35 - Isolamento de fungos

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ISOLAMENTO DE FUNGOS
1. GENERALIDADES:
Fungos fitopatogênicos raramente ocorrem isolados na natureza, em seu habitat natural, obrigando-nos quando queremos estudar um organismo isoladamente, algumas, vezes até mesmo para identificá-lo, recorrer a técnicas especiais para isolá-lo de outros organismos contaminantes.
Antes de isolar um organismo, particularmente em se tratando de material vegetal doente, os tecidos devem ser examinados para ver se há presença de frutificações, ou micélio no órgão vegetal lesionado, pois nem sempre é necessário e aconselhável cultivar parasitas facultativos em colônias puras com o intuito de identificá-los. Se estes apresentarem frutificações é aconselhável identificá-lo em seu habitat natural, visto que muitos fungos, diante de substrato rico em nutrientes, podem levar muito tempo para produzir estruturas que possibilitem indentificá-los. Em ascomycota poderá ocorrer a produção de micélio estéril ou da fase conidial em vez da ascógena, razão pela qual é recomendável aguardar o amadurecimento ou desenvolvimento das frutificações no substrato natural, devendo o órgão doente ou parte dele ser mantido em condições similares às naturais favoráveis ao desenvolvimento do(s) patógeno(s).
Para alcançar êxito em uma investigação que se realiza para determinar a relação existente entre um microrganismo ou agente e uma planta enferma, devem cumprir-se os clássicos postulados de Koch que permitem conhecer a verdadeira etiologia de uma doença, e que estabelecem o seguinte:
1. O organismo ou agente fitopatogênico deve estar associado em todos os casos com a doença e, recíprocamente, esta não deve manifestar-se sem que o referido microrganismo esteja presente.
 2. O microrganismo ou agente fitopatogênico associado aos sintomas deve ser isolado da planta doente, em cultura pura, num meio natural ou artificial, para que se possa estudar suas características específicas.
3. Quando a planta hospedeira sadia e da mesma espécie, daquela que apresentou os sintomas iniciais da doença, for inoculada, em condições favoráveis, deverá reproduzir os sintomas característicos da doença, anteriormente observados.
4. O microrganismo ou agente fitopatogênico deve ser reisolado, das plantas inoculadas artificialmente, em cultivo puro e identificado com o isolado primitivo.	
2. CONCEITO:
Denomina-se isolamento a operação de transferência do patógeno da fonte de infecção, na natureza, a outro meio natural ou artificial que permita estuda-lo na sua forma pura.	
A transferência dos microrganismos de um meio de cultura, para outro meio igual ou diferente, é designada em fitopatologia por repicagem. E tem por finalidade multiplicar o número de colônias, obter culturas puras, preservar a vitalidade das colônias, estudar o comportamento do microrganismo em diferentes meios de cultura, etc.
3. MÉTODOS E/OU TÉCNICAS GERAIS PARA ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS FITOPATOGÊNICOS:
Uma planta doente possui microflora composta do parasita primário (agente causal da doença) e de organismos saprofíticos. Para isolar o agente patogênico, em cultura pura, é necessário separa-lo da microflora saprofítica, através de técnicas que favoreçam seu desenvolvimento, em detrimento do crescimento dos outros. Existem diversos métodos com tal propósito, os quais variam segundo a natureza do agente patogênico bem como dos tecidos vegetais afetados.
Em todos os métodos faz-se necessário conservar a maior assepsia, possível para evitar contaminações externas que possam ocasionar o fracasso das investigações. Deste modo, flambar alças e agulhas de platina, placas de Petri, tubos de ensaio, bisturis, pinças, etc., com ou sem álcool é imprescindível; a mesa de trabalho, a câmara de fluxo laminar e o microscópio também devem ser desinfestado, preferencialmente com álcool a 70 %		
a) Escolha dos tecidos infectados; o isolamento deve ser feito de tecidos apresentando os sintomas característicos da doença. Pequenos fragmentos de tecido da região limítrofe entre a área lesionada e a área sadia devem ser retirados da planta doente, pois é nestas áreas que o patógeno se encontra em franca atividade. Áreas necróticas, no centro das lesões, normalmente contém alta população de saprófitas e devem ser evitadas.
b) Desinfestação superficial dos tecidos; de um modo geral, é realizada molhando-se os tecidos em álcool 50 – 70% por 2 minutos seguido de tratamento com hipoclorito de sódio (1 a 2%) de princípio ativo, durante 1 a 5 minutos. Quando os tecidos são volumosos, espessos ou suculentos (raízes grossas,folhas e frutos carnosos, troncos, etc.) e o patógeno atinge camadas profundas, a superfície dos tecidos pode ser desinfestada molhando-a em álcool e flambando ou aumentando a concentração do desinfestante, o tempo de exposição, ou ambos. Se, por outro lado, os tecidos são delicados e as estruturas do patógeno pouco profundas há o risco de matá-lo com a desinfestação, sendo preferível lavar demoradamente a superfície dos tecidos com água destilada, esterilizada e então remover a epiderme e cultivar os tecidos subjacentes, contendo o patógeno.
MÉTODOS DE ISOLAMENTO
1. PLANTAÇÃO DIRETA DOS TECIDOS: consiste em remover, com auxílio de pinça ou bisturi, para o meio de cultura, pobre em nutrientes (em geral agar-água), pequenos fragmentos dos tecidos infectados, após desinfestada a sua superfície. Nessa situação apenas o organismo presente em maior concentração no tecido vegetal deve crescer, com nutrientes fornecidos pelo próprio hospedeiro. Após 24 – 48 horas de incubação, pontas de hifas ou colônias bacterianas presentes neste meio devem, também sob condições assépticas, serem transferidas para um meio rico em nutrientes (repicadas). Em meio nutritivo adequado e sob condições de incubação (temperatura e luz) favoráveis, o microrganismo isolado deve crescer considerávelmente.
A plantação direta dos tecidos, em geral, se faz quando não existem frutificações (esporos) do organismo a isolar. 
2. DILUIÇÃO EM PLACAS DE PETRI: é a técnica mais generalizada, aplicando-se mais particularmente as suspensões de esporos de fungos e de bactérias fitopatogênicas.
A diluição poderá ser feita diretamente dentro das placas de Petri procedendo-se da seguinte forma:
a) EXISTINDO FRUTIFICAÇÕES DO FUNGO, a diluição poderá ser feita removendo, com auxílio de uma agulha histológica flambada, alguns esporos para o interior de uma placa de Petri esterilizada, e derramando, em seguida, sobre eles, cerca de 20 cc. do meio de cultura fundido a temperatura de 45°C. Antes da solidificação do meio, agitá-lo bem, a fim de espalhar os esporos.
Quando os esporos forem formados dentro de corpos frutíferos fechados (peritécios, picnídios, etc.) deve-se remover, com auxilio de agulha histológica, uma das frutificações e dilacerá-las em algumas gotas d’agua destilada esterilizada, colocadas sobre uma lâmina flambada, procedendo-se após, da forma descrita anteriormente, transferindo-se uma gota da suspensão de esporos para o interior da placa de Petri. A diluição de esporos, também poderá ser feita em três placas de Petri. Para isto, colocar no interior de cada uma das placas, 1 cc. de água destilada esterilizada. Levar com uma agulha histológica flambada, alguns esporos para o interior de uma das placas de Petri e misturá-los bem com a água. Com uma alça de platina (5 mm de diâmetro) esterilizada, levar uma gota desta suspensão de esporos para a segunda placa e, misturá-las bem com a gota d’agua existente nesta. Proceder, igualmente, levando uma gota da segunda para a terceira placa de Petri. Derramar em cada uma das placas, cerca de 10 cc. De meio de cultura fundido, à temperatura de 45°C, e agitar bem antes de solidificar.
b) NÃO EXISTINDO FRUTIFICAÇÕES DO FUNGO: poder-se-á tentar obtê-los antes do isolamento, colocando em câmara úmida o material desinfestado superficialmente. Ou, então fazer a diluição removendo um pequeno fragmento das margens do tecido infectado, dilacerá-lo num pouco de água destilada esterilizadae proceder conforme descrito anteriormente, substituindo a suspensão de esporos pela suspensão de tecidos dilacerados.
A diluição em três placas de Petri para garantia da formação de colônias distintas, das quais serão feitas as repicagens e, com maiores possibilidades de serem obtidas culturas puras.
Depois do meio de cultura solidificado, as placas de Petri devem ser invertidas, afim de evitar que a água da condensação goteje sobre as colônias espalhando e misturando-as, dificultando o isolamento.
3. ISOLAMENTO INDIRETO: é utilizado quando se tem o material muito contaminado por organismos secundários e seja difícil a sua desinfestação superficial, ou quando se pretenda fazer uma separação preliminar do patógeno, antes de isolá-lo. Para isto, inocula-se, com a mistura de patógeno e os organismos secundários, um suscetível sobre o qual o microrganismo a isolar se desenvolvendo mais rapidamente que os demais tornará mais fácil o seu isolamento. Assim, por exemplo, facilita-se o isolamento de Phytophthora infestans, de folhas de batatinha, inoculando ou colocando a folha infectada entre dois pedaços de tubérculo de batata desinfestados e isolando destes o fungo.
4. ISOLAMENTO DIRETO: é uma prática útil no caso em que o patógeno apresenta frutificações (conídios, picnídios, peritécios, apotécios, acérvulos, etc) ou quando não as apresenta mas é possível obtê-las, deixando os órgãos infectados em câmara úmida durante 1 a 2 dias. Os órgãos com as lesões contendo as estruturas são observados sob microscópio e, com auxílio de uma agulha, estilete ou microbisturí devidamente flambados, esfriados e umedecidos no meio de cultura que iremos utilizar, recolhemos algumas estruturas (frutificações) e as transportamos para os tubos de ensaio ou placas de Petri com o meio.
5. ISOLAMENTO DE FUNGOS DO SOLO: a técnica geral consiste em fazer uma suspensão, agitando em água destilada esterilizada (100 cc.) uma porção (1 g.) do solo em exame, seguindo-se, depois o processo de diluição em placas de Petri (já descrito). Para inibir o desenvolvimento de bactérias usar meio de cultura acidificado com ácido lático na proporção de 0,5 % do volume do meio ou antibióticos (aureomicina, sulfato de estreptomicina ou cloromicetina na proporção de 25 mg/l.)
6. ISOLAMENTO ATRAVÉS DE ISCAS: utilizado para organismos difíceis de isolar e microrganismos do solo que não se consegue separar com o método da diluição em placas de Petri. Uma variedade de microrganismos podem ser isolados do solo e da água através do uso de um substrato preferencial. O organismo desejado é capaz de se desenvolver na “isca” pela exclusão dos outros organismos, permitindo então o isolamento por métodos comuns. Agrobacterium e Thielaviopsis basicola são isolados do solo pelo uso de discos de cenoura. A inserção de material doente ou solo dentro de maça é usado para isolar algumas espécies de Phytophthora. Frutos de limão são usados para isolar a(s) espécie(s) de Phytophthora, que causa(m) doença(s) em citrus.
Outros materiais tais como hastes, folhas e raízes esterilizados, frutos, grãos de pólem, sementes de cânhamo, asas de insetos, “casca” de cobra, etc., também podem ser utilizados como “iscas”.
O plantio de plantas suscetíveis em solos infestados é frequentemente considerado uma forma de isca.
7. ISOLAMENTO DE FUNGOS E BCTÉRIAS DAS SEMENTES: diversas são as maneiras de disseminação dos patógenos por sementes. Os elementos de propagação dos fitopatógenos são veiculados misturados com, sobre ou no interior das sementes exigindo desta forma diferentes técnicas para o seu isolamento.
a) Quando os elementos de disseminação das doenças estão misturados as sementes ou sobre elas, faz-se uma suspensão agitando as sementes em água destilada esterilizada, e, em seguida, proceder o isolamento por diluição em placas de Petri.
b) Quando o patógeno tá alojado no interior de sementes, faz-se a desinfestação, colocando-as a seguir em câmara úmida para provocar a formação de esporos e/ou corpos frutíferos, fazendo-se então o isolamento. Pos a desinfestação colocá, diretamente no meio de cultura sobre o qual o patógeno se desenvolverá.
Para fazer o isolamento de fungos e bactérias de sementes contidas em frutos infectados, basta transferi-los, assépticamente e diretamente do interior deles para o meio de cultura.
A desinfestação de sementes pode ser feita mergulhando-as em hipoclorito de sódio.
8. ISOLAMENTO MONOSPÓRICO: Para diversos trabalhos fitopatológicos é necessário trabalhar com culturas (colônias) provenientes de um só esporo. Para atingir este objetivo uma das técnicas é a recomendada por KEITT com modificações de EZEQUIEL e LAMBERT que consiste em se preparar uma suspensão de esporos em água destilada esterilizada e “semeá-la” em estrias com auxílio de uma espátula esterilizada, na superfície do meio de ágar-água distribuído préviamente em placa de Petri.
Posteriormente com a lente de menor aumento do microscópio (desinfestado com álcool 70%), se localizam os esporos que tenham ficado mais separados e se marca na parte inferior da placa. Após com o microcortador de KEITT se extrai um pequeno disco de meio, sobre o qual se encontra o esporo, transferindo-o para um tubo de ensaio contendo meio de cultura onde irá crescer.
9. ISOLAMENTO ATRAVÉS DA INOCULAÇÃO NO HOSPEDEIRO: é utilizado quando se trata de parasitas biotróficos (obrigados) e, para alguns casos não corriqueiros. Quando o material doente está muito contaminado ou quando o organismo é difícil de isolar através dos métodos comuns. A inoculação direta no hospedeiro elimina os microrganismos não parasitas “purificando” o patógeno, permitindo seu posterior isolamento pelos métodos anteriormente impraticáveis.