Aula PCR(1)

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

AULA TEÓRICA
PCR
	
Histórico:
	Técnica descrita pelo Dr. Kary Banks Mullis –– 1983.
	O artigo foi enviado para a maiores revistas científicas –– Nature e Science.
	1993 – Dr. Mullis recebe o premio Nobel de Química pela sua descoberta.
Definição:
	PCR (Polymerase Chain Reation) – Reação em Cadeia da Polimerase.
	É a síntese (amplificação) de moléculas de DNA in vitro.
	É um procedimento análogo à replicação do DNA.
	“Fotocopiadora” molecular.
Qual o princípio da PCR?
	Amplificação enzimática de uma sequência de DNA, explorando a sua capacidade de duplicação.
Uma fita simples é o molde para a síntese de novas cadeias complementares
Enzima DNA polimerase adiciona os nucleotídeos
Produção de milhões de cópias ao final da reação.
O que utilizamos na reação?
	Lembrando que o PCR é uma replicação in vitro, os reagentes e equipamentos utilizados devem “mimetizar” o ambiente celular.
Componentes da reação (o que vai no tubo?):
	- DNA molde;
	- Primers;
	- dNTP (A, T, G e C);
	- DNA polimerase;
	- Sais e co-fatores enzimáticos;
	- Tampão de reação.
Demais componentes (o que o equipamento fornece?):
	- Variações de temperatura (ciclos).
O que utilizamos na reação?
- DNA molde: como o próprio nome já diz, é o DNA que é utilizado como molde para a síntese. 
- Primers: são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade, ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.
	Utiliza-se um par de primers, um “forward” e um “reverse”
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’ A T C G A T C G G C T A C G A T --------------------------------------------------------------------------- G C T C T T A C G A C T G A T 5’
5’ T A G C T A G C C G A T G C T A 3’ 
PRIMER UP
 PRIMER DO
  3’ G C T A A T A C G C C T A A T 5’
5’ T A G C T A G C C G A T G C T A --------------------------------------------------------------------------- C G A T T A T G C G G A T T A 3’
O que utilizamos na reação?
- dNTP (A, T, G e C): desoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs), que são as bases nitrogenadas. 
- Taq DNA Polimerase: é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na 
amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR.
Esta polimerase foi isolada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus,
uma extremófila encontrada em fontes hidrotermais.
- Co-fatores, sais e tampão: necessários para a atuação da polimerase.
Ciclo da PCR no termociclador
	O termociclador é um equipamento que fornece etapas de temperatura. Cada ciclo da PCR possui as seguintes etapas:
Etapa 1 - Desnaturação as cadeias.
		- Consiste de um asso de desnaturação a 94ºC por 5 minutos. 
Etapa 2 - Anelamento dos Primers ou iniciadores.
		- Temperatura ótima para o anelamento dos primers, frequentemente próximo dos 40 – 50ºC.
Etapa 3 - Extensão: polimerização das novas cadeias complementares de DNA, pela ação da enzima Taq Polimerase.
		- Temperatura ótima para a atividade da Taq (72ºC).
 
A amplificação do DNA na PCR é exponencial
	Uma molécula inicial de DNA gera, após um ciclo, duas moléculas idênticas a inicial, que agora servem como moldes para o próximo ciclo....
Assim, após 36 ciclos, são geradas:
68 bilhões de moléculas cópias!!!!
Replicação (in vivo)
PCR (in vitro)
Vantagens:
	O segredo do sucesso da PCR reside na capacidade que ela tem de amplificar uma sequência precisa de DNA aliada à sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade. Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que se encontre misturado com DNA de outras espécies), uma vez que a especificidade da PCR é dada pelos primers. É uma técnica rápida, barata e segura. 
Desvantagens:
	Contudo, a PCR também tem limitações, como a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos. Outras desvantagens são a relativa facilidade com que ocorre contaminação da amostra por DNA estranho (uma vez que se trata de uma técnica muito sensível) e a limitada extensão da sequência que é possível amplificar (é difícil aplicar a PCR a sequências maiores do que 5kb). Pode também ocorrer incorporação errónea de bases durante a replicação.
Os resultados da PCR são úteis no diagnóstico, prognóstico, determinação da terapia a ser utilizada, e até mesmo na avaliação da susceptibilidade a doenças. A PCR é frequentemente utilizada na detecção de polimorfismos, mutações pontuais e infecção por microorganismos bacterianos ou virais antes da exteriorização patológica da sua presença. É particularmente importante na detecção da AIDS, pois consegue detectar o vírus HIV nas primeiras semanas após a infecção e mais rapidamente do que o método normalmente utilizado, o teste ELISA. A PCR procura directamente pelo DNA do vírus enquanto que o teste ELISA é mais indirecto, pois procura anticorpos que o organismo possa ter produzido contra o vírus.
Outro exemplo de aplicação da PCR é no DPI (diagnóstico pré-implantatório) e no DPN (diagnóstico pré-natal). A PCR pode ser usada em DPN em idades gestacionais tão precoces como as 9 semanas, permitindo, por exemplo, a detecção de células de um feto masculino em circulação no sangue materno, ainda que exista em quantidades muito reduzidas, e averiguar a compatibilidade entre o grupo sanguíneo da mãe e do feto. Permite ainda a detecção de várias anormalidades cromossómicas como a trissomia 21. Este exame ao diagnosticar previamente certas doenças, possibilita que os pais e equipa de saúde decidam antecipadamente a melhor atitude a tomar em relação a cada caso. 
Filmes como técnica didática
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ