34 - Diagnose

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Diagnose de doenças
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DIAGNOSE DE DOENÇAS
 Máxima eficiência nos intentos de controle exigem o um conhecimento prévio: 
		1. Diagnóstico correto da causa;				2. informações sobre a epidemiologia da doença; 	3. do ambiente na interação causa x efeitos;		
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Como diagnosticar a presença da enfermidade biótica
 A associação constante de um determinado fator 	com um determinado sintoma é a primeira 	evidência do seu envolvimento no processo doença
Considerações:
		1. Presença sintomas ou sinais;
2. sintomas sutis ou sem aparência ;
3. sintomas na forma de declínio de produção ( Ex. 			PVX; BYDV);	 (aspecto oculto evidencia-se 			comparando com plantas normais);			4. Causas múltiplas (agentes simultâneos ou 				sucessivos = diagnóstico complexo: separação 		das causas).
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Enfermidade = biótica ou abiótica ?
Importante:
Conhecer as características da cultivar;
Variações dentro da espécie.
Em condições naturais : plantas sadias é raro: 	assim “ sadia” é relativo e refere-se a outras 	danificadas.
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A diagnose doenças fúngicas: 
Sintomas (diagnose indireta) = sem a 	reprodução 			experimental da doença. A exatidão do 				diagnóstico demanda muita experiência.
Sinais (diagnose direta) = preparações microscópicas 			(raspagem e corte)					Ideal = uso simultâneo dos dois tipos de diagnose.
Algumas doenças = sintomas típicos: ex
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Foto: Nanismo amarelo da soja Heterodera glycines
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Alguns sintomas são característicos - ex.: pústulas, galhas, ... .
Figura Phakopsora pachyrhizi: pústulas a. fechadas; b. abertas ; 		c. esporulantes
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Figura : a . Agrobacterium rhizogenes. b. Colletotrichum graminicola
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Figura: Mildio sorgo Sclerospora sorghi
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Figura Escaldadura do arroz – Gerlachia oryzae
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Figura: Mancha angular do feijão Pheocercospora griseola (Isariopsis griseola)
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Figura: Antracnose feijão – Colletotrichum lindemuthianum
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sintomas leves: virus X - mosaico
 Infecções múltiplas  separá-las
  Muitos agentes podem induzir os mesmos sintomas
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Ambiente no processo doença
Ambiente: patógeno – hospedeiro e a interação 			entre ambos;
Ambiente: incidência e gravidade doenças abióticas 	em função da severidade e o tempo de 	exposição.
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Em primeira instância o diagnóstico de um mal se baseia nos 	sintomas e/ ou sinais da enfermidade.
Enfermidades não descritas ou desconhecidas: é necessário a 	reprodução experimental da mesma.
Folha feijão com sintomas de Phakopsora pachyrhizi
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Alguns fatores auxiliares úteis no diagnóstico 		
1. Doenças já assinaladas sobre aquele hospedeiro;
2. Distribuição da doença na área onde ocorre a 	enfermidade a ser diagnosticada;
3. Incidência e distribuição da doença: plantas 	hospedeiras, modo de distribuição das plantas doentes, 	dispersão, fonte de inóculo, modo de 	transmissão, 	fatores ambientais favoráveis, etc.
4. Sintomas da enfermidade; especialmente algum 	detalhe que possa auxiliar o diagnóstico;
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5. Características dos patógenos que possam ser 	úteis 	na identificação dos mesmos. (bibliografia 	especializada, índice de doenças, acesso a lugares e 	autoridades sobre taxonomia de patógenos CMI, 	Inglaterra; Cenargen, Brasília, etc.)
Visitas a campo podem facilitar o trabalho de 	diagnose: distribuição da doença no campo = 	pistas úteis com respeito a possíveis causas.
Distribuição ao azar no campo;				
Prevalece nos bordos ou existem de restrição na 			dispersão dentro das fileiras; 
A enfermidade encontra-se nas áreas baixas ou mal 			drenadas da lavoura;
Há sinal de dispersão localizada ao redor de um centro de infecção.
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Enfermidades abióticas ou fisiológicas
Ausência de patógeno e/ou transmissão a partir de 	planta doente = doença abiótica
Diagnóstico positivo= prover experimentalmente a 	doença, produzindo–a sob condições conhecidas ou 	eliminação da mesma quando se corrige a eficiência 	do elemento químico
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Doenças abióticas:
Suspeita de problemas de nutrição:
	✓Buscar provas adicionais: análise química de tecidos;
	✓Cuidar para que o diagnóstico se baseie em fatos e 	não em conjunturas;
	✓Muito diagnósticos são resultado de aplicar o 	procedimento “culpa por associação”= atribuição 	a um organismo qualquer que isolou do tecido 	doente.
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Doenças abióticas: distribuição mais uniforme na área
Figura: A fitoxidez indireta; B. raízes com sintomas de fitotoxidez e 	C. fitotoxidez direta de ferro.
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Doenças abióticas: distribuição mais uniforme na área
Figura; Sintomas de deficiência de manganês. Iguaçu MS 
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Doenças abióticas
Figura; Tomate com sintomas de podridão apical (def. de Ca)
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Figura; Caquizeiro com sintomas de fitotoxidade de glifosato
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Doenças bióticas
✓Alguns sintomas são característicos
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Doenças bióticas
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Doenças bióticas
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Doenças bióticas
	 sintomas drásticos: carvão,galhas
	
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Doenças bióticas
sintomas leves: VMDF, BYDV
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Doenças bióticas
 Infecções múltiplas= separá-las
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Doenças bióticas: Etapas principais:
Coleta de material: representativo (todas as fases 	da doença; quantidade; acondicionamento; 	transporte;
Anaminésia;
Consulta bibliográfica: doenças assinaladas no 	referido hospedeiro e a distribuição 	geográfica 	do patógeno: (literatura);
 fatores que afetam a doença: foco primário do 	dano e sintomatologia total
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Doenças bióticas: Etapas principais:
sintomas: microscópicos e histológicos: 	dessecação dos tecidos (lentes e microscópio 	estereoscópico (aumentos até 	100X) auxiliam 	na visualização e remoção de estruturas do 	patógeno. 
examinar a planta por inteiro: danos 	nas raízes 	manifestam-se nas partes superiores da planta;
 tecidos enfermos: observação cuidadosa em busca 	de sinais: preparações microscópicas: se for o 	caso; 
 guardar amostra em geladeira para eventuais novos 	exames.
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Enfermidades não descritas ou desconhecidas 	requerem a reprodução experimental das mesmas 	(Postulados de Koch ou provas de patogenicidade)
1. Observação da associação constante da doença e 	 determinado organismo;
2. Isolamento do organismo “in vitro”e respectiva 	identificação; 
3. Inoculação do organismo isolado no hospedeiro 	sadio, com a subseqüente reprodução dos sintomas
4. Re-isolamento “in vitro” do organismo e identificação do organismo anteriormente isolado e inoculado.
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ROTEIRO PARA DIAGNOSE DE ROTINA DE DOENÇAS CAUSADAS POR FUNGOS
Diagnóstico a campo é feito apenas para doenças com 	sintomas inconfundíveis e que os sinais a distingam de 	outras da planta hospedeira.
I. Exame de sinais/ sintomas macroscópicos
	utilização de lupas = visualização de sinais.
II. Exame microscópico dos tecidos afetados		antes de qualquer intento de cultivar ou isolar um 	possível agente biótico de enfermidade, 	proceder:
	
	
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Doenças fúngicas
Observação do material doente sob microscópio 			estereoscópico
- Fazer preparações microscópicas se merecer o 	caso,(sinais):(lâminas) de raspagem e de corte;
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Manchas foliares sem sinais → Indução da esporulação (câmara úmida e incubação), e posteriormente (lâminas) de raspagem e de corte.
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Preparações microscópicas de RASPAGEM: aplicações
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Preparações microscópicas de CORTE: aplicações
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Preparações microscópicas de CORTE: aplicações
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III. Isolamento em meio de cultura:				- meios:comuns (naturais/artificiais)			 	- seletivos						- plantas iscas;
Figura: Fluxograma do procedimento de isolamento pela técnica de plantio de tecidos
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 DIAGNOSE DE DOENÇAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS
Exame de sintomas causados na planta hospedeira:	(Consulte bibliografia)
Alguns sintomas: folhas com halo encharcado, 		tubérculos com pús bacteriano, murcha, cancros e 	galhas.
*II. Exame do fluxo bacteriano
	a) total ausência de fluxo bacteriano em qualquer 			tipo de lesão: não é doença bacteriana 	
	b) presença de fluxo bacteriano em água: doença 			bacteriana
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Bacterioses
III. Isolamento em meio de cultura. Etapas:
	a) escolha da melhor lesão para o isolamento;		b) lavagem e desinfestação superficial dos tecidos;	c) extração das células bacterianas dos tecidos;	d) diluição em série (estrias) do extrato 				bacteriano sobre o meio de cultura em 			placas de Petri (Kado 523, YDC, usualmente);		c) incubar a 25 - 28 C0 durante 2 a 4 dias.
	Bactérias fastidiosas exigem meios de culturas 			mais elaborados e maior período de 				incubação.
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Bacterioses
IV. Obtenção de cultura pura
	examinar as colônias que se desenvolveram 	isoladamente sem se misturar; repicar 	àquelas com as características culturais 	indicadas para a espécie (para placa ou tubo de 	ensaio com meio inclinado). 
	prováveis fitopatogênicas em culturas puras e 	testar a patogenicidade.
	 materiais muito contaminados recomenda-se o 	emprego de iscas e/ou meios seletivos
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Bacterioses
V Teste de fitopatogenicidade
	a) reação rápida de hipersensibilidade em folhas, 			café, pimentão, 	etc.
	
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b) podridão mole em batata, pimentão ou no 				material susceptível;
c) inoculação em folha ou fruto destacado (de 				planta hospedeira susceptível);
d) inoculação em planta susceptível (escolher o 			método que faculte obter o resultado em 			menor tempo)
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Bacterioses
VI. Proceder os testes de identificação ao nível de gênero e espécie.
	morfologia da colônia;
	testes bioquímicos;
	serológicos;
	patogenicidade;
	testes moleculares.
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Diagnose de doenças causadas por Vírus
I. Exame de sintomas causados na planta hospedeira;
Figuras: sintomas de VMDF e VMCF 
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II. Exame de inclusões celulares;
III. Inoculação em plantas indicadoras:
 	inoculação mecânica;
	vetores;
	enxertia;
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Viroses: indexação
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Viroses
ToMV em tomate e ToMV em fumo
IV. Observação e confrontação dos sintomas nas 	plantas 	indicadoras (Consulta bibliográfica).
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Viroses
V. Sorologia
	Elisa;
	difusão em ágar;
	precipitação em latex sensibilizado;
	imunofluorescência;
	DIBA, etc.
VI. Testes moleculares
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ANTÍGENO = qualquer substância capaz de induzir uma resposta de imunidade quando injetado em um animal de sangue quente
IMUNOGÊNICOS = substâncias capazes de induzir 	uma resposta imunogênica:					não pode ser comum ao animal						peso molecular elevado 104						estrutura molecular definida
ANTICORPO = proteínas pertencentes ao grupo das 	imunoglobulinas produzidas nos linfócitos e que se aderem especificamente aos antígenos homólogos
SOROLOGIA - terminologia básica
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PRODUÇÃO DE ANTISSORO POLICLONAL
Escolha do animal					- 	Coelho, fácil manejo, sangria 30 – 50 mL sangue	Ratos, 	camundongos
Imunização							 impírica 							  dosagem do antígeno 10 mg				  adjuvante de Freud							incompleto óleo mineral + emulsificante (9:1)		completo + Mycobacterium tuberculosis (morta)		  rotas 	de injeção: subcutânea, intramuscular, etc.		  injeção de reforço
 Sangria e estocagem do antisoro					 veia marginal da orelha				 repouso ambiental por algumas horas			 4º C por 4 – 6 horas					 retira-se o coágulo					 10.000 rpm/10 min					 armazenar a (- 20º C) amostras de 1 ml			 		
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Dupla difusão (Ouchterlony)
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Latex sensibilizado
Diagrama da aglutinação em latex: 					 1- Reação entre latex sensibilizado com anticorpo e antígeno na amostra	 2 - Latex sensibilizado com antígeno e anticorpo na amostra
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Elisa (enzyme linked immunosorbent assay)
Fig.1 Cobertura das cavidades com antígeno e bloqueio dos espaços livres com tampão
Fig.2 Adição de antissoro, os anticorpos unem-se aos antígenos específicos. Os anticorpos que não reconhecem seu antígeno ficam
Fig 3 .Anticorpos não específicos não 	se unem e são lavados
Fig 4 Adição de um anticorpo secundário marcado com enzima Ex. fostatase alcalina ou peroxidase , une-se ao anticorpo ligado ao antígeno
Fig. 6 O enzima corta o substrato e produz reação de cor na solução do mesmo
Fig 5 Anticorpos marcados não ligados são eliminados na lavagem. Adição do substrato ex. 	 d nitrofenilfosfato
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Elisa tipo sanduiche (1) cavidade coberta com anticorpo de captura; (2) adição da amostra e união de qualquer antígeno com anticorpo; (3) adição de anticorpo específico e ligamento ao antígeno; (4) adição de anticorpo secundário com enzima que liga-se ao anticorpo específico; (5) adição de substrato e reação de cor
Elisa Enzyme linked assay)
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. PCR (Reação de Polimerase em Cadeia)
Processo de replicação de múltiplas 	cópias de 	DNA in vitro a partir 	do conhecimento prévio de uma 	seqüência alvo 	nucleotídeos 	(A;C;G;T)
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Aplicaçoes da PCR
Técnica extremamente sensível (capaz de detectar 	uma única mol de DNA em uma amostra)
Ferramenta – revolução na biologia 	molecular
Ampla aplicabilidade em diversas áreas científicas:	detecção de baixos níveis de infecção;		  detecção de doenças genéticas;			detecção de organismos: latentes, de 			crescimento lento ou não cultiváveis.
			
	
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2.2 Etapas da Reação de 	Polimerase em 	cadeia (PCR)
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2.3 Natureza exponencial do PCR
Visualização da amplificação do DNA dá-se em géis submetido a eletroforese
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Componentes básicos para a reação: solução tampão (Tris HCl pH 8.8 	20 mM ; Mg Cl2 (1 – 4 mM); dNTPs (100 µM); Taq (1 u); 	primers com 20 – 25 pb (100 ng); DNA molde e água
2. 4 detalhes das principais etapas da PCR
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DNA dupla fita
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DESNATURAÇÃO (94 - 960C): ruptura das pontes de H 				ocasionando abertura da dupla fita 				(separação das fitas)
2. 4 detalhes das principais etapas da PCR
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2. 4 detalhes das principais etapas da PCR
ANELAMENTO (350C – 650C) = pareamento dos primers (encaixe 	ou 	polimerização) dos iniciadores nas seqüências 	complementares vicinais à região alvo de amplificação 
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2. 4 detalhes das principais etapas da PCR
EXTENSÃO: (720 C) a enzima Taq Polimerase posiciona-se 	nos 			inicadores (primers) e inicia a duplicação 				da fita 	recrutando os nucleotídeos.
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Extensão: recrutamento de nucleotídeos complementares à 	 fita molde realizado pela DNA Polimerase
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Desnaturação
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Anelamento
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anelamento
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Extensão 720 C
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PCR (Reação de Polimerase em Cadeia - visão geral 
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Método analítico de separação de biomoléculas em géis com 	campo elétrico em função da: 							carga elétrica da molécula					  peso molecular						  estrutura tridimencional
Principais géis 								gel de poliacrilamida 
	gel de agarose (0,5 – 3,0%)
Agarose em solução aguosa fria forma gel (pontes de H e cadeias 	polissacarídicas de agarobiose
Tamanho dos poros varia com a concentração; ex 1% 			separa 	fragmentos com diferença de 80 pb			
2.5 Eletroforese
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DNA = carga elétrica negativa = migração no gel em direção ao 		polo positivo até atingir o ponto 	isoelétrico
 	
Procedimento
	1- Preparar uma solução 0,8% de agarose em TAE (diluído 			50x); 						2- Aquecer até a total dissolução da agarose;
	3- Verter numa placa, formando uma camada de 1cm; adicionar 			o pente;
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4 – levar o gel à cuba cobrir com tampão TAE 50X;	
5- aplicar as amostras (4 -10 µL + 2 µL bromofenol = frente de corrida);
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6 – Submeter o gel a corrente elétrica até o corante de corrida 	atingir o fronte do gel;
7 -Corar o gel com brometo etídio sol 5µg m L-1 durante 45 min;
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7 -Corar o gel com brometo etídio 					sol 5µg m L-1 durante 45 min;
8- Fotodocumentar
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RT PCR
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PCR mulplex
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DIAGNOSEDE DOENÇAS CAUSADAS POR NEMATÓIDES
I. Exame de sintomas causados na planta hospedeira 	(Consulta bibliográfica). 
Presença de galhas (extrair algumas fêmeas e fazer 	cortes perineais);
II. Extração de nematóides de diferentes partes 	das plantas e da rizosfera 
	ex.: podridão (amarela na base do bulbo) 			Dytilenchus dipsaci;
	muitas vezes os nematóides atuam como vetores 	e/ou abrem ferimentos a outros patógenos.
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Método do Funil de Bearmann para extração de nematóides de solo ou de tecido vegetal (caules, raízes etc...) 
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A técnica do peneiramento mais funil de Baermann também é simples e prática e elimina o solo, já que antes é feito o peneiramento.
Técnica do peneiramento mais funil de Baermann
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Método da flutuação centrífuga em solução de sacarose (JENKINS, 1964)
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PROBLEMAS NUTRICIONAIS
Podem ocorrer por excesso ou carência;
I. Exame de sintomas (provisoriamente)
II. Análise de tecidos/solo
III. Eliminação e/ou exposição ao fator
As doenças abióticas ou fisiológicas geralmente não se transmitem aos descendentes (plantas).
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