Uma via biosintética de lactonas sesquiterpênicas de Smallanthus sonchifolius e sua localização em tecidos foliares por imagem MALDI MS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISCIPLINA: BIO-ORGÂNICA 
Profa. Dra. Mariana Helena Chaves
Maria das Dores Alves de Oliveira
Teresina/2017
Uma via biosintética de lactonas sesquiterpênicas de Smallanthus sonchifolius e sua localização em tecidos foliares por imagem MALDI-MS
1
LOPES, A. A. et al. A biosynthetic pathway of sesquiterpene lactones in Smallanthus sonchifolius and their localization in leaf tissues by MALDI imaging. Chemical Communications, v. 49, n. 85, p. 9989-9991, 2013.
2
Resumo
Uma via para biossíntese das lactonas sesquiterpênica (STL) uvedalina e enidrina a partir  de culturas in vitro de Smallanthus sonchifolius (Asteraceae). A biossíntese foi investigada utilizando 13C-precursores, e os resultados foram comprovados por analise de RMN 13C. Os autores também realizaram análises por Fotomicroscópio nas folhas de Smallanthus sonchifolius, utilizando imagens MALDI-MS, na qual confirmou o acumulo de (STL) nos tricomas glandulares das folhas
3
Introdução
MACHADO, Silvia R. et al. Morfoanatomia do sistema subterrâneo de Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson (Asteraceae).Revista Brasileira de Botânica, v. 27, n. 1, p. 115-123, 2004.
Smallanthus sonchifolius (Yacon)
Família: Asteraceae
Género: Smallanthus
Espécie: S. sonchifolius
Ocorrência: Originária da Cordilheira dos Andes
É uma espécie herbácea de clima tropical de altitude, tem atraído a atenção mundial devido à suas propriedades medicinais e nutricionais, apesar da sua toxicidade renal
4
Introdução
As lactonas sesquiterpênicas descrita no artigo é pertencentes à classe dos melampolideos, que apresentam importante capacidade antifúngica
Melampolideos são compostos que foram são isolados anteriormente de plantas do gênero Melampodium  pertencente à família Asteraceae
5
5
Introdução
Uvedalina ( 1 ) e Enidrina ( 2 ) são os principais constituintes das folhas do S. sonchifolius
A Uvedalina exibe atividades antimicrobiana e antifúngica
A Enidrina exibe atividades antimicrobianas, anti-inflamatórias, e antidiabéticas
INOUE, Atsushi et al. Antifungal melampolides from leaf extracts of Smallanthus sonchifolius. Phytochemistry, v. 39, n. 4, p. 845-848, 1995.
6
6
Objetivo
 Isolar e Elucidar as vias biosintética das STL uvedalina e enidrina de Smallanthus sonchifolius, utilizando 13C-D-glicose como precursor 
7
Material vegetal
Uma exsicata de S. sonchifolius com número 1413, foi depositada no herbário da Universidade de Ribeirão, SP, Brasil
Parte experimental
8
Parte experimental
CC-Gel de sílica (70-230 mesh; Merck)
HPLC Shimadzu, com uma coluna CLC-CN analítica (250 mm x 4,6 mm, com partícula de 5 μ) 
E um espectrômetro (Bruker 400 MHz ),para obter os espectros de RMN 13C compostos de cultura líquida
Material utilizados
9
PARA ISOLAR OS COMPOSTOS 
Análise por RMN
Um espectrômetro (Varian INOVA 500 MHz), para obter os espectros de RMN 13C, dos compostos de culturas sólidas 
Parte experimental
MALDI-TOF/TOF UltrafleXtreme (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha)
As imagens das folhas foram obtidas usando um fotomicroscópio (Leica DM 4500B) acoplado a uma câmera digital (Leica DFC 320)
Material utilizados
10
Análise LC-HRESIMS
LC-MS-cromatógrafo líquido, Shimadzu LC-20A com detector DAD (CBM20A, Shimadzu), coluna Shimadzu CLC-ODS(C-18) (250 mm x 4,6 mm diâmetro 5μm espessura ) 
Pré-coluna (12,5mm × 4,6 mm) (Agilent Technologies) acoplada ao espectrómetro de massa UltrOTOFq (Bruker Daltonics) q-TOF-MS
Análise MALDI-MS
Fotomicroscopia das folhas
Parte experimental
Os precursores marcados, 1-13C-D-glicose, 1,2-13C2-mevalonolactona, 2-13C-acetato de sódio (99%), adquiridos da (Sigma-Aldrich®)
A L-[U-13C6]-isoleucina (>98%) foi obtida da (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.)
Materiais químicos
11
Parte 
experimental
Aspecto geral do sistema subterrâneo de planta adulta
Rizóforo em fase de desenvolvimento
Sistema subterrâneo de planta
Rebrota produzida a partir de rizóforos ligados à planta-mãe
Rizóforo na época do brotamento, com proliferação de gemas (*)
Formação da raiz tuberosa
MACHADO, Silvia R. et al. Morfoanatomia do sistema subterrâneo de Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson (Asteraceae).Revista Brasileira de Botânica, v. 27, n. 1, p. 115-123, 2004.
Fig. 1-6. S. sonchifolius. 
12
ASPECTO GERAL DO SISTEMA SUBTERRÂNEO DE PLANTA ADULTA
1.Os segmentos nodais foram excisados e lavados em água da torneira
Esquema 1. Processo geral para as culturas sólidas in vitro de S. sonchifolius
Parte 
experimental
Meio sólido 
Meio líquido 
Continua...
13
Esquema 1. Processo geral para as culturas sólidas in vitro de S. sonchifolius
inoculados em tubos de vidro contendo 5 mL de meio de cultura sólido Murashige & Skoog, suplementado com 1- 13C-D-glucose 3% e com 0,2% de Phytagel®, ajustando o pH para 6,0 
inoculados em tubos de vidro contendo 2,5 mL de cultura líquido Murashige&Skoog, suplementada com 2-13C-acetato de sódio (0,25%), 1-13C-D-glicose(3%), 1,2-13C2 mevalonolactona (6,8 mM) (0,25%) e L-[U--13C6]-isoleucina (2,5mM)
*Armazenados a 25 ± 2 °C (55-60% de umidade por um período de 16h sob iluminação lâmpadas fluorescentes e incubadas
63 dias (9 semanas)* 
durante 56 dias (8 semanas)* 
Meio sólido 
Meio líquido 
14
brotos frescos (n = 33)
foram extraídos com acetona durante 12h
Extrato (212 mg)
Após 8 semanas
CC gel de sílica, n-hexano/EtOAc
(100:0% → 70:30%)
 obtendo oito frações (1-8)
5
2
 (16,6 mg)
 (12 mg) 
1
3
4
8
Esquema 2. Processo de isolamento das STL 1 e 2 in vitro sólido
Parte 
experimental
15
Esquema 3. Fracionamento da fração 6 e 7
Fração 6
 (16,6 mg)
Composto 1 uvedalina
(5,0 mg)
Fração 7
(12 mg)
CC gel de sílica n-hexano/EtOAc (7:3) para produzir uvedalina enriquecida 
CC gel de sílica n-hexano-EtOAc (3:2) para produzir duas frações 7.1 e 7.2
7.1
7.2 
(3 mg)
Composto 2
Enidrina
(1,0 mg) 
Parte experimental
HPLC, MeCN / H2O
(5:95 100% MeCN),
 com fluxo de 1 mL/min-1
16
brotos frescos meio líquido (n = 30)
foram extraídos com acetona durante 12h
Mesmo processo cromatográfico anterior
Após 9 semanas
Composto 1
uvedalina
(3,0 mg)
Composto 2 enidrina
(2,0 mg)
Parte 
experimental
Esquema 4. Processo de isolamento das STL 1 e 2 in vitro líquido
17
Parte 
experimental
Estrutura dos compostos isolados
18
Resultados
 e discussão
Tab.1-Dados de 13C RMN da lactona sesquiterpenica uvedalina (1), isolada de S. sonchifolius após incorporação de 1- 13C-D-glucose (a), 2-13C-acetato de sódio (b) e L- [U-13C6] isoleucina (c)
U: experiências de controle com precursor não marcado; 
L: experiência de marcação com precursor de 13C; 
ΔC =1,1% x L / U: aumento da intensidade relativa (aumentos significativos em negrito para os carbonos enriquecidos).
aUsado como referência. * Sinais sobrepostos
19
 Fig 1. (a) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) de uvedalina com abundância isotópica 13C natural 
 (b) uvedalina após S. sonchifolius crescerem em cultura sólida com 1-13C-D-glicose
Resultados
 e discussão
26.3
δ
75.4
δ
71.3
121.7
166.1
17.1
168.7
13.8
20
Resultados
 e discussão
Fig.2 (a) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) da uvedalina com abundância isotópica 
13C natural
 (b) uvedalina após S. sonchifolius crescerem em cultura líquida com 1- 13 C-D-glucose
21
(a)uvedalina com abundância isotópica 13C natural 
(a)uvedalina após creserem cultura sólida com 1-13C-D-glucose
(a) uvedalina com abundância isotópica 13C natural
(b)uvedalina após crescimento em cultura líquida com 1- 13 C-D-glucose
Fig. 1 cultura sólida com 1-13C-D-glucose
Fig. 2 cultura liquida com 1-13C-D-glucose
Fig. 1 
Fig. 2 
Resultados
 e discussão
22
Resultados
 e discussão
Fig.3 (a) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) da uvedalina com abundância isotópica 13C natural 
(b) uvedalina após S. sonchifolius crescerem em cultura
líquida com 2-13C-acetato de sódio
23
Resultados
 e discussão
Fig.4 (a) RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) da uvedalina com abundância isotópica 13C natural 
 (b) uvedalina após S. sonchifolius crescerem em cultura líquida com L-[U-13C6]-isoleucina
24
Resultados
 e discussão
Tab.2-Dados de 13C RMN da lactona sesquiterpenica enidrina (2), isolada de S. sonchifolius após incorporação de 1-13C-D-glucose (a) 2-13C-acetato de sódio (b) e L- [U-13C6] isoleucina (c)
U: experiências de controle com precursor não marcado; 
L: experiência de marcação com precursor de 13C; 
ΔC =1,1% x L / U: aumento da intensidade relativa (aumentos significativos em negrito para os carbonos enriquecidos).
aUsado como referência.* Sinais sobrepostos
25
Fig.6 (a) 13 C RMN (125 MHz, CDCl3) de enidrina com abundância natural isotópica 
13 C 
 (b) enidrina após S. sonchifolius crescerem em cultura sólida com 1- 13 C-D-glucose
Resultados
 e discussão
26
Resultados
 e discussão
Fig.7 (a) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) da enidrina com abundância isotópica
 13C natural 
(b) enidrina após S. sonchifolius crescerem em cultura líquida com 2-13C-acetato de sódio
27
Resultados
 e discussão
Fig.8 (a) RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) da enidrina com abundância isotópica 13C natural 
 (b) enidrina após S. sonchifolius crescerem em cultura líquida com L- [U-13C6] -isoleucina
28
Via biosintética para unidades de terpenóides (derivada da via MEP) e ésteres das cadeias laterais
29
ciclo do ácido cítrico
Terpenos via MEP
Metabolismo dos amino ácido
Cadeias laterais
Pirofosfato de isopentenil
pirofosfato de dimetilalil
Proposta de biossíntese para lactona sesquiterpenica
lactona 
sesquiterpenica
30
A
carbocation farnesil
NADP+
Proposta de biossíntese para lactonas sesquiterpênica uvedalina e enidrina
SAM
Continua...
31
Proposta de biossíntese para lactona sesquiterpenica uvedalina e enidrina
32
R.Clisen
Estrutura dos compostos isolados e biossintetizados 
=
=
33
C23H28O9
 m/z 449,18
C23H28O10
 m/z 465,17
A solução matriz utilizada foi 10 mg/mL de CHCA (ácido α-ciano 4-hidroxicinâmico) e 0,15 mg.mL_1 de NaCl em 50% de MeCN
Utilizando fluxo de gás hidrogênio durante todo o processo de pulverização
Parte 
experimental
ANALISE POR MALDI-MS
Espectrometria de massa por desorção-ionização de laser
ácido α-ciano 4-hidroxicinâmico
34
As análises foram feitas duplicatas em modo positivo, tanto na superfície intacta quanto na seções transversais das folhas e no extrato 
Parte 
experimental
Os íons selecionados foram acelerados para 19 Kv na célula LIFT para análises MS/MS
Lavou-se aproximadamente 81,6 mg de folhas secas com 4 mL de clorofórmio durante 30 segundos 
O extrato foi seco com nitrogênio e solubilizado em MeCN a 50% em uma mistura (1: 1) com a matrix
uvedalina (1) e enidrina (2) foram preparadas a 2 mg.mL e misturadas com a matrix
35
ANALISE POR MALDI-TOF/MS
Espectrometria de massa por desorção-ionização de laser
Imag. analise por MALDI-TOF/MS
Resultados
 e discussão
Fig. 9- Espectro de massa de alta resolução da uvedalina(1) 
36
Fig. 10- Espectro de massa de alta resolução de enidrina (2)
Resultados
 e discussão
37
Resultados
 e discussão
Fig 11. Espectro de MS / MS do extrato foliar de S. sonchifolius 
38
extração de íons pulsados de 150 ns, e a frequência de laser de 1000 Hz
Parte 
experimental
Forma calculados 1000 disparos para registrar as imagens
39
Condições experimentais
Os íons matrix foram usados nas calibrações externa e interna. Os íons foram acelerados a 20 Kv
Espectrometria de massa de imagem (MALDI-IMS)
Figura de espectrometria de imagem
As folhas foram cortadas seções transversais com uma espessura de 100 μm
Resultados
 e discussão
(A) imagens da superfície das folhas intacta- face adaxial
(B) Imagens de MALDI-MS reconstituídas com íons de m/z 471 [M+Na] ( 1 ) e 487 [M+ Na]( 2 ) a partir dos lados abaxial
(C) adaxial 
(D) cortes transversais
 (E) com m/z 487 [M + Na]  
(F) 471 [M+ Na], a partir das seções transversais das folhas. 
(G) Imagens MALDI-MS/MS (expansão) reconstruídos com íons do fragmento m/z 371 da enidrina
(H) Fragmento de m/z 355 de uvedalina
Fig. 10 
40
(Ab: lado abaxial, Ad: laterais adaxial, GT: tricomas glandulares, Mi: da costela)
Espectrometria de massa de imagem (MALDI-IMS)
Conclusão 
Em conclusão, os estudos realizados pelo grupo de pesquisa sobre a biossíntese de 1 e 2 têm demonstrado que o esqueleto sesquiterpênico é derivado a partir da via MEP 
O grupo de pesquisa também estabeleceu que a  origem da cadeia lateral do éster vem da isoleucina 
Estes resultados demonstraram o envolvimento de ambas as vias, aminoácido e MEP na biossíntese de sesquiterpenos misto 
41
Conclusão 
 
Este é o primeiro relato de um estudo de STL biossintétizada de S. sonchifolius 
A pesquisa permitiu também que os pesquisadores estabelecessem a via da biossíntese para os ésteres epoxigenados com 13C-precursores, pela primeira vez na literatura
42
Obrigada!
43
44
Proposta de biossíntese para lactona sesquiterpenica uvedalina e enidrina
45
	C
	δ
	
1-13C-D-glucose (a)
	
2-13C-sodium acetate (b)
	L-[U-13C6]-isoleucine
(c)
	
	
	Relative intensity of signal
	ΔC
	Relative intensity of signal
	ΔC
	Relative intensity of signal
	
	
	L
	U
	
	L
	U
	
	L
	U
	1a
	148.6
	1.1
	1.1
	1.1
	0.3
	0.3
	1.1
	0.3
	0.3
	2
	26.3
	1.8
	1.1
	1.8
	0.2
	0.2
	1.1
	0.2
	0.2
	3
	37.1
	1.0
	1.2
	1.1
	0.2
	0.2
	1.1
	0.3
	0.3
	4
	130.8
	0.5
	0.5
	1.1
	0.6
	0.5
	1.3
	0.5
	0.5
	5
	126.3
	1.1
	1.2
	1.1
	0.3
	0.3
	1.1
	0.4
	0.4
	6
	75.4
	1.8
	1.3
	1.5
	0.4
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	7
	51.1
	1.0
	1.3
	1.1
	0.4
	0.5
	1.1
	0.5
	0.5
	8
	*71.3
	2.1
	1.3
	1.8
	0.4
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	9
	*71.3
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	10
	134.6
	0.5
	0.5
	1.1
	0.5
	0.5
	1.1
	0.5
	0.5
	11
	138.8
	0.5
	0.5
	1.1
	0.4
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	12
	169.3
	0.2
	0.2
	1.1
	0.3
	0.3
	1.1
	0.3
	0.3
	13
	121.7
	2.4
	1.2
	2.2
	0.2
	0.2
	1.1
	0.3
	0.3
	14
	166.1
	0.7
	0.4
	2.0
	0.5
	0.4
	1.3
	0.4
	0.4
	15
	17.1
	1.8
	0.9
	2.2
	0.7
	0.6
	1.3
	0.7
	0.7
	1’
	168.7
	0.6
	0.3
	2.2
	1.5
	0.4
	4.1
	m
	0.4
	2’
	59.6
	0.4
	0.5
	1.1
	0.7
	0.6
	1.3
	m
	0.6
	3’
	60.1
	2.9
	0.4
	2.3
	1.4
	0.4
	3.8
	m
	0.4
	4’
	13.8
	2.0
	1.1
	2.0
	1.3
	0.3
	4.8
	m
	0.3
	5’
	19.3
	2.8
	1.3
	2.4
	0.6
	0.5
	1.3
	m
	0.6
	1’’
	170.4
	0.5
	0.4
	1.3
	0.5
	0.5
	1.1
	0.5
	0.5
	2’’
	21.1
	2.5
	0.9
	3.0
	1.2
	0.6
	2.2
	0.6
	0.6
	1’’’
	52.6
	2.5
	1.0
	2.8
	0.8
	0.7
	1.2
	0.7
	0.7
	C
	δ
	1-13C-D-glucose (a)
	2-13C-sodium acetate (b)
	L-[U-13C6]-isoleucine
(c)
	
	
	Relative intensity of signal
	ΔC
	Relative intensity of signal
	ΔC
	Relative intensity of signal
	
	
	L
	U
	
	L
	U
	
	L
	U
	1a
	149.4
	1.1
	1.1
	1.1
	0.2
	0.3
	1.1
	0.3
	0.4
	2
	24.7
	2.2
	1.0
	2.4
	0.2
	0.2
	1.1
	0.2
	0.2
	3
	35.4
	1.2
	1.1
	1.2
	0.2
	0.2
	1.1
	0.2
	0.2
	4
	59.3
	0.5
	0.5
	1.1
	0.4
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	5
	62.7
	1.3
	1.1
	1.3
	0.3
	0.3
	1.1
	0.3
	0.3
	6
	75.9
	2.4
	1.1
	2.4
	0.3
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	7
	45.5
	1.0
	1.2
	1.1
	0.2
	0.3
	1.1
	0.2
	0.2
	8
	71.2
	2.1
	1.2
	2.0
	0.3
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	9
	70.4
	1.1
	1.2
	1.1
	0.3
	0.3
	1.1
	0.3
	0.3
	10
	130.0
	0.5
	0.5
	1.1
	0.4
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	11
	133.3
	0.5
	0.5
	1.1
	0.4
	0.4
	1.1
	0.4
	0.4
	12
	167.9
	0.2
	0.2
	1.1
	0.2
	0.2
	1.1
	0.3
	0.3
	13
	122.8
	2.5
	1.0
	2.8
	0.2
	0.2
	1.1
	0.2
	0.2
	14
	165.5
0.7
	0.3
	2.6
	0.3
	0.3
	1.1
	0.3
	0.3
	15
	17.5
	2.6
	1.0
	2.9
	0.6
	0.5
	1.3
	0.5
	0.5
	1’
	168.3
	0.6
	0.3
	2.2
	1.0
	0.3
	3.7
	m
	0.4
	2’
	59.3
	0.7
	0.7
	1.1
	0.4
	0.4
	1.1
	m
	0.5
	3’
	59.8
	3.1
	1.1
	3.1
	1.0
	0.4
	2.8
	m
	0.4
	4’
	13.6
	2.1
	1.0
	2.3
	1.0
	0.5
	2.2
	m
	0.5
	5’
	19.0
	3.0
	1.0
	3.3
	0.4
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