adicionou-se 6,5 ml de água destilada em cada tubo e homogeneizou. Leu-se a adsorvância no espectofotometro.
Influência do pH: 
Colocou-se 3 tubos contendo 2 ml de solução de sacarose 0,2 mol/L em diferentes faixas de tamponamento e o tubo contendo enzima no banho para aclimatação. Após aclimatado, adicionou-se 0,5 ml de enzima em cada tubo e esperou-se 15 minutos até que fosse adicionado 1 ml de DNS para cancelar a reação. Retirou-os do banho e esperou esfriar. Feito isso, adicionou-se 6,5 ml de água destilada e homogeneizou. Leu-se a adsorvância no espectofotometro.
Influência da temperatura:
Colocou-se 3 tubos contendo 2 ml de solução de sacarose 0,2 mol/L com tampão acético deixando o pH=5 em diferentes temperaturas: um em banho de gelo( 0 graus), banho à 37 graus e outro em água fervente a 100 graus. Adicionou-se 0,5 ml de enzima em cada tubo e esperou-se 15 minutos até que fosse adicionado 1 ml de DNS para cancelar a reação. Retirou-os do banho e esperou esfriar. Feito isso, adicionou-se 6,5 ml de água destilada e homogeneizou. Leu-se a adsorvância no espectofotometro.
Aplicação tecnológica do ácido ascórbico:
Cortou-se uma maçã levemente madura em dois pedaços semelhantes. Ao primeiro pedaço, foi-se adicionado ácido ascórbico em excesso na parte interior, já o outro não fora adicionado nada. Observou-se o resultado.
Resultados e discussões 
Influência da concentração de substrato:
Ao realizar o procedimento, observa-se que foram obtidos os seguintes valores de absorbância para cada tubo com suas respectivas quantidades de tampão e solução de sacarose:
	Tubo
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	Absorbância
	0
	0,000
	0,016
	0,052
	0,078
	0,110
	0,100
É observado que ao aumentar a quantidade de substrato, logo sua concentração, o valor de absorbância aumenta. O padrão não acontece apenas para o último tubo, no qual pode ter ocorrido um fator que influenciou o resultado, causando um erro na análise. Esses fatores podem ter ocorrido devido a adição tardia do reagente DNS, acarretando a paralisação da reação em um intervalo de tempo desproporcional. 
Para cada tubo, é possível calcular a concentração de substrato, seguindo o seguinte processo:
C1 * V2 = C2 *V2
25mmolL-1 * V (volume adicionado ao tubo) = C2 * V(Volume de sacarose + tampão)
C2 = [25mmolL-1 * V (volume adicionado ao tubo)]/ V(Volume de sacarose + tampão)
Assim, para cada tubo, temos que a concentração dos substratos é:
	Tubo
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	Concentração do substrato (mmol/L)
	0,00
	2,50
	5,00
	12,50
	18,75
	22,50
	25,00
É possível também, calcular as atividades enzimáticas da seguinte forma:
Para cada valor de absorbância obtido, encontra-se a concentração de glicose em mg/ml a partir da equação obtida do gráfico de calibração da absorbância em função da concentração de glicose.
Y = 0,2598x – 0,0096
Substituindo o y pelos valores de absorbância encontrados, temos que as concentrações de glicose são:
	Tubo 
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	Concentração de glicose (mg/ml)
	0,00
	0,00
	0,099
	0,237
	0,337
	0,460
	0,422
A partir das concentrações de glicose, é necessário converter mg/ml para mmol/ml, Desta forma tem-se que:
180mg de glicose ---------------------------------------------1mmol de glicose
C mg (de cada concentração encontrada) ------ Xmmol de glicose (em 1 ml)
Fazendo a regra de três para cada quantidade de mg das concentrações de glicose encontrada, obtemos:
	Tubo 
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	Concentração (mmol/ml)
	0,00
	0,00
	5,50x10-4
	1,31x10-3
	1,90x10-3
	2,55x10-3
	2,35x10-3
Para encontrar a atividade enzimática em µmol/min, temos que multiplicar cada mmol da concentração por 103 e em seguida dividir por 15min (tempo de reação). Assim temos:
	Tubo 
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	Atividade enzimática (µmol/min)
	0,00
	0,00
	0,037
	0,087
	0,127
	0,170
	0,157
Percebe-se que a atividade esta em constante aumento, e ocorre um decréscimo no último tubo. O esperado seria o constante aumento da atividade, onde em certo momento, ocorre de forma menos acentuada, devido à aproximação da velocidade máxima, chegando ao ponto de sobrecarga da enzima. Com os valores de concentração de substrato e ação enzimática, pode-se obter o seguinte gráfico:
Analisando o gráfico, percebesse que a linha de tendência tende a aumentar a certo ponto, até que chegue a ficar aproximadamente constante, neste ponto, a velocidade da ação enzimática chega a seu ponto máximo, ficando quase inalterado ao aumentar a concentração de substrato. Neste ponto, pode-se dizer que os sítios ativos estão todos em ação, ocupados.
Obs: o sexto ponto do gráfico esta fora da linha de tendência, este é devido a adição tardia do DNS, provocando um excesso de reação para o tempo estimado, produzindo um excesso de glicose para o tem pode 15 minutos.
Influência do pH na cinética enzimática
As enzimas sofrem os mesmos efeitos estruturais observados com as  proteínas globulares pela variação de pH e de temperatura. Mudanças extremas de pH podem alterar a estrutura da enzima devido a uma repulsão de cargas. Quando uma enzima encontra-se em pH alcalino, a carboxila encontra-se desprotonada, na forma de COO-, enquanto em meio ácido, a amina encontra-se na forma de NH+3.
As enzimas são catalizadores de reações bioquímicas e possuem uma característica bem definida: são muito especificas. Daí, vem o esquema chave-fechadura, que representa a conformação espacial de uma enzima que se “encaixa” perfeitamente para um determinado substrato. As cargas e dipolos da sítio ativo da enzima interagem fortemente com um determinado substrato, catalizando a formação de produtos. Porém, uma pequena variação no pH pode alterar a repulsão e atração de cargas no sítio ativo, fazendo com que a ligação enzima-substrato seja desfavorecida, ou até mesmo, não aconteça.
Portanto, no estudo das enzimas, afirma-se que há um pH ótimo, que o qual há maior interação enzima-substrato e consequentemente uma maior quantidade de produto é formado, obtendo um rendimento maior e favorecendo a cinética enzimática.
A reação enzimática realizada foi a hidrolise da sacarose em d-glicose e d-frutose em 3 tubos contendo diferentes faixas de pH (solução tamp
No caso da enzima analisada, a invertase, obteve-se os seguintes resultados:
	Tubos
	Invertase
	Coloração
	Absorbância
	Tubo 1 
	pH 3,6
	Amarelo.
	0,013
	Tubo 2
	pH 5,0
	Marrom avermelhado.
	1,589
	Tubo 3
	pH 8,0
	Laranja escuro.
	0,044
Os valores lidos do espectofotômetro em absorbância indicam quais foram os tubos em que a reação enzimática ocorreu com mais eficiência, isto é, gerou mais produtos em um mesmo espaço de tempo.
Com isso, conclui-se que o pH ótimo da Invertase é na faixa de 5,0, já que houve maior formação de produtos. O tubo 1, com pH 3,6 foi o que obteve o menor rendimento, seguido pelo tubo 3 (pH 8,0). 
Influência da temperatura 
Ao realizar as etapas do procedimento, Observaram os seguintes valores de absorbância:
	Tubo a banho fervente (próximo de 100ºC)
	Tubo a banho de gelo (próximo de 4ºC)
	Tubo a banho 37ºC
	0,965
	0,832
	0,949
Fazendo os cálculos de velocidadeenzimática, temos as seguintes etapas:
Y = 0,2598x – 0,0096
Onde substitui Y na equação da curva de calibração pela absorbância encontrada para encontrar a concentração de glicose. Desta forma temos:
	Tubos
	Tubo a banho fervente
	Tubo a banho de gelo
	Tubo a banho 37ºC
	Concentração de glicose em mg/ml
	3,75
	3,24
	3,69
 
Dividindo os valores de concentração em mg/ml pela massa molar da glicose, obtemos a concentração em mmol/ml. Assim temos:
	Tubos
	Tubo a banho fervente
	Tubo a banho de gelo
	Tubo a banho 37ºC
	Concentração de glicose em mmol/ml
	0,021
	0,018
	0,020
Para encontrar a velocidade em µmol/min é necessário transformar agora essas concentrações para µmol/ml, e para isso basta multiplicar os valores por 103, já que 1mmol é equivalente a 1000 µmol. 
	Tubos
	Tubo a banho fervente
	Tubo a banho de gelo
	Tubo a banho 37ºC
	Concentração de glicose em µmol/ml
	21
	18
	20
Com isso, basta dividir os valores pelo tempo que se manteve sobre ação enzimática até a adição de DNS, ou seja, 15minutos.
	Tubos
	Tubo a banho fervente
	Tubo a banho de gelo
	Tubo a banho 37ºC
	Velocidade (µmol/min)
	1,4
	1,2
	1,3
Esboçando-se o gráfico para as temperaturas, temos o seguinte gráfico, da velocidade em função da temperatura:
Ao analisar o gráfico, percebesse que a temperatura ótima da enzima esta com uma estabilidade maior em temperaturas altas, tendo uma maior afinidade pelo substrato em temperaturas na faixa de 40 a 100ºC. Caso a enzima fosse submetida a temperaturas ainda mais elevadas, certamente seria desativada e sofreria desnaturação por calor, mudando sua conformação e consequentemente perdendo sua funcionalidade.
Aplicação tecnológica do ácido ascórbico:
Após algum tempo de exposição das duas metades da maçã, uma contendo ácido ascórbico e a outra não, percebeu-se que a maçã sem ácido ascórbico escureceu. Tal fato ocorre pela presença de uma enzima chamada Polifenoloxidase. Isso ocorre pois na presença de compostos fenólicos e de ar, essa enzima causa a oxidação dos compostos fenólicos gerando pigmentos escuros e insolúveis, caracterizando o escurecimento da maçã. 
Porém, quando adicionamos ácido ascórbico à maçã, esse ácido na presença de oxigênio e de um catalisador se oxida, gerando o ácido dehidroascórbico. O pH desse ácido gerado é abaixo de quatro, e assim ele desacelera a atividade enzimática da Polifenoloxidase, retardando o escurecimento da maçã.
Conclusão 
Com base nos procedimentos realizados, nos resultados obtidos e nas discussões feitas, é possível concluir que existem diferentes fatores que influenciam o bom funcionamento da enzima. Porém , quando aplicados devidamente, esses fatores podem acabar levando a enzima para seu melhor desempenho. Todavia, se usado indevidamente, esses fatores acabam que retardando a reação e atrapalhando no funcionamento ideal das enzimas.
Bibliografia
 ‘Ácido Ascórbico da Vitamina C como Agente Redutor’, disponível em <http://www.mundoeducacao.com/quimica/acido-ascorbico-vitamina-c-como-agente-redutor.htm>, acessado em 26/03/2015.
“Polyphenol Oxidase”, disponível em: <http://www.worthington-biochem.com/ty/default.html>, acessado em 26/03/2015.
“Polyphenol Oxidases in plants”, disponível em: < www.robertbarrington.net>, acessado em 26/03/2015