Aula_-_Regulacao_Expressao_Genica

Prévia do material em texto

12/11/2013 
1 
Regulação da Expressão Gênica 
PROCARIOTOS E 
EUCARIOTOS 
Expressão Gênica 
Conjunto de processos que levam à produção de 
produtos difusíveis (RNA e proteínas) a partir de um 
gene. 
 
 
12/11/2013 
2 
Definições 
• Gene – sequência de DNA que codifica para um 
produto difusível (proteína ou RNA) 
 
• Elementos cis – sequências reguladoras no DNA, 
menores que 10 pb 
 
• Elementos trans – proteínas e RNA’s que regulam a 
expressão de outros genes 
 
• Genes Estruturais  codificam para proteínas requeridas para funções 
enzimáticas ou estruturais da célula 
 
• Genes Regulatórios  codificam para proteínas que regulam a expressão 
de outros genes 
 
• Genes Constitutivos  genes expressos em níveis relativamente constantes 
Ex: “housekeeping” genes 
 
• Genes Induzidos  genes cujos produtos aumentam de concentração em 
resposta a uma sinal molecular. O fenômeno chama-se INDUÇÃO. 
 
• Genes Reprimíveis  genes cujos produtos diminuem de concentração em 
resposta a uma sinal molecular. O fenômeno chama-se REPRESSÃO. 
Definições 
12/11/2013 
3 
Indução e Repressão 
• Indutor – pequena molécula ou agente ambiental que ativa a 
expressão 
 
• Ativador – proteína que se liga ao DNA para ativar a transcrição 
 
• Correpressor – pequena molécula que inibe a síntese da(s) 
enzima(s) necessária(s) para sintetizá-lo 
 
• Repressor – proteína que se liga ao DNA para inibir a expressão 
Regulação por fatores TRANS 
• Controle positivo → via Ativador 
 (comum em eucariotos) 
 
• Controle negativo → via Repressor 
 (comum em procariotos) 
12/11/2013 
4 
Procariotos 
• Os genes em procariotos geralmente estão ativos – 
principal controle é por repressão 
 
▫ RNA pol é bem ativa, requer fatores específicos σ70,32 
▫ Repressores – operador 
▫ Ativadores 
▫ Os genes podem ser monocistrônicos ou policistrônicos 
▫ Permite controle coordenado: transcrição e tradução 
acopladas 
Eucariotos 
• Os genes eucarióticos geralmente estão reprimidos – 
controle por ativação 
 
▫ Acesso limitado à cromatina 
▫ RNA Polimerase é pouco ativa 
▫ Requer fatores basais ou gerais 
▫ Requer fatores específicos 
▫ Organização monocistrônica 
▫ Transcrição ocorre separadamente da tradução 
12/11/2013 
5 
PROCARIOTOS 
Pontos de Controle em Procariotos 
• Transcrição – mais frequente 
 
• Degradação do mRNA – alguns casos 
 
• Tradução 
 
12/11/2013 
6 
Diferentes Fatores σ 
Operon 
• Conjunto de genes que estão sob o controle 
do mesmo promotor/sinal regulatório. 
 
• mRNA policistrônico 
 
 
12/11/2013 
7 
Componentes de um Operon 
• Promotor 
• Operador (sítio de controle) 
• Sequências Codantes 
• Terminador da transcrição 
Repressor 
(TRANS) 
12/11/2013 
8 
Operon Lac de E. coli 
• Genes relacionados ao catabolismo de lactose → estudado 
por Francois Jacob and Jacques Monod (Institute Pasteur) 
 
• E. coli expressa os genes para o metabolismo de glicose 
constitutivamente 
 
• O metabolismo de outros açúcares (ex. lactose) são regulados 
especificamente 
 
• Lactose = dissacarídeo (glucose + galactose) provê energia. 
Organização do Operon Lac 
12/11/2013 
9 
Metabolismo da 
Lactose 
β-Galactosidase tem duas reações: 
 
Principal: metabolismo 
 
Secundária: Indutor do operon Lac 
Genes do Operon Lac 
• β-galactosidase (lacZ) 
• Quebra a lactose em glicose + galactose (metabolismo) 
• Converte lactose em alolactose que regula o operon 
 
• Lactose permease (lacY) 
• Transporta lactose através da membrana plasmática 
 
• Transacetilase (lacA) 
• Transfere o grupo acetil para a lactose. 
12/11/2013 
10 
Operon Lac – Ausência de Lactose 
P lacI T P O lacZ lacY lacA 
 mRNA 
Operon Lac – Ausência de Lactose 
12/11/2013 
11 
Operon Lac – Presença de Lactose 
P lacI T P O lacZ lacY lacA 
Alolactose 
mRNA 
Operon Lac – Presença de Lactose 
12/11/2013 
12 
Proteína Responsiva a cAMP (CAP) 
• Glicose é preferida à lactose; 
• A presença de glicose também afeta o operon Lac; 
• cAMP é presente na ausência de glicose; 
• CAP-cAMP liga-se upstream do operon Lac amplificando sua 
expressão em até 50x (aumenta a afinidade da RNA pol); 
• Experimentos adicionando cAMP a células restaura a alta 
expressão do operon Lac mesmo na presença de glicose. 
12/11/2013 
13 
Operon Triptofano (Trp) 
• Genes relacionadas à síntese de triptofano. 
 
• Se aminoácidos estão presentes no meio, E. coli irá 
importá-los antes de sintetizá-los. 
 
• Os genes para a síntese de aminoácidos estão reprimidos. 
 
• Quando aminoácidos são escassos no meio de cultura, os 
genes biossintéticos são expressos e a síntese ocorre. 
Organização do Operon Trp 
12/11/2013 
14 
Regulação do operon Trp 
• Dois Mecanismos: 
 
 Interação repressor/operador (regulação transcricional) 
 
 Terminação de transcritos iniciados (regulação traducional) 
12/11/2013 
15 
Interação repressor/operador 
• Quando triptofano (correpressor) está presente, ele se 
liga à molécula repressora trpR. 
 
• A proteína trpR se liga ao operador e impede a transcrição 
do operon. 
 
• Repressão reduz a transcrição do operon em 70 vezes. 
Interação repressor/operador 
12/11/2013 
16 
Regulação por Atenuação 
• Quando as células estão necessitadas de triptofano, os genes 
trp são expressos ao máximo. 
 
• Sob condições mais amenas de ausência de triptofano, os 
genes trp são expressos em níveis abaixo do máximo. 
 
• Atenuação pode regular os níveis de transcrição por um fator 
de 8 a 10 e, quando combinada com o mecanismo de 
repressão, de 560 a 700 vezes. 
12/11/2013 
17 
A Região Líder 
P O trpL trpE trpD trpC trpB trpA A 
A Região Líder 
• A transcrição e a tradução são acopladas em procariotos e 
ocorrem ao mesmo tempo. 
 
• O pareamento das regiões 1 e 2 da região líder faz com que a 
RNA polimerase sofra uma pausa logo depois que estas 
regiões foram sintetizadas. 
 
• A pausa é longa o suficiente para o ribossomo ser carregado 
no mRNA e iniciar a tradução logo atrás da RNA polimerase; 
 
• A região 1 possui dois códons para triptofano. 
 
12/11/2013 
18 
Situação 1: Escassez de Trp 
• A posição do ribossomo tem um papel importante na atenuação; 
 
• Quando triptofano é escasso ou está em baixa concentração: 
 
 Trp-tRNA não está disponível, o ribossomo para nos códons para Trp e 
cobre a região 1 do atenuador; 
 
 A região 1 não está disponível para parear com a região 2 que, por sua vez 
pareia com a região 3 quando esta é transcrita; 
 
 Região 3 (agora pareada com a região 2) não é capaz de parear com a 
região 4 quando esta é transcrita; 
 
 A RNA polimerase continua transcrevendo a região 4 e adiante 
sintetizando o mRNA trp policistrônico completo. 
12/11/2013 
19 
Situação 2: Trp Disponível 
Quando Trp está em altas concentrações na célula: 
 
 Os ribossomos sintetizam o peptídeo líder passando 
rapidamente pela região 1; 
 
 A tradução é contínua até o códon UGA que fica entre as 
regiões 1 e 2 impedindo o pareamento das regiões 2 e 3; 
 
 Há o pareamento das regiões 3 e 4 gerando um hairpin 
terminador, assim há a interrupção da transcrição do 
operon trp. 
Resumo 
12/11/2013 
20 
Outros operons regulados por 
atenuação 
Eucariotos 
12/11/2013 
21 
Possíveis pontos de 
controle 
• Inciação da transcrição 
• Processamento de RNA 
• Transporte de mRNA para o 
citoplasma 
• Estabilidade do mRNA 
• Inciação da tradução 
• Estabilidadee modificação 
pós-traducional de proteínas 
12/11/2013 
22 
Regulação Transcricional 
12/11/2013 
23 
Como “ligar” um gene eucariótico? 
• Remodelagem da cromatina 
▫ Torna sítios do promotor mais acessíveis 
 
• Recrutamento de fatores de transcrição ao complexo de 
iniciação 
Remodelagem da Cromatina 
• O DNA interfásico é ainda bem condensado e associado a histonas 
(nucleossomos) 
 
• A inacessibilidade das proteínas pode ser demonstrada por ensaios 
de sensibilidade da cromatina a nuclease 
 
▫ Genes inativos são mais resistentes a DNAse 
▫ Genes ativos são mais sensíveis ao tratamento com DNAse 
 
• Remodelagem da cromatina é necessária para tornar o DNA mais 
acessível aos fatores de transcrição 
12/11/2013 
24 
Nucleossomos e 
Transcrição 
Modificação de Histonas 
• Complexo SWI/SNF 
▫ 11 subunidades 
 Inclui atividades de ligação ao DNA e ATPase 
 Comum em eucariotos (leveduras a humanos) 
 
▫ Remodelador global da cromatina → permite que regiões do 
DNA sejam mais acessíveis às proteínas da transcrição 
12/11/2013 
25 
Remodelagem de 
Nucleossomos 
• 3 mecanismos possíveis para 
recrutamento do complexo 
SWI/SNF 
 
▫ Fatores de transcrição 
▫ Histonas modificadas (acetiladas) 
▫ DNA modificado (metilado nas citosinas) 
Modificação de Histonas 
• Histona acetiltransferases (HAT) 
 Direcionada a genes específicos por fatores de transcrição 
 
• Histona deacetilases (HDAC) 
 
12/11/2013 
26 
Metilação do DNA 
• 5-metil citosina 
 
• Associada com inativação gênica 
▫ Grau de metilação inversamente relacionado com grau de 
atividade 
▫ Padrões de metilação são tecido-específicos 
 
• Alvos da metilação: “ilhas de CpG” 
Silenciamento de genes de mamíferos 
por metilação 
 Alguns genes são mantidos silenciados por metilação de regiões 
adjacentes 
 
 Metilação do DNA pode marcar onde a heterocromatina irá se 
formar 
 
 Metilação do DNA explica o fenômeno de imprinting 
 
12/11/2013 
27 
Como atua a metilação do DNA na 
repressão gênica ? 
• Modelo 
▫ Algumas proteínas preferencialmente se ligam a DNA 
metilado 
▫ Poderiam recrutar repressores ou HDAC e induzir a 
remodelagem da cromatina a um estado mais 
condensado 
 
• Não é um mecanismo universal pois Drosophila não 
metila o seu DNA 
Epigenética 
 
“Estudo de mudanças 
na expressão gênica 
causadas por 
mecanismos que não 
envolvem a alterações 
na sequência do DNA” 
(hereditário) 
12/11/2013 
28 
Iniciação da Transcrição 
Iniciação da Transcrição 
• Um dos mais comuns mecanismos de regulação 
 
• Iniciação pode envolver a ação de mais de 100 proteínas diferentes 
 
• A maioria dos fatores atuam para ativar a expressão 
 
• São poucos os repressores da iniciação da transcrição 
12/11/2013 
29 
Elementos regulatórios cis 
1) Promotor (core): TATA 
2) “Promoter-Proximal Elements” ou “Upstream Promoter Elements 
(UPE): 
 - CAAT ou CCAAT box 
 - GC box (consenso GGGCGG) 
3) Enhancers 
12/11/2013 
30 
Formação do 
complexo basal de 
iniciação no 
promotores 
eucarióticos 
Enhancers 
• Sequência de DNA (elementos cis) onde se ligam vários 
fatores de transcrição para aumentar a taxa de iniciação 
da transcrição 
 
▫ Podem ter sítios para fatores inibitórios também 
▫ Funcionam nas duas orientações 
▫ Não são específicos para um dado gene, podem atuar em qualquer um que 
esteja próximo 
 
• Podem ser localizados upstream ou downstream do 
promotor e atuam a grandes distâncias 
 
• Em leveduras são chamados de UAS (upstream activating 
sequences) 
12/11/2013 
31 
Enhancers 
Posição de alguns enhancers 
▫ Cadeia pesada da imunoglobulina  dentro do gene 
▫ gene da β-globina  downstream 
▫ SV40  upstream e perto do promotor 
 
• “Silenciadores” (Silencers) bloqueiam a “passagem” do 
efeito ativador dos enhancers sobre o complexo basal de 
transcrição 
Iniciação da Transcrição 
12/11/2013 
32 
“Enhanceosome” 
Fatores de Transcrição 
• Fatores de Transcrição (FT) se ligam a enhancers e 
UPE’s e interagem com o complexo basal 
 
• FT têm 2 domínios (estrutura modular) 
 “DNA binding domain”- para interação com o elemento cis 
 “Protein binding domain” - para interagir com outro FT, com 
um mediador (coativador) ou com a RNA Polimerase 
12/11/2013 
33 
Motivo “Helix-Turn-Helix” 
Motivo “Zinc Finger” 
12/11/2013 
34 
Motivo “Leucine Zipper” 
Interações cooperativas dos FT levam a 
padrões diferenciais de expressão 
12/11/2013 
35 
Regulação Pós-Transcricional 
Splicing Alternativo do mRNA 
• Geração de mais de uma variante de mRNA a partir do mesmo 
transcrito primário 
• O que é íntron pode ser éxon, e vice-versa 
• Número de proteínas de um proteoma não precisa estar limitado 
ao número de genes do seu genoma 
• Humanos podem fazer milhares de diferente proteínas a partir 
de 30.000 genes 
 30-60% podem sofrer eventos de splicing alternativo 
12/11/2013 
36 
Determinação de Sexo 
em Drosophila 
Estabilidade de mRNA 
Encurtamento da cauda poli A e remoção do CAP 
12/11/2013 
37 
Silenciamento por RNA 
(RNA Silencing) 
• Mecanismo de regulação de expressão de genes por moléculas 
de RNA antisense 
• Originalmente verificado no citoplasma 
• Hoje também são encontrados exemplos no núcleo onde a 
estrutura da cromatina é afetada (silenciamento gênico - “gene 
silencing”) 
“RNA Interference” 
• “RNA interference” (RNAi) é o mais conhecido mecanismo de 
silenciamento por RNA e envolve pequenas moléculas de RNA 
 
Efeitos: 
 inibição da tradução de mRNA específicos, 
 degradação de mRNA, 
 afeta a transcrição de genes específicos. 
 
• Alvos do RNAi incluem RNA de vírus, transposons e genes do 
desenvolvimento e de manutenção do genoma. 
12/11/2013 
38 
“RNA Interference” 
• Dois tipos: siRNA e miRNA 
 
• siRNA: “pequenos RNAs interferentes” são gerados a partir de 
dsRNA exógenos e complementares ao RNA alvo 
 
• miRNA: “micro RNAs” são pequenos dsRNA (19-24 nt) 
transcritos pelo genoma (endógenos) e atuando de forma 
semelhante aos siRNA. 
 
• Embora transcritos, não são traduzidos. 
12/11/2013 
39 
siRNA 
•Mecanismo 
 dsRNA de 70 nt é 
processado pela RNase 
DICER (ds-specific) 
 ssRNA de 21 nt são 
gerados (siRNA) 
 Complexo RISC se liga a 
uma das fitas de RNA e a 
pareia com mRNA 
complementar 
 mRNA é degradado pela 
RISC 
miRNAs 
• RNA de 19-24 nt derivados de um precursor (pri-miRNA) de 70-
130 nt pela ação da Drosha 
 
• 0.2 a 0.5% do genoma do nematódeo C. elegans é formado por 
estes precursores 
 
• Afeta a tradução do mRNA ligando-se à 3’-UTR via RISC 
12/11/2013 
40 
miRNA 
Resumo: “RNA Interference” 
12/11/2013 
41 
Regulação Traducional 
Regulação Traducional 
• Iniciação da tradução pode ser bloqueada por proteínas 
regulatórias que se ligam à UTR e bloqueiam a ligação dos 
ribossomos ao mRNA 
12/11/2013 
42 
Regulação da transferrina e ferritina: metabolismo do ferro 
Regulação Pós-Traducional 
12/11/2013 
43 
Regulação Pós-Traducional 
• Existem diversas maneiras de regular a atividade de uma 
proteína 
• Modificações das cadeias laterais 
• Interação com ligante ou cofactor 
• Interação com outras proteínas 
• Direcionamento de proteínas 
▫ NLS (“nuclear localization signal”) 
▫ NES (“nuclear export signal”) 
• Estabilidade proteica e degradação 
Regulação Pós-Traducional 
• Modificações das cadeias 
laterais de aminoácidos 
 
• Fosforilação 
▫quinases 
▫ fosfatases 
12/11/2013 
44 
Reciclagem de eIF-2 
Estabilidade de Proteínas