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Matéria de Microbiologia Fotografias colorizadas de bactérias observadas ao microscópio eletrônico. Da esquerda para a direita: Bacillus anthracis, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae 2008 Introdução à Microbiologia Introdução Microbiologia: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (= ciência) A Microbiologia era definida, até recentemente, como a área da ciência que dedica-se ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso grupo de organismos unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser encontrados como células isoladas ou agrupados em diferentes arranjos (cadeias ou massas), sendo que as células, mesmo estando associadas, exibiriam um caráter fisiológico independente. Assim, com base neste conceito, a microbiologia envolve o estudo de organismos procariotos (bactérias, archaeas), eucariotos inferiores (algas, protozoários, fungos) e também os vírus. Bactérias Archaea Fungos Vírus Algas Protozoários Tipos de microrganismos estudados pelos microbiologistas. (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, 8 ed) Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram as primeiras observações de bactérias e outros microrganismos, além de diversos espécimes biológicos. Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenha fornecido importantes informações sobre a morfologia bacteriana, estes dois pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta ciência. Recentemente foi publicado um artigo discutindo a importância de Robert Hooke para o desenvolvimento da Microbiologia. Esquema do microscópio construído por Robert Hooke e um esquema de um fungo observado por este pesquisador. (Adaptado de Tortora et al., Microbiology - 8 ed) Réplica do microscópio construído por Leeuwenhoek e de suas ilustrações, descrevendo os "animálculos" observados. (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003) Classificação dos seres vivos De acordo com a definição tradicional da microbiologia, esta é uma ciência que até recentemente, era responsável pelo estudo de organismos classificados em três reinos distintos: Monera, Protista e Fungi. No entanto, a partir dos estudos de Carl Woese, a microbiologia passou a estar relacionada a três domínios de seres vivos. Sistemas de classificação dos seres vivos: Linnaeus (séc. XVIII): reinos Animal e Vegetal Haeckel (1866): introdução do reino Protista Whittaker (1969): 5 reinos, dividos principalmente pelas características morfólogicas e fisiológicas: Monera: Procariotos Protista: Eucariotos unicelulares - Protozoários (sem parede celular) e Algas (com parede celular) Fungi: Eucariotos aclorofilados Plantae: Vegetais Animalia: Animais Classificação dos seres vivos, de acordo com Whittaker (1969) (Adaptado de Pommerville, J.C.(2004) Alcamo's Fundamentals of Microbiology) No entanto, a partir dos estudos de C. Woese (1977), passamos a dispor de um sistema de classificação baseado principalmente em aspectos evolutivos (filogenética), a partir da comparação das sequências de rRNA de diferentes organismos. Com esta nova proposta de classificação, os organismos são agora subdividos em 3 domínios (contendo os 5 reinos), empregando-se dados associados ao caráter evolutivo. Archaea: Procariotos Bacteria: Procariotos Eukarya: Eucariotos Classificação dos seres vivos, de acordo com Woese (1977) (Adaptado de Pommerville, J.C.(2004) Alcamo's Fundamentals of Microbiology) A princípio, acredita-se que estes 3 domínios divergiram a partir de um ancestral comum. Provavelmente os microrganismos eucarióticos atuaram como ancestrais dos organismos multicelulares, enquanto as bactérias e archaeas correspondem a ramos que não evoluíram além do estágio microbiano. Archaea: são organismos procariotos que, freqüentemente são encontrados em ambientes cujas condições são bastante extremas (semelhantes às condições ambientais primordiais na Terra), sendo por isso, muitas vezes considerados como sendo “ancestrais” das bactérias. No entanto, hoje em dia considera-se as archaeas como um grupo “intermediário” entre procariotos e eucariotos. Muitos destes organismos são anaeróbios, vivendo em locais "inabitáveis" para os padrões humanos - fontes termais (com temperaturas acima de 100°C), águas com elevadíssimos teores de sal (até 5M de NaCl - limite de dissolução do NaCl), em solos e águas extremamente ácidos ou alcalinos (espécies que vivem em pH 0, outras em pH 10) e muitas são metanogênicas. Genericamente, podemos dizer que as Archaeas definem os limites da tolerância biológica às condições ambientais. Bacteria: Corresponde a um enorme grupo de procariotos, anteriormente classificados como eubactérias, representadas pelos organismos patogênicos ao homem, e bactérias encontradas nas águas, solos, ambientes em geral. Dentre estas, temos as bactérias fotossintetizantes (cianobactérias) e outras quimiossintetizantes (E. coli), enquanto outras utilizam apenas substratos inorgânicos para seu desenvolvimento. Eukarya: No âmbito microbiológico, compreende as algas, protozoários e fungos (além das plantas e animais). As algas caracterizam-se por apresentarem clorofila (além de outros pigmentos), sendo encontradas basicamente nos solos e águas. Os protozoários correspondem a células eucarióticas, apigmentados, geralmente móveis e sem parede celular, nutrindo-se por ingestão e podendo ser saprófitas ou parasitas. Os fungos são também células sem clorofila, apresentando parede celular, realizando metabolismo heterotrófico, nutrindo-se por absorção. Como mencionado anteriormente, os vírus são também assunto abordado em microbiologia, embora, formalmente, não exibam as características celulares, no sentido de não apresentarem metabolismo próprio, de conterem apenas um tipo de ácido nucléico, etc. A Microbiologia na atualidade A definição clássica de "microbiologia" mostra-se bastante imprecisa, e até mesmo inadequada, frente aos dados da literatura publicados nesta última década. Como exemplo pode-se citar duas premissas que já não podem mais ser consideradas como verdade absoluta na conceituação desta área de conhecimento: as dimensões dos microrganismos e a natureza independente destes seres. Em 1985 foi descoberto um organismo, denominado Epulopiscium fischelsoni que, a partir de 1991, foi definido como sendo o maior procarioto já descrito, exibindo cerca de 500 µm de comprimento. Esta bactéria foi isolada do intestino de um peixe marinho (Surgeonfish, peixe barbeiro ou cirurgião), encontrado nas águas da Austrália e do Mar Vermelho. Além de apresentar dimensões nunca vistas, tal bactéria mostra-se totalmente diferente das demais quanto ao processo de divisão celular, que ao invés de ser por fissão binária, envolve um provável tipo de reprodução vivíparo, levando à formação de pequenos “glóbulos”, que correspondem às células filhas. Comparação entre o tamanho de uma célula de Epulopiscium e 4 paramécios (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003) Mais recentemente, em 1999, outrorelato descreve o isolamento de uma bactéria ainda maior, isolada na costa da Namíbia. Esta, denominada Thiomargarita namibiensis, pode ser visualizada a olho nú, atingindo até cerca de 0,8 mm de comprimento e 0,1 a 0,3 mm de largura. Microscopia de luz polarizada, revelando os grânulos de enxôfre no interior da bactéria Thiomargarita namibiensis. Comparação entre a bactéria Thiomargarita namibiensis e uma Drosophila. (Adaptado de Schulz, H. N. et al. (1999). Science, 284:493-495 - Clique no autor, caso deseje ler o artigo original) Como analisar a questão do tamanho dos microrganismos? Durante muito tempo se acreditava que o tamanho das bactérias era imposto pelo seu próprio metabolismo, ou seja, se a bactéria aumentasse muito em tamanho, ela seria incapaz de se manter viável e morreria. Tal fato decorre da seguinte dedução: A área superficial da membrana citoplasmática seria o fator limitante para a eficiência das trocas com o meio externo. Sabendo-se que a área de uma esfera é calculada pela fórmula e que o volume de uma esfera é obtido pela fórmula , a medida que a área aumenta, seu volume aumenta muito mais rapidamente. Assim, se uma bactéria começasse a crescer, aumentando sua área, a proporção área/volume diminuiria. Isto faria com que a célula passasse a apresentar um volume muito grande, sendo que sua área superficial seria insuficiente, em termos de trocas através da membrana, para manter sua viabilidade. A partir dos isolados de bactérias “gigantes”, o conceito da limitação de tamanho bacteriano vem sendo abandonado, pois não há mais como questionar a existência e viabilidade destas bactérias e, possivelmente, novos relatos serão incorporados, deixando de ser meras curiosidades. Uma das explicações mais prováveis para tal fato reside na existência de grandes mesossomos nestes tipos bacterianos, refutando assim a hipótese de que tais estruturas seriam meros artefatos de microscopia. Novos estudos vêm sendo realizados, os quais estão trazendo informações sobre outras estratégias desenvolvidas pelos microrganismos para que sobrevivam, quando apresentam dimensões extremamente maiores que os microrganismos "convencionais". Microrganismos atuando como seres multicelulares Outro aspecto que vem sendo demonstrado refere-se ao caráter “multicelular” das bactérias. Embora estas exibam a capacidade de sobreviver como uma célula única, realizando os processos metabólicos necessários à sua perpetuação, quando as bactérias encontram-se associadas, formando colônias, ou biofilmes (estruturas rígidas, adesivas, de natureza geralmente polissacarídica, que encontram-se fortemente ancoradas às superfícies, criando um ambiente protegido que possibilita o crescimento microbiano), estas passam a se comportar de forma social, exibindo divisão de tarefas e alterando seu perfil fisiológico de forma a apresentar uma cooperação que reflete-se em diferentes níveis metabólicos. Sabe-se que muitos genes de virulência são expressos somente quando a densidade populacional atinge um determinado ponto. Da mesma forma, a capacidade de captar DNA do meio externo, a bioluminescência, etc, envolvem a percepção da densidade populacional por parte das bactérias. Este tipo de mecanismo de comunicação é denominado “sensor de quorum” (quorum sensing) e vem sendo amplamente estudado nas mais diferentes áreas da Microbiologia, uma vez que foi descrito tanto para bactérias como para fungos. Estudos com bactérias primitivas Ainda em relação às novas pesquisas desenvolvidas na área de Microbiologia, temos o cultivo de bactérias pré-históricas, visando a busca de compostos com atividade antimicrobiana ou de interesse comercial. Neste sentido, empresas foram criadas (“Ambergene”), especializadas na reativação de formas bacterianas latentes, isoladas de insetos preservados em âmbar. Os resultados obtidos revelam a reativação de mais de 1200 espécies bacterianas, apresentando de 2 a até 135 milhões de anos. Em 2000, foi publicado um relato descrevendo o isolamento e cultivo de uma espécie bacteriana a partir do líquido contido em um cristal de sal de 250 milhões de anos. Os estudos de seqüenciamento do DNA que codifica o RNA ribossomal 16S indicam que o organismo pertence ao gênero Bacillus, uma bactéria em forma de bastonete, Gram positiva, com a capacidade de formar endósporos. Até o momento, esta corresponde à espécie bacteriana mais antiga. Inseto de onde foi retirada a bactéria (provavelmente Bacillus), de 135 milhões de anos Aspecto das colônias crescidas em meio sólido (Adaptado de Cano et al., (1995) Science, 268:1060-1064) A questão da vida em marte Em 1997, foram publicados relatos de expedições da NASA a Marte, sugerindo a presença de possíveis microrganismos (“nanobactérias”) em espécimes minerais, sendo que achados semelhantes foram também detectados em partículas de meteoritos de Marte, que atingiram a Terra. A favor desta hipótese há o achado de microrganismos que decompõem minerais, frequentemente isolados das profundezas marinhas (A cerca de 1,5 km abaixo do solo). Os meteoritos apresentam carbono, fósforo, nitrogênio, além da presença de água. Já em relação às condições ambientais de Marte (muito frio), temos como contra-argumento o isolamento de Archaea a partir de ambientes absolutamente inóspitos, inicialmente comsiderados como inadequados à vida. De acordo com alguns pesquisadores, não é absurdo considerar que a vida surgiu em Marte, pois estudos com o meteorito Nakhla, que caiu em 1911 no Egito, com aparentemente de 1,3 bilhões de anos, revelam a presença de elementos cocóides, potenciais fósseis bacterianos, variando de 0,25 a 2,0 µm de tamanho, o que seria correspondente ao tamanho médio atual das bactérias. Curiosamente, estas formas ovais apresentam um teor maior de carbono no seu interior que nas áreas ao seu redor. Além disso, exibem também um elevado teor de óxido de ferro, um composto comum em células fossilizadas. Recentemente, a NASA enviou outra sonda para Marte e os dados recebidos reforçam cada vez mais a idéia da existência anterior de vida em Marte, devido aos achados da possível ocorrência de água naquele planeta. Comparação entre possíveis "microrganismos" presentes em rochas de Marte e microrganismos que compõem a placa dental ho homem. (Adaptado de An Electronic Companion to Beginning Microbiology) Assim, com base nestes novos achados e principalmente com estudos envolvendo as Archaea, a microbiologia vem levantando uma série de questões quanto à fisiologia e o metabolismo celular, além de questionar permanentemente os limites das condições de vida. Ubiqüidade dos microrganismos Os microrganismos são os menores seres vivos existentes, encontrando-se em uma vasta diversidade de ambientes e desempenhando importantes papéis na natureza. Este grupo caracteriza-se por ser completamente heterogêneo, tendo com única característica comum o pequeno tamanho dos organismos. Acredita-se que cerca de metade da biomassa do planeta seja constituída pelos microrganismos, sendo os 50% restantes distribuídos entre plantas (35%) e animais (15%). Em termos de habitat, os microrganismos são encontrados em quase todos os ambientes, tanto na superfície, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos isolar microrganismos de fontes termais, com temperaturas atingindo até 130°C (clique aqui para ler o relato do isolamento de um procarioto cujo máximo de temperatura de crescimento foi definido como130°C); de regiões polares, com temperaturas inferiores a -10°C; de ambientes extremamente ácidos (pH=1) ou básicos (pH=13). Alguns sobrevivem em ambientes extremamente pobres em nutrientes, assemelhando-se à água destilada. Há ainda aqueles encontrados no interior de rochas na Antártida. Em termos metabólicos, temos também os mais variados tipos, desde aqueles com vias metabólicas semelhantes a de eucariotos superiores, até outros que são capazes de produzir ácido sulfúrico, ou aqueles capazes de degradar compostos pouco usuais como cânfora, herbicidas, petróleo, etc. Uma vez que os microrganismos precederam o homem em bilhões de anos, pode-se dizer que nós evoluímos em seu mundo e eles em nosso. Desta forma, não é de se estranhar que a associação homem-microrganismo mostra-se com grande complexidade, com os microrganismos habitando nosso organismo, em locais tais como a pele, intestinos, cavidade oral, nariz, ouvidos e trato genitourinário. Embora a grande maioria destes microrganismos não causem qualquer dano, compondo a denominada “microbiota normal”, algumas vezes estes podem originar uma série de doenças, com maior ou menor gravidade. Nesta classe de organismos estão aqueles denominados patogênicos e potencialmente patogênicos. Sabe-se que em cerca de 1013 células de um ser humano podem ser encontradas, em média, cerca de 1014 células bacterianas. No homem, estas se encontram em várias superfícies, especialmente na cavidade oral e trato intestinal. Principais funções dos microrganismos na natureza Além de seu importante papel como componentes da microbiota residente de animais e plantas, em nosso dia a dia convivemos com os mais diversos produtos microbiológicos “naturais” tais como: vinho, cerveja, queijo, picles, vinagre, antibióticos, pães, etc. Paralelamente, não pode ser deixada de lado a importância dos processos biotecnológicos, envolvendo engenharia genética, que permitem a “criação” de novos microrganismos, com as mais diversas capacidades metabólicas. Os microrganismos desempenham também um importante papel nos processos geoquímicos, tais como o ciclo do carbono e do nitrogênio, sendo genericamente importantes nos processos de decomposição de substratos e sua reciclagem. Dentre os compostos utilizados como substrato temos, alguns de grande importância atualmente: DDT, outros pesticidas, cânfora, etc. O carbono encontra-se na atmosfera primariamente como CO2, sendo utilizado pelos organismos fotossintetizantes, para sua nutrição. Virtualmente, a energia para o desenvolvimento da vida na Terra é derivada, em última análise, a partir da luz solar. Esta é captada pelas plantas e microrganismos fotossintetizantes (algas e bactérias), que convertem o CO2 em compostos orgânicos, através da reação: CO2 + H2O => (CH2O)n + O2 Os herbívoros alimentam-se de plantas e os carnívoros alimentam-se dos herbívoros. O CO2 atmosférico torna-se disponível para a utilização na fotossíntese origina-se de duas fontes biológicas principais: 1) 5 a 10% a partir de processos de respiração e 2) 90 a 95% oriundos da degradação (decomposição ou mineralização) microbiana de compostos orgânicos. Em termos de ciclo global, há um balanço entre o consumo de CO2 na fotossíntese e sua produção através da mineralização e respiração. Este balanço, no entanto, vem sendo fortemente alterado por atividades humanas, tais como a queima de combustíveis fósseis, promovendo um aumento da qualntidade de CO2 atmosférico, resultando no conhecido “efeito estufa”. A celulose existente nas plantas, embora seja um substrato extremamente abundante na Terra, não é utilizável pela vasta maioria dos animais. Por outro lado, vários microrganismos, incluindo fungos, bactérias e protozoários a utilizam, como fonte de carbono e energia. Destes microrganismos, muitos encontram-se no trato intestinal de vários herbívoros e nos cupins. Muitos compostos tóxicos podem ser degradados por microrganismos, dentre eles, policlorados, DDT, pesticidas. Outra abordagem que tem se mostrado de grande valia para o homem refere-se à introdução de genes bacterianos em outros organismos (ditos transgênicos), tais como plantas. Assim, está em franco desenvolvimento a obtenção de plantas transgênicas resistentes a pesticidas ou ao ataque de insetos. Microrganismos como agentes de doenças Os microrganismos, eventualmente provocam doenças no homem, outros animais e plantas. Apesar dos enormes avanços em relação ao tratamento de doenças infecciosas, estas vêm se tornando novamente um tema preocupante, em virtude do crescente surgimento de linhagens bacterianas cada vez mais resistentes às drogas. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde vem demonstrando crescente interesse nas doenças emergentes e re- emergentes, de origem infecciosa. Abaixo apresentamos um quadro cronológico que deixa clara tais preocupações, em relação ao número de mortes provocadas por doenças infecciosas. (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003) Importância da Microbiologia É uma área da Biologia que tem grande importância seja como ciência básica ou aplicada. Básica: estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares (modelo comparativo para seres superiores). => Microbiologia Molecular Aplicada: processos industriais, controle de doenças, de pragas, produção de alimentos, etc. Áreas de estudo: Odontologia: Estudo de microrganismos associados à placa dental, cárie dental e doenças periodontais. Estudos com abordagem preventiva. Medicina e Enfermagem: - Doenças infecciosas e infecções hospitalares. Nutrição: - Doenças transmitidas por alimentos, Controle de qualidade de alimentos, Produção de alimentos (queijos, bebidas). Biologia: - Aspectos básicos e biotecnológicos. Produção de antibióticos, hormônios (insulina, GH), enzimas (lipases, celulases), insumos (ácidos, álcool), Despoluição (Herbicidas - Pseudomonas, Petróleo), Bio-filme (Acinetobacter), etc. BIOTECNOLOGIA - Uso de microrganismos com finalidades industriais, como agentes de biodegradação, de limpeza ambiental, etc. Um breve histórico da importância da microbiologia Efeitos das doenças nas civilizações Talvez um dos aspectos mais negligenciados quando se estuda a microbiologia refere-se às profundas mudanças que ocorreram no curso das civilizações, decorrentes das doenças infecciosas. De forma geral, as doenças provocavam um abatimento físico e moral da população e das tropas, muitas vezes influenciando no desenrolar e no resultado de um conflito. A própria mobilização de tropas, resultando em uma aglomeração, muitas vezes longa, de soldados, em ambientes onde as condições de higiene e de alimentação eram geralmente inadequadas, também colaborava na disseminação de doenças infecciosas, para as quais nnao exisitam recursos terapêuticos. Paralelamente, em áreas urbanas em franca expansão, os problemas mencionados acima eram também de grande importância, pois rapidamente as cidades cresciam, sendo que as instalações sanitárias geralmente eram completamente precárias. Com a prática do comércio entre as diferentes nações emergentes, passou a haver a disseminação dos organismos para outras populações, muitas vezes susceptíveis a aqueles agentes infecciosos. Abaixo listaremos, brevemente, um pequeno histórico com alguns exemplos dos efeitos das doenças microbianas no desenvolvimento de diferentes civilizações. O declínio do Império Romano, com Justiniano (565 AC), foi acelerado por epidemias de peste bubônica e varíola. Muitos habitantes de Roma foram mortos, deixandoa cidade com menos poder para suportar os ataques dos bárbaros, que terminaram por destruir o Império. Durante a Idade Média varias novas epidemias se sucederam, sendo algumas amplamente disseminadas pelos diferentes continentes e outras mais localizadas. Dentre as principais moléstias pode-se citar: Tifo, varíola, sífilis, cólera e peste. Em 1346, a população da Europa, Norte da África e Oriente Médio era de cerca de 100 milhões de habitantes. Nesta época houve uma grande epidemia da peste, que disseminou-se através da “rota da seda” (a principal rota mercante para a China), provocando um grande número de mortes na Ásia e posteriormente espalhando-se pela Europa, onde resultou em um total de cerca de 25 milhões de pessoas, em poucos anos. Novas epidemias da peste ocorreram nos séculos XVI e XVII, sendo que no século XVIII (entre 1720 e 1722), uma última grande epidemia ocorreu na França, matando cerca de 60% da população de Marselha, de Toulon,. 44% em Arles, 30% em Aix e Avignon. A epidemia mais recente de peste originou-se na China, em 1892, disseminando-se pela Índia, atingindo Bombaim em 1896, sendo responsável pela morte de cerca de 6 milhões de indivíduos, somente na Índia. Antes da II Guerra Mundial, o resultado das guerras era definido pelas armas, estratégias e “pestilência”, sendo esta última decisiva. Em 1566, Maximiliano II da Alemanha reuniu um exército de 80.000 homens para enfrentar o Sultão Soliman da Hungria. Devido a uma epidemia de tifo, o exército alemão foi profundamente dizimado, sendo necessária a dispersão dos sobrevivente, impedindo assim a expulsão das hordes de tribos orientais da Europa nesta época. Na guerra dos 30 anos (1618-1648), onde protestantes se revoltaram contra a opressão dos católicos, além do desgaste decorrente da longa duração do confronto, as doenças foram determinantes no resultado final. Na época de Napoleão, em 1812, seu exército foi quase que completamente dizimado por tifo, disenteria e pneumonia, durante campanha de retirada de Moscou. No ano seguinte, Napolãeo havia recrutado um exército de 500.000 jovens soldados, que foram reduzidos a 170.000, sendo cerca de 105.000 mortes decorrentes das batalhas e 220.000 decorrentes de doenças infecciosas. Em 1892, outra epidemia de peste bubônica, na China e Índia, foi responsável pela morte de 6 milhões de pessoas. Até a década de 30, este era quadro, quando Alexander Fleming, incidentalmente, descobriu um composto produzido por um fungo do gênero Penicillium, que eliminava bactérias do gênero Staphylococcus, um organismo que pode produzir uma vasta gama de doenças no homem. este composto - denominado penicilina - teve um papel fundamental na desfecho da II Guerra Mundial, uma vez que passou a ser administrado às tropas aliadas, enquanto o exército alemão continuava a sofrer pesadas baixas no campo de batalha. Além destas epidemias, vale ressaltar a importância das diferentes epidemias de gripe que assolaram o mundo e que continuam a manifestar- se de forma bastante intensa até hoje. Temos ainda o problema mundial envolvendo a AIDS, o retorno da tuberculose (17 milhões de casos no Brasil) e do aumento progressivo dos níveis de resistência aos agentes antimicrobianos que vários grupos de bactérias vêm apresentando atualmente. Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 1) Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos As bactérias são extremamente variáveis quanto ao tamanho e formas que apresentam. Até recentemente acreditava-se que as menores bactérias apresentavam cerca de 0,3 µm (ex: Mycoplasma), entretanto, já existem relatos de células menores, denominadas nanobactérias ou ultramicrobactérias, com tamanhos variando de 0,2 a 0,05 µm de diâmetro, sendo algumas inclusive já cultivadas em laboratório. Há ainda controvérsias quanto a este grupo, pois vários autores acreditam ser meros artefatos. Muitas bactérias medem de 2 a 6 µm de comprimento, por 1 a 2 µm de largura, mas certamente estes valores não podem ser definidos como absolutos, pois eventualmente encontramos bactérias de até 500 ou 800 µm, como no caso de Epulopiscium ou Thiomargarita. Em relação às formas, a maioria das bactérias estudadas seguem um padrão menos variável, embora existam vários tipos morfológicos distintos. De maneira geral, as bactérias podem ser agrupadas em três tipos morfológicos gerais: cocos, bacilos e espiralados. Os cocos correspondem a células arredondadas, podem se dividir sem um plano de orientação definido, o que leva a um grande número de arranjos diferentes. Assim temos os cocos isolados, diplococos (Neisseria, pneumococos), tetracocos, sarcinas (cubos contendo 8 células), estreptococos (cocos em cadeia) e estafilococos (cocos formando massas irregulares). Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos formando cadeias, um arranjo denominado estreptococos. Microscopia eletrônica de varredura das células apresentadas acima. Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em um arranjo denominado estafilococos. Microscopia eletrônica de varredura das células apresentadas acima. Os bacilos têm forma de bastonetes, podendo apresentar extremidades retas (Bacillus anthracis), arredondadas (Salmonella, E. coli), ou ainda afiladas (Fusobacterium). Como seu plano de divisão é fixo, ocorrendo sempre no menor eixo, os bacilos exibem uma menor variedade de arranjos, sendo via de regra encontrados isolados, como diplobacilos ou ainda como estreptobacilos. Há ainda um arranjo, denominado “em paliçada”, também denominado letras chinesas, que é típico do gênero Corynebacterium. Tal tipo de arranjo ocorre porque a parede celular desses organismos é dupla e no momento da divisão celular ocorre a ruptura de apenas uma das camadas, deixando as células unidas pela camada de parede que não se rompeu. Os bacilos podem ainda apresentar-se como pequenas vírgulas (Vibrio cholerae) ou em forma de meia lua (Selenomonas). Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de bacilos arranjados dois a dois (diplobacilos). Microscopia eletrônica de transmissão, de um bacilo em processo de divisão celular. Espiralados: Sua nomenclatura é bastante controvertida ainda. Um tipo de classificação divide os espiralados em dois grupos, osespiroquetas, que apresentam uma forma de espiral flexível, possuindo flagelos periplasmáticos. O outro grupo são os espirilos, que exibem geralmente morfologia de espiral incompleta e rígidos. Geralmente os espiralados são microrganismos bastante afilados, de difícil observação por microscopia de campo claro, sendo muitas vezes analisados por meio da microscopia de campo escuro, ou de técnicas de coloração empregando a impregnação por sais de prata. Microscopia óptica de fluorescência, de um organismo espiralado. Microscopia óptica, utilizando um procedimento de impreganção com sais de prata, revelando a bactéria causadora da sífilis, Treponema pallidum (observe os grandes neutrófilos próximos às bactérias) Micrografias eletrônicas colorizadas de diferentes bactérias. No sentido horário: Enterococcus (cocos ovalados), Francisella (bacilos pequenos, com a região central abaulada), Fusobacterium (longos bacilos, geralmente com extremidades mais afiladas) e Neisseria gonorrhoeae (diplococos em forma de rins). (Fotos obtidas de sites da internet) Há ainda formas intermediárias comoos cocobacilos; formas pleomórficas (quando o microrganismo não tem uma morfologia padrão), tal como Mycoplasma; ou ainda formas de involução, originadas quando o meio encontra-se desfavorável ao desenvolvimento. Nesses casos, como o organismo deixa de realizar os processos metabólicos (nutrição e divisão celular) adequadamente, este sofre alterações morfológicas. Há também bactérias apresentando apêndices, tais como extensões celulares na forma de longos tubos ou hastes (prostecas) (Rhodomicrobium vannielii). Além destas bactérias, estudos vêm revelando a ocorrência de bactérias com formas bastante peculiares, tais como células estreladas ou retangulares. bactéria com morfologia retangular bactéria com morfologia semelhante a uma estrela (Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998) Bactéria pedunculada (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Ultraestrutra Bacteriana A ultraestrutura bacteriana começou a ser estudada em maiores detalhes nas décadas de 50 e 60, a partir do melhoramento das técnicas de microscopia eletrônica. Os procedimentos adotados incluíam a lise celular, seguida de centrifugação para promover a separação dos vários componentes subcelulares, que podiam agora ser purificados e analisados bioquimicamente. Parede Celular - Estrutura presente na maioria das bactérias conhecidas, exceto em micoplasmas e algumas Archaea, que não a possuem. Corresponde a uma das estruturas mais importantes nas células bacterianas, estando localizada na porção mais externa, acima da membrana citoplasmática. Devido à sua grande rigidez, a parede celular é responsável pela manutenção da forma do microrganismo. Como o ambiente intracelular é bastante concentrado em relação ao meio externo, (variando de 2 a até 10 atm), a parede atua como uma barreira física rígida, que mantém a forma celular, impedindo que a célula estoure em decorrência do grande turgor. Além disso, a parede celular atua como uma barreira de proteção contra determinados agentes físicos e químicos externos, tais como o choque osmótico. A parede pode ainda desempenhar importante papel em microrganismos patogênicos, em decorrência de presença de componentes que favorecem sua patogenicidade, tais como antígenos ou moléculas envolvidas no reconhecimento celular. Em 1884, Christian Gram desenvolveu um método de coloração de bactérias que permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram positivas (que coravam-se em roxo) e as Gram negativas (que coravam-se em vermelho). A partir do advento da microscopia eletrônica e do aperfeiçoamento das técnicas de análise bioquímica dos diferentes componentes celulares, foi verificado que esta diferença entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente, devida às diferenças de composição e estrutura das paredes celulares. Assim, quando observadas sob microscopia eletrônica de transmissão, as bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80 nm), de aspecto homogêneo, enquanto as células Gram negativas exibem uma parede mais delgada (de 9 a 20 nm) e de aspecto bastante complexo, aparentemente apresentando mais de uma camada. A microscopia eletrônica de varredura revelou outras diferenças entre estes dois grupos de organismos. As Gram positivas exibiam a superfície mais lisa e homogênea, enquanto as Gram negativas apresentavam-se com maior complexidade superficial. Aspecto das paredes celulares de organismos Gram positivos e negativos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Composição da parede celular Peptideoglicano (mureína ou mucopeptídeo): Composto exclusivamente encontrado no domínio Bacteria, sendo o responsável pela rigidez da parede celular. O peptideoglicano corresponde a um enorme polímero complexo que, em bactérias Gram positivas pode formar até 20 camadas, enquanto em células Gram negativas está presente, formando apenas uma ou duas camadas. O peptideoglicano corresponde a um esqueleto, formado por dois derivados de açúcares, a N-acetilglicosamina (NAG) e o ácido N- acetilmurâmico (NAM), unidos alternadamente, através de ligações do tipo ß-1,4. O grupo carboxil de cada molécula de NAM liga-se a um tetrapeptídeo, composto por aminoácidos que alternam-se nas configurações L e D. Destes aminoácidos, o D-glutamato, D-alanina e o ácido meso- diaminopimélico não são encontrados em qualquer outra proteína conhecida. Acredita-se que sua presença confira maior resistência da parede contra a maioria das peptidases. Assim, em cada resíduo de NAM há um tetrapeptídeo associado. A enorme rigidez da da parede celular é resultante das ligações entre os tetrapeptídeos de cadeias adjacentes. Neste aspecto, há uma grande diferença entre as bactérias Gram positivas e negativas. Nas bactérias Gram negativas (Ala- Glu-DAP-Ala), a ligação entre os tetrapepídeos é direta, ocorrendo entre o grupamento amino do DAP subterminal (posição 3) e o grupamento carboxi da D-Ala terminal (posição 4). Já nas Gram positivas (Ala-Glu-Lys-Ala), a ligação é indireta, sendo mediada por uma ponte interpeptídica de natureza variável (cinco glicinas em S. aureus). A análise das figuras abaixo deixa clara a grande estruturação do peptídeoglicano, em virtude das inúmeras ligações cruzadas existentes ao longo da molécula. Assim, devido a esta complexa estruturação física, o peptideoglicano confere rigidez à parede, embora exiba certo grau de elasticidade e também porosidade. peptideoglicano de células Gram positivas peptideoglicano de células Gram negativas Nas bactérias Gram positivas, cerca de 90% da parede celular é composta pelo peptídeoglicano, que geralmente forma cerca de 20 camadas. O restante da parede é composto essencialmente por ácido teicóico. Nas bactérias Gram negativas, apenas cerca de 10% da parede corresponde ao peptideoglicano, existindo geralmente como uma camada única ou dupla. Os demais componentes da parede celular de bactérias Gram negativas serão analisados posteriormente. Esquema ilustrando o espesso peptideoglicano de bactérias Gram positivas (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Ácidos Teicóicos: Juntamente com peptideoglicano, os ácidos teicóicos compõem a parede celular das bactérias Gram positivas. Estes compostos, presentes em grandes quantidades, correspondem a polímeros de glicerol ou ribitol ligados a açúcares ou aminoácidos e conectados entre si por meio de grupamentos fosfato. Os ácidos teicóicos associam-se ao peptideoglicano pela ligação do grupamento 6 hidroxil do ácido N-acetilmurâmico, podendo alternativamente associar-se aos lipídeos da membrana citoplasmática, quando passam a ser denominados de ácidos lipoteicóicos. Devido à sua carga negativa, os ácidos teicóicos contribuem com o caráter negativo da superfície celular de Gram positivas. Seu papel fisiológico é ainda desconhecido, mas especula-se que estes possam participar nos processos de passagem de íons pela parede, ou ligar-se a prótons, mantendo um pH celular relativamente baixo. Em casos de escassez de fosfato, os ácidos teicóicos podem ser substituídos por ácidos teicurônicos, deixando assim os fosfatos livres para comporem ATP ou DNA, por exemplo. Fórmula de um ácido teicóico, contendo ribitol (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) O componente adicional da Parede Celular de Gram negativos Membrana Externa: Esta, embora denominada "membrana"externa é um componente da parede celular, presente apenas nas bactériasGram negativas. A membrana externa corresponde a uma segunda bicamada lipídica (semelhante à membrana plasmática), localizada acima do peptideoglicano, contendo fosfolipídeos, lipoproteínas, proteínas e também lipopolissacarídeos. Quando comparada à membrana citoplasmática, a membrana externa exibe maior permeabilidade a pequenas moléculas, tais como glicose ou outros monossacarídeos. Sua face interna geralmente é rica em pequenas lipoproteínas (7,2 kDa), denominadas lipoproteínas de Braun, que ligam-se covalentemente ao peptideoglicano, ancorando firmemente a membrana externa à camada de peptideoglicano. Estudos indicam que a membrana externa e a membrana citoplasmática mantém contato em algumas discretas regiões celulares, denominadas sítios de adesão. Acredita-se que estas regiões de junção podem conferir maior rigidez à parede celular das bactéria Gram negativas, além de fixar melhor a membrana externa, não deixando-a frouxa, associada somente ao peptideoglicano. Os sítio de adesão foram também denominados junções de Bayer e acredita-se que possam ser importantes locais de passagem de compostos citoplasmáticos, seja componentes envolvidos na síntese da membrana externa ou diferentes nutrientes. Esquema da parede celular de organismos Gram negativos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) A face externa da membrana externa é rica em lipopolissacarídeos (LPS), inexistentes na membrana citoplasmática. Estes componentes são também denominados de endotoxina, uma vez que provocam febre, choque e eventualmente morte, quando injetados em animais. O LPS é uma molécula complexa, composta por 3 regiões distintas: lipídeo A, polissacarídeo central e cadeia polissacarídica lateral O, ou Antígeno O. Esquema do lipopolissacarídeo, encontrado na face externa da membrana externa (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) O lipídeo A corresponde à porção mais interna da molécula, ancorando o LPS à porção hidrofóbica da membrana externa. Este componente corresponde à porção tóxica do LPS e geralmente é composto por ácido esteárico, palmítico, mirístico, láurico ou capróico. Estes ácidos graxos estão ligados a um dissacarídeo de NAcGlicosamina-P. A porção polissacarídica localiza-se acima do lipídeo A, em direção ao exterior, sendo composta por duas regiões, o polissacarídeo central e polissacarídeo O, que é mais externo, de natureza repetitiva. Em Salmonella, o cerne é composto por 10 açúcares pouco usuais. Conectado ao cerne, há o Ag O, que geralmente é composto por 3 a 5 açúcares bastante peculiares e variáveis. A natureza destes açúcares pode ser modificada pelos microrganismos, resultando em um mecanismo de evasão do sistema imune. O LPS também confere carga nagativa à superfície celular. O LPS se associa a proteínas, formando a face externa da unidade de membrana. A membrana externa apresenta um grupo especializado de proteínas, denominadas genericamente de porinas, que atuam como canais para a passagem de pequenas moléculas hidrofílicas, participando assim do processo de nutrição. As porinas podem ser específicas, contendo sítios de ligação para 1 ou mais substratos, ou inespecíficas, compondo canais aquosos. A maioria das porinas correspondem a proteínas transmembrânicas, com 3 subunidades idênticas, que formam orifícios de cerca de 1 nm, sendo que, aparentemente, possuem mecanismos para a abertura e fechamento. Para algumas substâncias, a membrana externa é mais restritiva. Compostos que afetam a Integridade da Parede Celular Ação da Lisozima na PC: Esta enzima, sintetizada por alguns organismos e por glândulas endócrinas do homem, age clivando as ligações do tipo β-1,4, presentes no peptideoglicano. Nas células Gram positivas, o tratamento com lisozima origina protoplastos (células sem parede celular), enquanto nas Gram negativas, a lisozima origina esferoplastos (células com resquícios de parede celular). Ação da penicilina na PC: Este antibiótico impede a ligação dos tetrapeptídeos. A droga se liga irreversivelmente às PBPs, que são proteínas envolvidas no processo de biossíntese do peptideoglicano. Paralelamente, as autolisinas, que atuam em conjunto com a maquinaria de biossíntese, passam a degradar porções do peptideoglicano. Como a síntese está bloqueada, o resultado líquido é a formação de uma parede defeituosa. A Camada S Algumas bactérias e várias Archaea apresentam uma camada de natureza protéica ou glicoprotéica estruturada (como um piso de tacos), denominada camada S. Esta camada, as bactérias, encontra-se acima da parede celular e até o momento, suas funções não se encontram totalmente esclarecidas. Acredita-se que esta camada proteja a célula contra flutuações osmóticas, de pH e íons, além de auxiliar na manutenção da rigidez da parede. Alguns autores especulam que a camada S pode mediar a ligação dos orgnaismos a superfícies. Microscopia eletrônica de uma célula contendo a camada S. (Adaptado de Prescott et al., 2002) Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 2) Cápsula, Glicocálix e camada limosa - A cápsula pode ser definida como uma camada externa à parede celular, geralmente apresentando-se como um material viscoso, fortemente associado à superfície celular, geralmente de natureza polissacarídica e raramente protéica. Por outro lado, o termo camada limosa é algumas vezes definido como uma uma zona difusa, contendo material pouco organizado, sendo facilmente removida. A presença da cápsula normalmente confere vantagens às bactérias, pois suas principais funções incluem: ligação às células do hospedeiro, fator de virulência por dificultar a fagocitose e também a proteção, seja aumentando a resistência ao dessecamento, uma vez que armazena grandes quantidades de água, fonte de nutrientes e proteção contra a infecção por bacteriófagos, ou interação com anticorpos. Em odontologia, a presença da cápsula pode ser considerada como um importante fator de virulência para o principal agente cariogênico - S. mutans, que sintetiza um cápsula composta por um homopolissacarídeo denominado glucano (produto da degradação da sacarose em glicose e frutose). Tal polímero adere-se firmemente à parede celular do microrganismo e permite sua aderência ao esmalte, favorecendo sua colonização. Outros microrganismos apresentam cápsula de natureza heteropolimérica - S. pneumoniae. Eventualmente, a cápsula pode ser de natureza polipeptídica, como em B. anthracis (ácido glutâmico, na forma D). Micrografia óptica, empregando a tácnica de coloração negativa, revelando células capsuladas. (Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998) Micrografia eletrônica de transmissão, revelando a delgada cápsula circudando a célula (Adaptado de "An eletctronic companion to microbiology") Fímbrias e Pili - Muitas bactérias Gram negativas apresentam apêndices finos (3 a 10 nm), retos e curtos, denominados fímbrias. Geralmente estas são bastante numerosas, podendo atingir números de 1000 ou mais por célula. Como são muito pequenas e delgadas, somente podem ser visualizadas pela microscopia eletrônica. As fímbrias s ão de natureza protéica, compostas por subunidades repetitivas de uma proteína denominada genericamente de pilina. As fímbrias possuem, geralmente em sua extremidade, e algumas vezes ao longo da estrutura, proteínas distintas, denominadas adesinas, as quais mediam a adesão específica da célula bacteriana a diferentes substratos. Micrografia eletrônica de varredura de bacilos apresentandofímbrias Esquema ilustrando a organização estrutural de uma fímbria, assinalando a presença de moléculas do tipo adesina, situadas na extremidade da estrutura (Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology) Muitas bactérias podem ainda apresentar outro tipo de apêndice, denominado pilus F ou fímbria sexual, o qual exibe semlhanças estruturais com as fímbrias. No entanto, este tipo de fímbra é normalmente encontrado em um menor número nas células, variando de 1 a 10. O pilus F corresponde a uma estrutura bastante longa e menos rígida que as fímbrias convencionais, estando envolvido no reconhecimento de outras bactérias, em um processo de transferência de genes denominado conjugação. Micrografia eletrônica colorizada, revelando a longa fímbria sexual (pilus F). Observar também a presença de fímbrias. Atualmente, diferentes tipos diferentes de fímbrias vêm sendo descritos, sendo vários destes associados à adesão, ou à virulência. Bactérias Gram positivas podem, muitas vezes, apresentar estruturas fibrilares (diferentes de fímbrias) em sua superfície, provavelmente também envolvidas nos processos de adesão a substratos. Flagelos - Estruturas longas, delgadas e relativamente rígidas, apresentando cerca de 20 nm de espessura e 15 a 20 µm de comprimento, responsáveis pela locomoção das bactérias. Devido à sua pequena espessura, os flagelos somente podem ser visualizados por meio de colorações específicas, microscopia de campo escuro, ou por icroscopia eletrônica. De acordo com o número e distribuição dos flagelos, as bactérias podem ser classificadas como: atríquias (sem flagelos), monotríquias (um único flagelo), anfitríquias (um flagelo em cada extremidade) , lofotríquias (um tufo de flagelos em uma, ou ambas as extremidades) e peritríquias (apresentando flagelos ao longo de todo o corpo bacteriano). Bactéria monotríquia (Adaptado de Atlas, 1997 - Principles of Microbiology) Bactéria anfitríquia (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology) Bactéria lofotríquia (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology) Bactéria lofotríquia (Adaptado de Atlas, 1997 - Principles of Microbiology) Bactéria peritríquia (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology) Bactéria peritríquia (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology) Estrutura - Estruturalmente, o flagelo pode ser subdivido em 3 regiões: filamento, corpo basal e gancho, sendo estas duas últimas importantes para a inserção e movimentão do filamento. O filamento dos flagelos apresenta estrutura helicoidal, com comprimento de onda constante para cada espécie. Este corresponde a um cilindro longo e oco, composto por unidades repetitivas de uma proteína denominada genericamente de flagelina, que pode variar de 30 a 60 kDa, dependendo do microrganismo. Sua extremidade distal é revestida por uma proteína seladora. Algumas bactérias apresentam bainhas de diferentes naturezas revestindo o filamento, tal como em Vibrio cholerae, ou Bdellovibrio. O gancho apresenta maior espessura que o filamento, sendo composto por diferentes subunidades protéicas. O corpo basal corresponde à porção mais complexa do flagelo, apresentando 4 anéis ligados a um bastão central em bactérias Gram negativas, enquanto em Gram positivas são observados apenas 2 anéis. Os anéis externos L e P associam-se ao LPS e peptidioglicano, respectivamente, enquanto os anéis S e M estão associados à membrana citoplasmática. Esquema da estrutura dos flagelos bacterianos, em células Gram negativas (à esquerda) e Gram positivas (à direita) (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000) Detalhe ampliado da estrutura de um flagelo de células Gram negativas (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Síntese flagelar - Muitos genes estão envolvidos na síntese do flagelo e na mobilidade celular. Em E. coli e Salmonella foram identificados mais de 40 genes (fla), que codificam proteínas estruturais, de exportação de componentes para o exterior e de regulação de muitos eventos bioquímicos envolvidos na síntese de novos flagelos. A síntese de flagelos é fortemente regulada, tanto por fatores metabólicos como por sinais emitidos durante a divisão celular. Acredita-se que as subunidades de flagelina sejam transportadas ao longo do filamento e se autoarranjam espontaneamente, quando atingem a ponta. Movimentação - A movimentação dos flagelos ocorre através de um mecanismo de rotação do filamento, em velocidades que podem atingir até 270 ou 1100 rps, o que permite uma locomoção de até 100 µm/segundo, correspondendo a 100 vezes o seu comprimento/minuto. Os flagelos atuariam de maneira análoga a propulsores de um barco, sendo o sentido da rotação importante para o tipo de movimentação resultante. Em muitas células monotríquias, a rotação no sentido anti-horário promove a movimentação para frente, enquanto a rotação no sentido horário faz com que a célula se locomova no sentido oposto. Em outras monotríquias, quando o flagelo gira no sentido horário promove a locomoção. Tipos de movimentação de células monotríquias (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) No caso de bactérias peritríquias, quando os flagelos giram no sentido anti- horário as células se movem para frente. Estes dobram seus ganchos e seus filamentos se agrupam, formando um feixe, que gira e propele a célula. Quando a rotação ocorre no sentido horário, os flagelos se separam e a bactéria passa a vibrar somente, até que os flagelos voltem a girar no sentido anti-horário, impulsionando novamente a célula para frente. Para que haja a movimentação, o bastão localizado entre o gancho e o anel M tem a capacidade de rodar livremente na membrana citoplasmática. Acredita-se que o anel S esteja fixo na parede celular, sem a possibilidade de rodar. Os anéis P e L sustentariam o bastão. Há evidências que o corpo basal atuaria como uma estrutura passiva que giraria no interior de um complexo proteíco inserido na membrana, semelhante a um rotor de um motor elétrico, que gira no centro de um anel de eletromagnetos (estator). A energia necessária para a rotação é provida pela força próton motiva. A dissipação do gradiente de prótons cria uma força que gira o flagelo no sentido anti-horário, impelindo o microrganismo. O rotor seria composto pelo bastão central, pelo anel M e por um anel C, ligado ao M através da membrana citoplasmática. Estes anéis são formados por várias proteínas, sendo a FliG bastante importante. No estator, temos as proteínas MotA e MotB, que formam um canal de prótons, sendo que MotB também ancora o complexo ao peptideoglicano. Esquema ilustrando a movimentação de bactérias peritríquias (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology) Flagelos periplasmáticos - Estes flagelos são encontrados apenas nos espiroquetas (sendo muitas vezes denominados de filamentos axiais). Como o prórpio nome indica, estes flagelos situam-se no periplasma, localizando- se abaixo da membrana externa destas bactérias. Os flagelos periplasmáticos originam-se a partir dos polos celulares, voltando-se em direção ao centro da célula, envolvendo a membrana citoplasmática do corpo bacteriano. Micrografia eletrônica colorizada, revelando os flagelos periplasmáticos (amarelo) (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology) Micrografia eletrônica revelando o flagelo periplasmático, situado abaixo da membrana externa (Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology) Movimentaçãopor meio de deslizamento Muitos procariotos são móveis, apesar de não possuírem flagelos. Estas bactérias são capazes de se movimentar sobre superfícies sólidas, por um processo denominado deslizamento. A motilidade por deslizamento é apresentada por vários membros de Bacteria, sendo, no entanto, estudada somente em alguns poucos grupos. O movimento deslizante é consideravelmente mais lento – 10 µm/seg para algumas bactérias, quando comparado às velocidades atingidas pelo movimento flagelar mas, da mesma forma, permite a locomoção das bactérias em seus habitats. Mecanismos da Motilidade Por Deslizamento Embora até o momento nenhum mecanismo de deslizamento tenha sido comprovado, existem alguns modelos definindo o processo, além de evidências sugerindo a existência de mais de um tipo de mecanismo. Em cianobactérias, à medida que as células deslizam, secretam um polissacarídeo limoso em sua superfície externa. Aparentemente, este polissacarídeo estabelece o contato entre a superfície celular e a superfície sólida, contra a qual a célula desliza. À medida que o polissacarídeo limoso excretado se adere à superfície, a célula é gradativamente puxada. Esta hipótese é sustentada pela observação de poros excretores de compostos limosos na superfície de várias cianobactérias filamentosas. Em Flavobacterium johnsoniae, provavelmente o mecanismo de deslizamento envolve a movimentação de proteínas na superfície celular. De acordo com este modelo, proteínas específicas de motilidade, ancoradas nas membranas citoplasmática e externa, parecem propelir a célula para frente por um mecanismo de cremalheira contínua. Ao que parece, o movimento das proteínas da membrana citoplasmática é promovido pela liberação de energia oriunda da força próton motiva que, de alguma maneira, transmite esta energia às proteínas da membrana externa, localizadas ao longo de uma “pista de corrida” na superfície celular. Acredita-se que o movimento das proteínas da pista de corrida contra uma superfície sólida, literalmente empurre a célula para frente. Assim como as outras formas de motilidade, o deslizamento apresenta grande relevância ecológica. Este movimento permite que a célula explore novos recursos, ou interaja com outras células, de maneira benéfica. Esquema proposto para a movimentação deslizante de Flavobacterium (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 3) Periplasma (gel periplasmático) - Corresponde a um espaço situado entre a membrana externa e membrana citoplasmática, encontrado em células Gram negativas. Embora questionáveis, relatos esporádicos descrevem a existência de um espaço observado entre o peptideoglicano e a membrana citoplasmática de organismos Gram positivos. O periplasma apresenta consistência de gel, provavelmente devido ao grande número de proteínas presentes nesta região. Em virtude disto, este "espaço" passou a ser denominado gel periplasmático. O periplasma pode atingir de 1 a cerca de 70 nm de espessura, correspondendo a até 40% do volume total da célula. Em Gram negativas, tem grande importância, pois várias enzimas e outras proteínas estão localizadas, incluindo hidrolases, proteínas de ligação envolvidas no transporte e quimiorreceptores. Bactérias quimiolitotróficas e denitrifcantes apresentam muitas vezes proteínas transportadoras de elétrons no periplasma, outras apresentam enzimas envolvidas na síntese de peptideoglicano. A presença do periplasma bactérias Gram positivas é ainda motivo de controvérsias, devido ao enorme potencial secretor que este grupo apresenta. Membrana Citoplasmática - Estrutura delgada, com cerca de 8 nm, composta por uma bicamada fosfolipídica (podendo apresentar 7 tipos de fosfolipídeos diferentes), entremeada de proteínas (cerca de 200 tipos distintos), atuando como importante barreira osmótica, altamente seletiva. Normalmente, as membranas de organismos procariotos apresentam maiores concentrações de proteínas que as membranas eucarióticas, tendo em vista a ausência de organelas citoplasmáticas nas bactérias. A bicamada fosfolipídica é composta por glicerol ligado a duas cadeias de ácidos graxos, através de ligações do tipo éster, com proteínas entremeadas. Tanto as proteínas como os fosfolipídeos podem mover-se lateralmente ao longo da membrana. Esta é estabilizada principalmente por interações hidrofóbicas e por pontes de H. Paralelamente, os íons Ca+2 e Mg+2 também participam, interagindo ionicamente com as cargas negativas dos fosfolipídeos. Via de regra, os fosfolipídeos bacterianos contém ácidos graxos com cadeias não ramificadas de 16 a 18 átomos de carbono. Esta composição pode ser variável, de acordo com as condições ambientais. Assim, quando cultivadas em temperaturas baixas, há um aumento da proporção de ácidos graxos insaturados, aumentando consequentemente a fluidez da membrana. Por outro lado, aumetando o grau de saturação, as cadeias tornam-se mais rígidas, pois as moléculas têm maior capacidade de associação. Esquema da membrana citoplasmática bacteriana (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Via de regra, exceto no caso dos micoplasma (bactérias desprovidas de parede celular), micoplasmas, as membranas procarióticas não apresentam esteróis, como observado em eucariotos. Entretanto, muitas bactérias apresentam moléculas pentacíclicas, semelhantes a esteróis, denominadas hopanóides, talvez conferindo maior rigidez à membrana. A presença de esteróis na membrana citplasmática de micoplasmas pode ser justificada pela ausência da parece celular, neste grupo de organismos. Similaridade estrutural entre os esteróis (a), colesterol (b) e hopanóides (c) (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Mesossomos - correpondem a extensas invaginações da membrana citoplasmática, em forma de vesículas, lamelas ou túbulos. Geralmente são encontrados com maior abundância em Gram positivos, mas também presentes em Gram negativos. Até hoje, sua existência e funções são ainda debatidas pelos pesquisadores. Diversas funções têm sido atribuídas aos mesossomos, tais como a participação na segregação dos cromossomos durante a divisão, papel respiratório, papel na esporulação, ou até mesmo como sendo um mero artefato decorrente dos procedimentos utilizados para a preparação microscópica dos espécimes. A partir do acahado de extensos mesossomos em bactérias de grandes dimensões, acredita-se que sua principal função seja de aumentar a superfície da membrana, aumentando assim o conteúdo enzimático das células. Matriz Citoplasmática - É composta por cerca de 70% de água, além dos demais compostos celulares, tais como o DNA, inclusões e plasmídeos. Caracteristicamente, o citoplasma celular apresenta um grande concentração de ribossomos e proteínas, tais como proteínas atuando como um sistema de citoesqueleto. Nucleóide e plasmídeos- Os procariotos são organismoshaplóides, geralmente apresentando apenas 1 único cromossomo não envolto por carioteca. Eventualmente, algumas bactérias podem apresentar 2 ou 3 cromossomos. O cromossomo bacteriano é normalmente cirucular e encontra-se bastante enovelado, em uma região celular denominada nucleóide. Em bactérias, o cromossomo não apresenta-se associado a histonas, sendo estabilizado por outras proteínas de natureza básica. Geralmente o DNA cromossomal corresponde a uma molécula bastante grande, podendo ser 1000 vezes maior que a própria célula. Em E. coli, o DNA possui cerca de 4,7 Mb, exibindo aproximadamente 1 mm de comprimento, quando linearizado. (Adaptado de An ElectronicCompanion to Microbiology) Várias bactérias apresentam também moléculas de DNA extracromossomal, denominadas plasmídeos, as quais são geralmente circulares, contendo muitas vezes genes que conferem características adaptativas vantajosas ao microrganismo. Seu número e dimensões são bastante variáveis. Corpúsculos de inclusão - São grânulos de armazenagem, de diferentes naturezas, sendo geralmente utilizados como fonte de material de reserva ou energia, muitas vezes insolúveis. Estes podem apresentar-se sem qualquer envoltório ou envoltos por uma única camada lipídica delgada (diferente de uma membrana), ou por proteínas. Dentre os compostos orgânicos armazenados temos o glicogênio, o amido e poliidroxibutirato. Já dentre os inorgânicos temos polifosfatos (volutina ou metacromáticos) e enxofre. Grânulos de poliidroxibutirato (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Os magnetossomos são partículas intracelulares de magnetita (Fe3O4), que originam um dipolo magnético na célula, que pode responder aos campos geomagnéticos. Estes foram descritos em algumas bactérias aquáticas e algas. Outras bactérias aquáticas apresentam vesículas de gás, que conferem mobilidade nas diferentes camadas de água. São estruturas em forma de fuso, ocas, compostas por proteínas, tendo tamanhos variáveis (30 - 300 nm de diâmetro e até 1000 nm de comprimento). Consistem de um orifício oco envolto por uma membrana (armação) protéica extremamente delgada (2 nm). Nesta membrana encontram-se por 2 tipos de proteínas que originam uma estrutura rígida, impermeável à agua e permeável a gases. A proteína predominante tem cerca de 7.5 kDa, contendo Å 50% de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (Ala, Val, Leu, Ile), provavelmente voltados para o interior da partícula, evitando a entrada de água. Células apresentando magnetossomos em seu interior (corpúsculos negros enfileirados) (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000) Preparação de magnetossomos (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000) Bactérias se movendo em direção a um campo magnético (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000) Esquema de uma vesícula de ar, indicando como as proteínas que a formam se associam (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Domínio Archaea Considerações Gerais Por volta da década de 70, vários organismos procarióticos foram isolados a partir de uma série de ambientes considerados extremamente inóspitos, quase que incompatíveis com a presença de seres vivos. Estes ambientes naturais caracterizavam-se por apresentar temperaturas bastante elevadas (próximas a 100ºC), extrema acidez (pH próximo a 2), altas salinidades (cerca de 10 a 15%) e, muitas vezes, ausência completa de oxigênio. Como várias destas características correspondiam às possíveis condições encontradas na Terra primitiva, os pesquisadores acreditavam que os organismos procarióticos presentes nestes ambientes deveriam corresponder a células primitivas, talvez "fósseis vivos", representando as formas de vida ancestrais das bactérias modernas. Por esta razão, estes organismos foram denominados "arqueobactérias". No entanto, a partir dos trabalhos de Carl Woese e colaboradores (há cerca de 25 anos), realizando estudos comparativos de sequências de DNA que codificavam rRNA (16S e 23S) de diferentes organismos, foram definidos 3 grandes domínios compreendendo todos os seres vivos. Assim, de acordo com a proposta de Woese, os seres vivos poderiam ser agrupados em três grandes domínios: Bacteria (anteriormente denominadas eubactérias), Archaea (as "arqueobactérias") e Eucarya (Eucariotos). Estes três domínios teriam derivado de um hipotético ancestral comum de todas as células. A análise da árvore filogenética apresentada abaixo, revela como a denominação "arqueobactérias" é inadequada e quão obsoleta é a idéia de que as "arqueobactérias" seriam os ancestrais das bactérias atuais, pois estes organismos não correspondem aos ancestrais da bactérias atualmente conhecidas. Árvore filogenética universal, apresentando os três domínios da vida (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms) Esta árvore revela claramente que as "arqueobactérias" não correspondem aos ancestrais das bactérias atuais, visto que sua possível origem ocorre quase que concomitantemente à origem das bactérias mais primitivas. Outro aspecto que a árvore permite deduzir é o fato das "arqueobactérias" ocuparem uma posição intermediária entre os domínios Bacteria e Eucarya, sugerindo que estas correspondem a um grupo de organismos diferentes de bactérias e de células eucarióticas. De fato, estudos genéticos e fisiológicos posteriormente revelaram que tais organismos apresentam características de bactérias, de eucariotos, além de características exclusivas, não encontradas em qualquer outro domínio. Por esta razão, deixaram de ser denominadas "arqueobactérias", recebendo a denominação archaea. Uma questão ainda não elucidada refere-se ao porquê de encontrar-se um grande variedade de archaea extremófilas, habitanto ambientes de altas temperaturas, salinidade, ou extremos de pH. Por outro lado, o acúmulo de conhecimentos sobre este grupo vem mostrando que as archaea podem ser encontradas nos mais diversos ecossistemas, desde ambientes aquáticos frios, sistema digestório do homem e outros animais, em tecidos vegetais. Certamente não é absurdo cogitar que no futuro sejam descobertas archaea patogênicas ao homem ou outros seres vivos. As características apresentadas por alguns dos membros deste domínio parecem refletir as condições primitivas da Terra, quando tal domínio começou a evoluir como um ramo filogenéticio distinto. Ao que parece, várias archaea conservaram mais do que as eubactérias estas características fisiológicas primitivas, o que seria responsável pela distribuição atual no planeta. Assim, as archaea compreendem um grupo heterogêneo de microrganismos que podem ser caracterizados, em sua maioria, como habitantes de ambientes inóspitos, geralmente crescendo em condições consideradas até então como extremas e limítrofes para a vida. Classificação das Archaea Atualmente, considera-se que este domínio apresente três filos: Crenarchaeota, Euryarchaeota e Korarchaeota. Árvore filogenética do domínio Archaea (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms) O filo Crenarchaeota, separa-se muito próximo da raiz da árvore universal, sendo composto por organismos hipertermófilos (Thermoproteus, Pyrolobus e Pyrodictium), compreendendo os organismos capazes de crescer nas maiores temperaturas conhecidas. Estes hipertermófilos são, em sua maioria, quimiolitotróficos autotróficos, sendo então classificados como produtores primários. Neste grupo há também organismos isolados (mas ainda não cultivados em laboratório) de ambientes frios, tais como águas oceânicas. Lagoa quente, rica em enxofre, que é convertido a ácido sulfúrico, por espécies de archaea. Sulfolobus, exemplo de uma archaea do filo Crenarchaeota, habitante da lagoa ilustrada acima. (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms) O filo Euryarchaeota é um grupo fisiologicamente diverso, sendo composto por dois grupos: 1) as archaea metanogênicas, que são anaeróbias, (Methanococcus, Methanobacterium e Methanosarcina), encontradas em ambientes de condições extremas, e 2) as halofílicas extremas, que são aeróbias (Halobacterium, Halococcus). As metanogênicas compreendem os organismos mais anaeróbios conhecidos, ou seja, o oxigênio mesmo em concentraçõesbaixíssimas, exerce um efeito extremamente letal sobre estes organismos. Neste filo há ainda o gênero Thermoplasma, composto por bactérias acidófilas, termofílicas, que não apresentam parede celular. As halofílicas geralmente coram-se como Gram negativas, não apresentam esporos e, em sua maioria, são imóveis, geralmente apresentando grandes plasmídeos, contendo cerca de 25 a 30% do DNA da célula. Dentre as metanogênicas, encontra-se o gênero Methanopyrus, que cresce em temperaturas de até 110°C. Lago hipersalino no Egito, rico em carbonato de sódio. O pH destas águas encontra-se na faixa de 10, sendo habitado por archaea halófilas extremas, tais como Halobacterium salinarum. A coloração vermelha é decorrente da presença de pigmentos carotenóides, presentes nestes organismos. Thermoplasma, uma archaea desprovida de parede celular. Pilha de refugo da mineração de carvão, que muitas vezes sofre auto- combustão. Hábitat da archaea Thermoplasma. (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms) O filo Korarchaeota é composto quase que somente por isolados identificados apenas a partir do sequenciamento de 16S rRNA, sendo considerado um grupo de hipertermófilos. Até o momento, poucos espécimes de Korarchaeota foram cultivados em laboratório. Pesquisas realizadas em uma fenda termal localizada no fundo do mar da Islândia, em 2002, levaram à identificação de uma nova espécie de archaea apresentando características bastante distintas, quando comparada aos demais membros desse domínio. A espécie Nanoarchaeum equitans diferencia-se das demais archaea por ser aparentemente muito primitiva (ou modificada), sendo encontrada em associação com outra archaea (Igniococcus sp.). Este organismo de morfologia arredondada é bastante diminuto, apresentando cerca de 400 nm de diâmetro e um pequeno genoma, de 0,5 Megabases. De acordo com seus descobridores, as grandes diferenças apresentadas por Nanorachaeum em relação à seqüência de RNA ribossomal, sugerem que tal organismo seja classificado em um novo filo, proposto como Nanoarchaeota. Micrografia de fluorescência, empregando um corante específico para DNA, revelando as células de Igniococcus (maiores) e de Nanoarchaeum equitans (menores). No quadro à direita, micrografia eletrônica evidenciando a estreita associação das duas archaea. Boucher & Doolittle (2002) Nature, 417:27-28 (clique no autor, caso deseje ver o artigo original) Micrografia de fluorescência empregando corantes específicos para os rRNAs de Igniococcus (verde) e Nanoarchaeum (vermelho) Huber et al. (2002) Nature, 417:63-67. (clique no autor, caso deseje ver o artigo original) Estrutura celular das Archaea Quanto à morfologia, podem ser esféricas, bacilares, espiraladas, achatadas, quadradas, discóides e muitas vezes de morfologia irregular ou pleomórficas. Suas dimensões são extremamente variáveis, de 0,1 a 15 µm, com alguns filamentosos atingindo 200 µm. As archaea apresentam várias características especiais, que permitem seu desenvolvimento em uma vasta gama de ambientes. Estas incluem alterações de composição de membrana, composição variada de paredes celulares, presença de proteínas tipo histonas, íntrons, mecanismos de splicing, entre outros. Parede celular: Apresenta composição e estruturação extremamente variáveis neste grupo de microrganismos. Esta variabilidade sugere que o ancestral comum seria desprovido de parede, sendo as diversas paredes resultantes de evolução independente, de acordo com os diferentes ambientes e grupos de archaea. Diferentes composições de parede celular presentes em archaea. (Adaptado de Atlas, R.M. (1997) - Principles of microbiology) Quando coradas pelo método de Gram, algumas archaea comportam-se como Gram positivas e outras como Gram negativas, embora suas paredes sejam completamente distintas daquelas de eubactérias. Como observado na figura acima, suas paredes celulares apresentam uma grande diversidade quanto à composição química e, diferentemente das eubactérias, não apresentam peptideoglicano. Além disso, existem também outras archaea que não exibem parede celular (Thermoplasma). O gênero Thermoplasma cresce bem em temperaturas de 55°C e pH 2, em meios complexos. Estes organismos apresentam a membrana citoplasmática bastante diferente, contendo compostos semelhantes a lipopolissacarídeos, contendo ligações tetraéter. Um outro gênero, filogeneticamente relacionado a Thermoplasma, é Picrophilus, que cresce em pHs de 0,06 a 0,7. Várias archaea exibem uma parede espessa, rígida, semelhante à parede Gram positiva (Methanobacterium, Methanopyrus, Halococcus), entretanto, os polímeros que compõem a estrutura podem ser: pseudopeptideoglicano ou metanocondroitina. O pseudopeptideoglicano diferencia-se do peptideoglicano pela ocorrência de ácido talosaminurônico em substituição ao murâmico, pela ligação do tipo b-1,3 ao invés de b-1,4 entre os açúcares e pela ausência de D-aminoácidos nas porções peptídicas da molécula. Nestas bactérias, a lisozima não exibe qualquer atividade de degradação da parede, uma vez que seu sítio de ação são as ligações b-1,4. Da mesma forma, a penicilina é ineficaz contra estes organismos porque o mecanismo de síntese de parede é distinto nas archaea. A metanocondroitina é um polímero de 4 açúcares (galactosamina, ácido glucorônico, N-acetil-galactosamina e glicose), muito semelhante ao tecido conectivo animal, composto por sulfato de condroitina. Aquelas archaea que coram-se como Gram negativas podem ter paredes compostas por proteínas, polissacarídeos ou glicoproteínas. As paredes protéicas podem variar entre si, podendo ser do tipo monocamada de natureza cristalina, ou policamadas, de proteínas tubulares. As glicoproteínas são também comuns, muitas vezes contendo grandes quantidades de aminoácidos carregados negativamente. As halobactérias são um exemplo do modelo descrito acima, onde as cargas negativas da parede interagem com os íons Na+ do ambiente, estabilizando a parede. O gênero Halococcus apresenta a parede celular composta por um heteropolissacarídeo altamente sulfatado, nunca observado em qualquer outro ser vivo. Eventualmente, algumas archaea exibem uma camada protéica adicional ao redor da parede celular, ou compondo a própria parede, denominada “camada S”, em um estado cristalizado. Membrana Citoplasmática: corresponde a uma estrutura única, apresentando composição química e arranjo totalmente diferentes das membranas citoplasmáticas de quase todas as bactérias e de todos eucariotos. Membrana Bacteria Archaea Eucarya Conteúdo protéico alto alto baixo Composição lipídica fosfolipídeos Sulfolipídeos, glicolipídeos, hidrocarbonetos ramificados, isoprenoides, fosfolipídeos Fosfolipídeos Estrutura dos lipídeos cadeia linear cadeia ramificada cadeia linear Ligação dos lipídeos éster éter (di e tetraeter) éster As membranas de archaea geralmente apresentam um alto conteúdo protéico e vários lipídeos: glicolipídeos, sulfolipídeos, fosfolipídeos (raros) e lipídeos apolares do tipo isopreno. A presença de hidrocarbonetos ramificados aumenta a fluidez da membrana, uma vez que dificultam a formação de estruturas cristalinas. Dentre os principais lipídeos estão aqueles do tipo glicerol-éter-isopreno (hidrocarbonetos de 20, 25 ou 40 Carbonos). Uma característica da porção lipídica da membrana é o fato desta não ser composta por ácidos graxos convencionais. Em seu lugar encontram-se longas cadeias de hidrocarboneto ramificadas. Os hidrocarbonetos ligam-se ao glicerol por ligações do tipo
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