fisio 2 - Osmorregulação depende da expressão cerebral do co

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Osmorregulação depende da expressão cerebral do co-transprtador renal Na-K2Cl – NKCC2
RESUMO
O co-tranportador NkCC2 é específico do rim. Aqui nós mostramos a expressão deste, no sistema hipotálamo-neurohipofisário cerebral (HNS), e que é regulado através de estresses osmóticos. O HNS controla a estabilidade osmótica através da síntese e liberação do hormônio neuropepitídeo argenina vasopressia (AVP). AVP chega no rim pela corrente sanguínea, onde promove a reabsorção de água. Knockdown (ler-se nokdown são animais modificados geneticamente para não expressar algum elemento do sistema fisiológico em algum lugar específico) para NKCC2 no HNS mostrou efeitos marcantes o equilíbrio do fluído seguido pela ingestão de altas doses de solução salina e maior produção de urina em ratos, concomitante com o aumento da ingestão de líquido e da osmolaridade plasmática. Assim o NKCC2 é um alvo molecular dos diuréticos de alça bumetamina e furosemida, nos perguntamos sobre os efeitos na função do HNS no balanço de água. A desidratação causa excitação de neurônios AVP (lê-se neurônios vasopressinérgicos) mediada pelo sistema GABA foi revertida por bumetamina e fluosemida, que bloqueou a liberação de AVP, ambos in vivo e amostras hipotalâmicas. Assim mecanismos cerebrais dependentes do NKCC2 regulam a estabilidade osmótica na alça diurética em ratos.
ITRODUÇÃO
A habilidade de manter o balanço de água é um requisito fundamental para vida terrestre. Em mamíferos, isso envolve a interação entre o centro de controle cerebral chamado de sistema hipotálamo-neurohipofisário (HNS) e os mecanismos de filtração nos rins.
O HNS é o produtor do hormônio neuropepitídeo antidiurético argenina vasopressina (AVP). Sintetizado no corpo celular de neurônios magnocelulares (MCNs) dos núcleos supraóptico (SON) e paraventriculares (PVN), AVP é transportado anterogradamente para o terminal da hipófise posterior. Um amento na osmolaridade no plasma é detectado por mecanismos intrínsecos de osmoreceptores do MCN, estímulos excitatórios enviados pelo MCNs, resultam na secreção hormonal. AVP chega ao rim pela corrente sanguínea onde promove a reabsorção de água no ducto coletor e reabsorção de sódio na porção descendente da alça de Henle.
O HNS também está intimamente relacionado na produção do hormônio ocitocina (OXT), que promove natriurese nos rins. Uma simples célula é capaz de expressar AVP e OXT observado pela transcrição RT-PCR, que vai ser detectada apenas na MCN, mas a expressão dos níveis RNA de cada neuropepitídeo se diferem por ordem de magnitude. Apenas uma pequena porcentagem (2 – 3 %) do MCNs tem alta expressão dos níveis de ambos os pepitídeos provocado por um aumento proporcional da desidratação.
A desidratação causa um dramático remodelamento funcional no HNS, que contribui facilitando a produção e distribuição do hormônio. microarrays tem sido usado para saber como a desidratação causa mudanças na transcrição no HNS de ratos pode mediar esses eventos plásticos. Um dos genes descobertos no HNS que são super-regulados em consequência da desidratação foi o Slc12a1, que codifica o co- transportador NKCC2, que se pensava ser específico do rim. A mediação do NKCC2 está fortemente acoplado ao movimento elétroneural de ions um Na(+), um K (+) e dois Cl (-) através da membrana celuar. No rim, NKCC2 está localizado na membrana apical de células epiteliais no TAL medeiano a reabsorção de uma porção considerável de NaCl do filtrado glomerular. AVP, age através da ativação do receptor V2 e subsequente aumento intracelular de AMPc melhorando a atividade do NKCC2 através da fosforilação e marcação da membrana.
Nesse estudo, nós testamos a hipótese se o NKCC2 dentro do HNS tem um papel no centro de integração neural dos processos de conservação da água causados por desafios osmóticos crônicos.
MATERIAL E MÉTODO
Animais e tratamento: Ratos machos Sprague dawley pesando entre 250-300g obtidos do Harlan, foram mantidos em temperatura constante 22ºC com umidade relativa de 50-60% (v/v) em 14:10 horas de ciclo claro/escuro. Os ratos tiveram livre acesso a comida e água nas semanas antes do início do experimento. Para induzir o estresse de hiperosmolaridade, a água foi retirada 3 dias (desidratação) ou substituída por água salina a 2% por 7 dias (sobrecarga salina) comida ficou disponível ad libitum. Para resposta aguda de elevação da osmolaridade plasmática foi feita uma única injeção intraperitoneal de NaCl à 1.5M (1.5 mL/100g de peso corporal). Os ratos foram distribuídos randomicamente em 6 grupos: controle; 10 min, 20 min, 30 min; e 1,2 e 4 h após a administração de salina hipertônica. O grupo controle teve livre acesso a água e comida em todo o tempo de experimento. Após a injeção de salina hipertônica os animais retornaram para as caixas com a remoção da água em todo o período experimental. No protocolo de tratamento com furosemida foi administrado uma única injeção subcutânea de veículo ou 20mg/kg de furosemida, seguida de 24 horas de ração com deficiência de sódio (0,001% sódio) e sem acesso a água. Todo o experimento animal foi realizado entre 10:00 da manha e 1:00 da tarde. Todo protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de ética.
Vasopressina, osmolaridade e hematocrito. Após a decapitação o sangue foi coletado em tubos eparinizados. Osmolaridade plasmática foi mensurada em osmômetro (modelo 5004; precision sistem), baseado no método de depressão do ponto de congelamento, e expresso em mOsm/kg H2O. O hematócrito foi determinado utilizando pequenas alíquotas do sangue coletado em tubos capilares e expressos em percentagem de células no sangue. AVP foi extraído em 1mL de plasma em acetona e éter e mensurado usando anticorpo específico para AVP (península T4561) por radioimunoensaio. O coeficiente de sensibilidade experimental, intra-experimental e interexperimental variou 0.7 pg/mL 8.1% e 10.7%.
Extração de RNA e síntesi de cDNA. Ratos foram anestesiados e decapitados, o cérebro foi imediatamente congelado em gelo seco. Para coletar amostras dos núcleos supraoptico e paraventricular (SON e PVN respectivamente) 1mm de microperfuração (Fine Scientific Tools) foi realizado com 60µm da secção coronal no criostato, as secções foram mantidas em lâminas de vidro com 2%( w/v) de tolueno azul, para visualização dos núcleos crebrais desejados em microscópio opitico. Usando o quiasma do (SON) ou de neurônios mediolaterais do terceiro ventrículo do PVN, foram retiradas amostras do cérebro congelado e “fatiados” no crioestato em tubos d 1,5mL com gelo seco. O RNA total foi extraído pela combinação do reagente QIAzol com o protocolo do kit Qiagen’s RNeasy. As amostras perfundidas foram retiradas do gelo seco e rapidamente resuspendida, vortexando em 1 mL do reagente QIAzol. Segundo da separação de fases que foi feita com 300μL de clorofórmio e a fase aquosa foi removida, misturando com de 350μL de etanol 70% (v/v) e colocados nas colunas de RNeasy. As etapas seguintes foram realizadas como as recomendações dos fabricantes. Para a síntese do cDNA 100ng do RNA total foi tratado com DNAse I (Qiagen) e trancriptase reversa usando QuantiTect reverse transcription kit (Qiagen).
Análise do RT qPCR. Os níveis estáveis de RNA do SON e do PVN foi avaliado por qPCR (PCR quantitativo). Slc12a1 primer QuantiTect realizada por Quiagen, primer RPL19 (iniciado-5’-GTCCTCCGCTGTGGTAAAAA-3 e reverso-5’-GGCAGTACCCTTCCTCTTCC-3), GAPDH iniciado-5’-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3 e Reverso-5’-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3), GFP iníciado-5’-ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCC-3 e Reverso-5’-TGAAGTCGATGCCCTTCAGCTC-3), e AVP (iniciado-5’-TGCCTGCTACTTCCAGAACTGC-3 e Reverso-5’-AGGGGAGACACTGTCTCAGCTC-3). Foram desenhados usando OligoPerfect (Invitrogen Life Technologies) ou Eurofins Genomics tools. A otimização e validação dos primers foi feita utilizando a curva do protocolo ABI. O cDNA da reação de RT foi usado como molde para a subsequente PCRs, que foi feito em duplicata. PCR quantitativo foi realizado em 25μL de SYBR Green Master Mix (Roche) no sistemade detecção de sequencia ABI 7500. A análise da curva de dissociação foi realizada para todos os PCRq. Para a quantificação da expressão gênica foi utilizado o método de 2-Δ ΔCT. Analise do gene de controle interno desta análise foi o gene “housekeeping” RPL19.
Geração do NKCC2 riboprobes. RNAm Slc12a1 foi detectado por hibridização in situ utilizando duas sequencias misturadas de marcação intensa e específica. As sondas foram geradas usando a transcrição reversa de RNAm de cérebro de ratos por PCR, 2.5U AmpltTaq polymerase (applied Biosystems), e os primers específicos de rato Slc12a1(GrenBank acession no. NM_019134) sonda 1 bp 1783–2767: 5’-GCGAATTCTCAGTGCACCCAAAGTATTCC-3’ e 5’-GCAAGCTTAGAGCCAGTCTCTCCTGTTCC-3 e sonda 2, bp 2601–3332: 5’-GCGAATTCAGGAAAGCTCCCTTGTCTGAG-3 e 5-GCAAGCTTGACTGCTTCCAGTTCTGCATC-3’). Foi incluído nos primers para reconhecimento da sequencias de restrição EcoRI e HindIII para permitir a clonagem dos produtos de PCR do vetor de geração pGEM4Z (Promega). A integridade das sondas foi verificada pelo sequenciamento do DNA. Ribobrobes senquencial e reverso foram gerados usando polimerase T7 e S6 com [S35] UTP e o Kit de transcrição in vitro MAXscript. 500ng do molde de DNA foi adicionado 1μl d 10X da solução de transcrição; 0.5 μl de ATP, CTP e GTP; 2,5 μl de S35UTP; 0,5 μl SP6 (sequencial) ou polimerase T7 (reverso); e H2O deionizada para completar o volume final de 10 μl. Esta mistura foi incubada por 30 min à 37ºC, depois o molde de DNA foi removido com a adição de 0,5 μl DNase e 0,5 μl de RNase por 15 min à 37ºC. Os riboprobes foram precipitados pela adição de 190 μl da solução TE, pH 7,6; 5 μl tRNA (10mg/ml); 80 7,5 N-NH4 Ac; e 700 μl de EtOH por 15 min em gelo isso seco. Depois essa mistura foi centrifugada por 15 min a 4ºC. O pelet de RNA foi lavado com 1ml de etanol 70% e ressuspendido em uma solução contendo 97 μl TE, 2 μl SDS 10% e 1 μl DTT 5M. Os riboprobes foram hidrolizados em aproximadamente 200 fragmentos de pares de bases contendo 100 μl de H2O deionizada com 2X solução de carbonato (80 mM NaHCO3 e 120 mM de Na2CO3) por 30 min a 60ºC. Os riboprobes hidrolisados foram precipitados e neutralizadoscom 10 μl de ácido acético 10% e analisado pela experimentação de hibridização in situ.
Hibridização in sito de baixa resolução. Os ratos foram eutanziados por deslocamento de cervical e decapitados. Cérebro e rim foram rapidamente removidos e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. Foram feitas secções coronais (12 μm) contendo tecido do inicio do SON ao final do PVN em secções transversas (12 μm) de rim foram cortadas no criostato (Cryocut CM3050; Leica Microsystems) e estocado à -80ºC. No dia da fixação, a lamina montada foi removida do -80ºC e colocada em temperatura ambiente por 15 a 20 min. As secções foram fixadas com paraformolaldído 4% 1X da solução PBS (feita nos últimos 7 dias e estocada à 4ºC) por 5 min em temperatura ambiente e lavadas duas vezes com PBS. As secções foram colocadas em anidrido acético 0,25% (w/v) em 0,1M de HCl trietanolamina 0,9%(w/v) e NaCl por 10 min em temperatura ambinte, depois foram desidratadas adição de etanol; lavados com clorofórmio por 5 min e lavados com etanol por 1 min e finalmente essas secções foram secadas. Riboprobes marcados (50000 – 100000cpm) foram diluídos em 45μl de solução de hibridização com formolaldeído deionizado 50%, 4X SSC (1X SSC 0,6N +0,06m Nacl + citrato de sódio, pH7,0), 500mg/ml do estoque de DNA, 250mg de RNAt, 1X de solução de Denhardt 0,02%, polyvinyl pyrrolidone 0,02% e BSA 0,02%, e 10% de dextrano fosfato. Os cortes foram transferidos para laminas de vidro e incubados por toda noite à 55ºC. No dia seguinte as laminas colocadas em SSPE, e depois lavadas em 4,2 e 1% com SSPE por 15min à 37ºC, as laminas foram lavadas novamente em SSPE1% á 60°C em dois tempos de 30 min depois foi adicionado a lavagem 70, 80,90, 95 e 100% de etanol por 1 min em temperatura ambiente. As laminas secas foram colocadas em hiperfilm com C14 em filme de autoradiográfico por 3 dias para o rim e 7 dias para o cérebro. Depois os filmes revelados foram observados em microscópio, as imagens foram capturadas com a câmera e analisada com o software NIH ImageJ. O sinal da densidade de hibridização foi comparada com a densidade óptica e feita a escala. Os resultados foram expressos em ambas as escalas, normalizadas e expressas em razão do controle. Quatro secções de intervalos regulares do SON ou do PVN de cada rato foi analisada e duas foram selecionadas para estabilizar a ligação não específica. 
Hibridização in situ de alta resolução. Para obtenção de imagem de alta resolução, as laminas hibridizadas foram lavadas em emulsão de submersão. No escuro, 30μl de glicerol 50% e 6ml de H2O foi misturada com a emulsão 5K para um volume final de 10ml e incubado à 45ºC por 20 min até que a emulsão tivesse derretida. A emulsão derretida foi colocada na câmera emussão por 20 min para que as bolhas se desfizesem. Cada lamina foi colocada no fundo do recipiente em uma solução constante e o excesso da solução foi retirado. As laminas foram guardadas em uma estante escura para secar por 2h depois guardadas em caixas pretas à 4°. Depois de 7 dias (rim) ou 21 dias (cérebro), em um lugar escuro, as laminas foram removidas das caixas pretas e colocadas em uma estante de metal e colocadas para revelar por 3,5 min. Depois de reveladas as laminas foram mergulhadas em etanol 95% por 1 min, etanol 100% por 1min e tolueno azul 0.5% por 1-5 min e lavada novamente com água deionizada. As laminas foram secas com ar e montadas e em DPX, convertida e observada no microscópio (LeicaDM IRB). Fotomicrografias foram feitas com a câmera digital DC-300F usando o software IM50 versão 1.2 e salva em imagem com resolução de 300 dpi. TIFF. Secção foi colocada em imersão para realização da imagem semiquantitativa. Em um aumento de 200X a contagem dos grãos foi feita em um campo luminoso com um aumento de 400X utilizando microscópio e câmera digital. O software NIH ImageJ foi utilizado para quantificar os grãos brilhosos expressos nos neurônios do SON e do PVN apenas células no mínimo 5 marcações foram usadas. Duas secções da região medial do núcleo de cada neurônio foi selecionado de cada grupo tratado. Essas secções selecionadas coincidiram entre os grupos. Para cada secção 10-15 células marcadas de mesmo núcleo foram selecionadas randomicamente para determinar o número de grãos florescentes expressos em cada célula. Foi utilizada uma função automatizada para a “análise das partículas”.
Imunohistoquímica. Ratos controle e desidratado (n=3) foram anestesiados com pentababiturico de sódio e foi feita a perfusão cardíaca com PBS 0,1M, pH7,4 seguido de paraformoladeído 4% em 0,1M de PBS. Os cérebros foram removidos e fixados durante a noite em paraformolaldeído 4% com sacarose 30% preparados em PBS. Secções coronais (40μm) foram fatiadas no criostato, lavados em 0.1M de PBS, pH 7,4 e bloqueado com soro de cavalo 10% por uma hora. As secções foram incubadas com anticorpo primário de soro de cavalo 1%, Triton X-100 3% em PBS 0.1M por uma hora em temperatura ambiente e depois à 4ºC por toda noite. Dois anticorpos de coelho anti-NKCC2 foram usados: AB3562P(1:200; Millipore) e H-110 (1:100; Santa Cruz Biotechnology). Os dados obtidos em ambos foram comparados. Os resultados obtidos com H-110 é mostrado aqui. Para análise de colocalização foi utilizado anticorpo monoclonal de recombinante de AVP (NP-II,PS41; 1:200) ou OXT (NP-I, PS38;1:200). As secções foram lavadas em PBS três vezes e incubados com anticorpo de coelho IGg (Vector Laboratories; 1:500) em PBS 0,1M contendo soro normal de cavalo 1% e Triton X-100 0,3% por 1h em temperatura ambiente. Depois foi lavado três vezes com PBS 0,1M e incubadas por 1h com ambos IGg anti-camunongo: Alexa Fluor 488-Streptavidin (1: 500; Vector Laboratories) e Alexa Fluor 594 (1:500; Vector Laboratories). As imagens foram observadas com microscópio Leica DMRB e as imagens foram capturadas na câmera DC300F e analisado nosoftware Leica IM50. O fotoshop foi utilizado para observar a colocalização do NKCC2 para AVP ou OXT.
Produção, purificação e titulação do lantivirus. A sequência marcada de RNAs Slc12a1 (GGTAACCTCTATCACTGGG) foi demonstrada anteriormente por ser específica para camundongos knockdown Slc12a1. O controle para essa sequência de nucleotídeo (GGCTTACGTAGGCATCTCA) foi realizada utilizando RNAsi Wizard v3.1. Dois oligonucleotídeos complementares para essa sequencia marcada foi gerada utilizando conversor de siRNA-shRNA com estrutura de alça TTCAAGAGA e clonado dento do vetor de expressão RNAi. A sequencia U6shRNA foi amplificada (5’-CCTTAATTAAGGCGACTCACTATAGGGCGAATTGGG-3’ e 5’-CCCGCTCGAGCGGCTAGTGGATCCCCCGGGCTG-3’; letras em itálico epresenam sítios das enzimas de restrição PacI e XhoI, utilizando uma polimerase de alta afinidade com DNA e clonado nos sítios de restrição compatível do vetor lentviral pRRL.SIN.U6.shRNA.CPPT.CMV.GFP.WPRE (engineered from Addgene plasmid 12252). A transficção do do vetor foi realizada em células Stbl3 para reduzir a recombinação de homólogos. Toda a formação do plasmídio foi purificado pelo kit Maxiprep using PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep (Invitrogen). O vírus foi gerado pela transfecção transiente do vetor de transporte associado a plasmídeos separados (pMDLg/pRRE, pRSV-Rev, e PMD2.G; Addgene) em células HERK293T, pelo método de fosfatase de cálcio descrito anteriormente. O sobrenadante contendo o lentvirus foi coletado 48 e 72 horas após a transfecção, detritos celulares foram removidos após centrifugação e o sobrenadante foi filtrado em um filtro de 0,45μm. Lentvirus de alta titulação foram produzidos através de uma centrifugação de 400ml à 6000xg por 16 h, o sobrenadante foi resuspenso em 10m de PBS e submetidos a ultracentrifugação pó 1,5h à 20.000xg. o pelllet vral foi ressuspenso em 150μl de PBS e estocado em alíquotas de 5μl à -80ºC. a titulação viral foi determinada em células positivas a GFP três dias depois a transdução da célula HERK293T.
Transfecção do vetor gênico do lentivirus no SON e no PVN. Os ratos foram anestesiado e submetdos à cirurgia estereotaxa para injeção diretamente no SON e no PVN de 1μl do vetor do lentiviros com concentração 5x109 partículas/ml.. Ao final da cirurgia a anestesia foi revertida, e os animais foram alocados individualmente por duas semanas, depois desse período os animais foram colocados nas gaiolas metabólicas para avaliação do consumo de líquido, ração, volume urinário, osmolaridade da urina e peso corporal durante 10 dias, após esses dez dias o sangue desses animais foi retirado por pulsão cardíaca e os animais submetido a perfusão cardíaca com 100ml/100g de peso corporal de paraformoladeido 4% em PBS, pH 7,4. A osmolaridade urinária e plasmática foi mensurada através de micro-osmometro (CamLab).
Mapeamento e atribuição dos grupos. Secções coronais hipotalâmicas injetadas com o vírus (40μm), a expressão de GFP foi observada um campo amplo do microscópio fluorescente com filtro 488nm utilizando. Foi considerado para posteriores análises os animais que possuíam três ou quatro lâminas no PVN e no SON. 
Eletrofisiologia. foram utilizados ratos transgênicos que expressam GFP para promover produção de AVP. Esses animais foram anestesiados, decapitados e o cérebro foi rapidamente removido e submergido em solução saturada (Leica) contendo (0°C, 95% O2/5% CO2) e adicionado 87 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 25 NaHCO3, 25 D-glucose, 1.25 NaH2PO4, and 75 sucrose. As laminas foram observadas em microscópio com infravermelho e preenchidas com solução HEPES e 1 K2-EGTA, 4 K2-ATP, 0.3 Na3-GTP. Os dados de patch-clamp e voltage-clamp de uma única célula foi analisado. A membrana foi estabilizada em 10nV por dois minutos para avaliar as correntes sinápticas, essa técnica foi utilizada para analisar a corrente GABA.
Explantes hipotalâmicos. Este protocolo foi descrito previamente. Animais foram eutanaziados por decapitação, o cérebro imediatamente removido e a região médio-basal do hipotálamo foi retirada e incubada por 60 min em movimento com 0,5ml de solução Krebs (KRBG; 0.9% w/v NaCl; 5.75% w/v KCl; 10.55% w/v KH2PO4; 9.27% w/v MgSO4*7H2O; 1.23% w/v NaHCO3; 6.1% w/v CaCl2; and 0.1% w/v glicose e 0.004% w/v bacitracin; osmolaridade 280 mOsm/kgH2O,pH7.4), para lavar a amostra , depois essa solução foi cuidadosamente removida e substituída por soluções KRBG isotônica (280 mOsm/kg H2O) ou hipertônica (340 mOsm/kgH2O) contendo diferentes concentrações de furosemida (0.1 à 100μM em 0.9% w/v NaCl) durante 30 min. Nessas amostras foram excluídos todos os órgão circuventriculares osmossensível que contribuem para secreção de AVP, um grande aumento na osmolaridade (60 mOsm/kg) é necessário para observar uma resposta secretória. No final da segunda incubação o meio foi coletado e estocado à -20º para análise de AVP por radioimunoensaio. A osmolaridade da solução KRBG foi manipulada pela adição de salina hipertônica e confirmada pelo método de depressão do ponto de congelamento (Model 5004 osmometer; Precision Systems).
Análise estatística. Todos os resultados foram expressos em média ± desvio padrão, a diferença entre os grupos no qPCR foi analisada utilizando test T. e ANOVA de duas vias seguida do teste de Fisher ou Dunn para comparação de mais de 3 grupos. foi considerado estatisticamente diferente quando p0.05.
RESULTADOS
Transcrição do Slc12a1 expressas em HNS
A análise do experimento assimétrico sugere que o gene Slc12a1 “específico” para rim, foi expresso no SON e PVN participando positivamente da prevenção dos efeitos da desidratação por 3 dias. Confirmado no qPCR (figura 1A) , e também mostrou aumento na sua expressão depois de 7 dias de sobrecarga salina. A superregulação da expressão do Slc12a1 no PVN e no SON é acompanhada de estímulos osmóticos, evidenciados por 1 dia de desidratação ou sobrecarga de sal (fig 1B). de fato o estímulo osmótico agudo pela injeção intraperitoneal de salina leva ao aumento significativo da expressão de Slc12a1 após 240 min no SON e após 120 e 140 min no PVN (fig 1C)
Distribuição espacial da expressão do NKCC2 no SON e no PVN
Futuras validações foram obtidas por hibridização in situ. Sondas do cRNA foram primeiro testadas no rim. Enquanto as sondas produzidas foram de sinal fraco para a sinalização não específica (fig 1D, a ser inserida) as sondas reversas tiveram uma marcada presença da transcrição do Slc12a1 no córtex e na medula renal, como esperado (fig 1D). a expressão do Slc12a1 tanto na medula quanto no córtex renal foi super-regulado pela desidratação (Fig. 1D; medula: controle 1 ± 0.108, desidratado: 1.368 ± 0.118, p = 0.052, n = 4; cortex: control 1 ± 0.123, desidratado 1.494 ± 0.130, p = 0.032, n =	 4), o que consiste com o aumento da proteína do NKCC2 no rim demonstrado anteriormente em consequência da restrição de água. Importantemente, foi detectado a presença do RNAm do Slc12a1 no SON tanto nos controles quanto nos animais desidratados por 3 dias (fig1E), (controle 1 ± 0,0109, desidratado 1 ± 0,167, p = 0,019, n = 5). A análise de hibridização in sito de alta resolução sugere que o gene Slc12a1 e expresso em MCNs (Fig 1F).
A contagem dos grãos detectou um aumento da expressão do Slc12a1 no SON (controle 1 ± 0.076, desidratado 1.585 ± 0.131, p = 0.005, n =	 5; dados não mostrados: controle 45.5 ± 7.21, desidratado 67.4 ± 12.41, p =	 0.00469), e aumento da expressão celular (controle 1± 0.122, desidratado 2.973 V 0.234, p = 0.00007, n = 5; dados não mostrados: controle 33.3 ± 9.09, desidratado 99 ± 17.45, p 	= 7.155E-05). no PVN, não foi detectado transcrição do Slc12a1 nos animais controle e normohidratado, mas foi observado expressão deste em animais desidratados (fig 1E). A hibridização in situ de alta resolução mostrou uma marcante expressão na subdivisão magnocelular e uma menor expressão em células parvoventriculares (Fig. 2; magnocellular 71.4 ± 14.25 grãos/ célula, n =10; parvocellular 32 ± 7.97, n = 6 , p = 	 7.495E-5). A expressão de Slc12a1foi mais expressa em células magnocelulares do que em células parvoventriculares (magnocellular 61.33 ± 8.33, parvocellular 14.33 ± 7.77; p = 0.002, n = 3).
NKCC2 é expresso em neurônios AVP e OXT após desidratação.
Nós nos perguntamos se a transcrição do Slc12a1 no HNC são traduzidos. Baixos níveis de imunoreatividade com afinidade a NKKC2 são observados no SON em ratos normohidratados, no entanto uma marcante expressão é observada após 3 dias de desidratação (fig 3). Neurônios AVP e OXT contém material imunoreativo NKCC2 (fig 3).
	Sobrecarga de sal afeta o equilíbrio dos fluidos em ratos knockdown para expressão de Slc12a1.
Para testar a hipótese que o NKCC2 no HNS tem um papel central na integração dos processos de conservação de água após mudanças osmóticas crônicas, nós usamos lentivirus mediando a disponibilidade de shRNA em animais knockdown para Slc12a1 no SON e no PVN. Primeiro nós testamos a eficiência dos animais knockdown. Nós marcamos a cascata de GFPe, e observamos uma eficiente distribuição do lentivirus em neurônios AVP, tanto no PVN quanto no SON (fig 4A). No PVN de ratos com sobrecarga salina, a injeção do lentivirus expressando shRNA específico de Slc12a1 houve uma significante diminuição da transcrição d Slc12a1 nos controles (n=	8, p=0.018; Fig. 4B) mas não houve efeito no RNAm de AVP (fig 4C). Em experimentos separados, nós observamos que a sobrecarga de sal mostra uma significante diminuição no consumo de líquido (fig 5A), na excreção urinária (fig 5B), mas não na osmolaridade urinária (fig 5C), em animais transduzidos no PVN e no SON com lentivirus expressando shRNA contra Slc12a1 ou lentivirus expressando shRNA. Comprado com o controle, animais knockdown para Slc12a1 no SON e no PVN, em condições de normohidratação não demonstrou efeito na excreção urinária (fig 5A), consumo de líquido (fig 5B) e na osmolaridade urinária (fig 5C). No entanto, após a sobrecarga salina animais knockdown Slc12a1 aumentam a excreção urinária (significante nos dias 5-7; fig 5B), mas não teve efeito na osmlaridade urinária (fig 5C). Importantemente, no final do experimento após 7 dias de sobrecarga salina, nós observamos um aumento na osmolardade plasmática como consequência dos knockdown para Slc12a1 (fig 5D).
Desidratação leva a uma excitação em neurônios AVP mediada por GABA, que é revertida por Bumetamina. 
Super-regulação do NKCC2 em neurônios magnocelulares durante a desidratação, previne um aumento da entrada de Cl- nas células, resultando em uma mudança na despolarização revertendo o potencial do receptor GABAa (GABAaR) mediado por correntes sináptica (EGABA). Para testar isso, nós fizemos registros eletrofisiológicos de cortes do PVN preparados de ratos controle e de ratos submetidos a 3 dias de desidratação. Neurônios magnocelulares expressando AVP foram identificado pela expressão de eGFP direcinado pelo promotor de atividade de AVP e pela característica eletrofisiológica peculiar dos neurônios magnocelulares. Utilizando registro de células isoladas, nós verificamos a relação entre a voltagem da membrana pós-sináptica e a amplitude de eIPSCs nos cortes controle (fig 6). Esse experimento foi repetido após 3 dias de desidratação e nós observamos uma significativa mudança na despolarização EGABA (Fig. 6; control: -60 ± 0.8 mV, n = 18;e desidratado: -54.7 ± 0.5, n =	 8, p = 0.001). A inibição do NKKC2 nos cortes de ratos desidratados pela bumetamida (50 -100μm) causou uma significante mudança hiperpolarizante EGABA (57.7 ± 0.7 mV, n =	 10, p 0.05), indicando que o NKCC2 dependente da acumulação de Cl- durante a desidratação.
Furosemida bloqueia a liberação de AVP.
O NKCC2 é um alvo molecular dos diuréticos de alça como a bumetamina e furosemida, que são comumente usado na clinica para tratamento de edemas causados por insuficiência cardíaca congestiva, um possível efeito dessas drogas na função HNS em paciente cominsuficiência de hidratação, pode agora ser considerado. Depois nós nos perguntamos se a furosemida é afetada por 24h de desidratação, nesse tempo, observamos um marcante e significante aumento na expressão de Slc12a1 no SON e no PVN (fign1B). Como esperado, a desidratação por 1 dia leva à um aumento na osmolaridade plasmática (fg 7A), hemaócrito (fig 7 B) e AVP (fig 7C) comparado com o controle em todos os ratos( p). Em contraste, ratos tratados com furosemida (20mg/kg de peso corporal) apresentou aumento no hematócrito, sem alteração na osmolaridades plasmática e uma marcante redução plasmática de AVP, comparados ao controle (fig 7 D; p).
Nós calculamos que as doses periféricas de 20mg/kg de furosemida pode resultar em uma concentração de ~ 12,59 de CSF, assim 99% da furosemida está ligada a proteínas plasmáticas não sendo capaz de atravessar a barreira hematoenefálica, e apenas 0,75% da furosemida é capaz de atravessar esta barreira. Nós nos perguntamos então, se baixas doses de furosemida (0,1 - 100μM) pode inibir a hiperosmolaridade induzida pela sereção hipotalâmica de AVP. Primeiro nós demonstramos que a incubação de amostras hipotalâmicas com solução hipertônica de KRBG (340 mOsm/kg H2O) leva á um aumento na liberação de AVP (9.5 ± 3.5 vs 30.4 ± 7.6 pg/mg protein, p = 0.05) comparado com condições isso-osmóticas (280 mOsm/kg H2O; Fig. 8A). A adição de furosemida em solução hipertônica é capaz de reverter o aumento da liberação de AVP em todas as concentrações (Por exemplo, sem furosemida: 30.4 ± 7.6 pg/mg proteína; 10mM furosemida: 14.3 ± 1.5 pg/mg proteína; p 0.05; Fig.8B). Mesmo nas concentrações mais baixas a furosemida foi capaz de atingir o efeito máximo, sugerindo que é um potente inibidor da liberação de AVP.
Figura 1. Expressão da transcrição do gene Slc1a1 no SON e no PVN. A, um significante aumento da transcrição do Slc12a1 no SON e no PVN de ratos desidratados por 3 dias(DH). B, um significante aumento da transcrição do Slc12a1 no SON e no PVN de ratos de ratos com sobrecarga salina por 1 dia (1dSL) ou 1 dia de desidratação (1d DH). C, após injeção intraperitoneal de salina hipertônica, um grande aumento da transcrição do Slc12a1 é observado após 240 min no SON e em 120 e 240 min no PVN *p0.05, **p0.01, and ***p0.001.D, hibridização in situ de baixa resolução da expressão de Sc12a1 transcrito no rim de animais controles e desidratados por 3 dias foi observado. Esses dados mostrados em figura ilustrativa de sinalisação baixa, inespecífica, foi produzida apenas para sonda direta de rim desidratado. Experimentos diretos e reversos foram realizados no mesmo tempo. C córtex, M medula. E hibridização in situ de baixa resolução da expressão do Slc12a1 transcrito no hipotálamo de animais controles e desidratados por 3d (SON e PVN). F hibridização in sito de alta resolução da expressão do Slc12a1 transcrito no SON de animais controles e desidratados por 3d visto em ampliação baixa (10x) ou alta (100x). CT, controle.
Figura 2. Distribuição do RNAm do Slc12a1 no PVN de ratos desidratados. Fotomicografia representativa mostrando a distribuição do RNAm do Slc12a1 no PVN pó hibridização histoquímica in situ. A, proeminente marcação foi observada na região magnocelular comparada co PVN, assim baixa expressão foi observada nas regiões parvocelulares. O parâmetro de distribuição pode ser observado claramente em B, alta marcação fotomigraficas das subdivisões magnocelulares e parvocelular são mostradas em C e D respectivamente ( indicados nas caixas em B). As células apontam células exprssando a transcrição do Slc12a1, onde neurônios magnocelulares apresentam maior nível de expressão. Barra de escala: A,B100μm; C,D 50 μm . PaLM, porção magnocelular do PVN; PaMP, porção medial parvocelular; PaV porção ventral.
Figura 3. NKCC2 é expresso em neurônios vasopressinérgicos e ocitocinérgicos após desidratação. Himunocitoquimica revela que a transcrição do Slc12a1 expressas no SON são translocadas dentro de regiões com afinidade NKCC2 e são colocalizados em AVP e OXT. Isto é evindencido particulamenete, em imagem com focal de alta magnitude. Comparandoos baixos níveis de material com afinidade NKCC2 em animais normohidratados (EH) com animais desidratados por 3d (DH) revelam um aumento da imunoreatividade após estimulação osmótica.
 
Figura 4. Expressão de GFP marcado com vetor lentiviral expressando Slc12a1 específico shRNA reduz os níveis de RNAm de Slc12a1.a distribuição do lentivirus no PVN e no SON é evidenciado pela marcada expressão do eGFP marcado. A colocalização revela que eGFP é expresso em neurônios contendo imunoreatividade com afinidade AVP. Lentivirus interfere na distribuição de um shRNA direcionada especificamente para transcrição Slc12a1 reduzindo o nívem de RNAm do Slc12a1 no PVN cm sobrecarga salina comparados com animais com a mistura de RNA shRNA (B), mas não observamos efeito significante na transcrição de AVP (C).
Figura 5. Knockdown para expressão de Slc12a1 afeta o balanço do equilíbrio dos flúidos após sobrecarga salina. Impacto do shRNA através do gene Slc12a1 em animais knockdown no PVN e no SON sobre o balanço dos fluidos comparados com animais shRNA. Parâmetros fisiológicos foram monitorados por 10 dias consecutivos, com animais desidratados por 3d seguido de sobrecarga salina por 7 d. excreção urinária (A), consumo de líquido (B) e osmolaridade urinária (C). no final do experimento o plasma foi coletado para avaliação da osmolaridade (D) AVP plasmático (E).
Figura 6. Desidratação causa mudança na despolarização EGABA através de mecanismos sensíveis a bumetamina. Gravação de uma única célula mostrou que desidratação por 3d leva à mudança na despolarização EGABA, onde a aplicação d 50-100μM de bumetamina reverteu parcialmente, mas significativamente a mudança na polarização induzida pela desidratação. Os traçados foram realizados com potenciais -78, -68,-58,-48 e -38mV. Calibração: 20pA e 10ms.
Figura7. Efeito da desidratação e do tratamento com furosemida no AVP plasmático. A-C aumento significante na concentração plasmática de AVP associado com aumento na osmolaridade plasmática e hematócrito em ratos com1d de desidratação (DH). Controle D-F aumento significante na concentração plasmática de AVP mas sem mudança na osmolaridade plasmática e com aumento nos hematócritos em animais tratados com furosemida
Figura 8. A baixa concentração de furosemida inibe a hiperosmolaridade induzida pela liberação hipotalâmica de AVP. A efeito da liberação de AVP pelo MBH diferiu 280mOsm/kg H2O. B, efeito de 0,1; 1; 10 e 100μM de furosemida na liberação de AVP pelo MBH induzida pela hiperosmolaridade.
DICUSSÃO
Pela primeira vez nós demonstramos que o gene Slc12a1 codifica o co-transprtador NKCC2 em cérebro de ratos. Em animais normohidratados essa expressão é bem baixa tanto no PVN qunto no SON, mas é aumentada com estímulos crônicos de desidratação ou por sobrecarga salina (em 1 dia) e por estímulo agudo de injeção de salina hipertônica por via intraperitoneal. Imunoreatividade para NKCC2 é encontrado tanto em neurônios vasopressinérgicos quanto ocitocinérgicos. Knockdown para o gene Slc12a1 no SON e no PVN possuem grandes alterações de fluido em ratos com sobrecarga salina produzindo mais urina do que os controles injetados com shRNA, concomitantemente com o aumento do consumo de solução salina hipertônica. Apesar da osmolaridade da urina não ter sido alterada, a osmolaridade plasmática foi aumentada em knockdown par Slc12a1. Drogas que inibem a atividade do NKCC2 afeta a atividade HNS excitando neurônios vasopressinérgicos via GABA levando a desidratação, foi revertido por bumetamina e furosemida, revertendo a liberação de AVP in vivo e em amostras hipotalâmicas.
 	NKCC2 era conhecido por ser específico do rim. Nós aqui demonstramos que esta proteína também é expressa na região cerebral que regula a homeostase de água. Surpreendentemente este é expresso no HNS, uma região produtora de hormônios peptídeos que são responsáveis pela função renal. Assim o mesmo gene tem sido recrutado centralmente e perifericamente para participar de um papel crucial no mecanismo do balanço de água e sal. Em nível renal, no que se diz repeito a biossíntese e função o NKCC2 é regulado pelo AVP, agindo via receptotes V2 pela via do AMPc . Notamos que os receptores V2 tem sido descrito em neurônios, onde medeiam uma sinalização autócrina da liberação somatodendrítica de AVP em condições hipo-osmótica, portanto, melhorando a atividade do canal iônico sensível a volume e facilitando a regulação do volume celular. Além disso, é observado o aumento dos níveis de AMPc no SON e no PVN após estímulos osmóticos, e uma liberação somatodendrítica intranuclear de AVP é aumentada pela hiperosmlaridade. Assim é intrigante especular o AVP como fonte endócrina (agindo no rim), ou como uma fonte parácrina/autócrina (dentro do SON e do PVN), agindo no mesmo receptor e sinalizando a síntese e a atividade do NKCC2.
Nosso experimento de hibridização in situ não detectou nenhuma expressão do Slc12a1 em nenhuma região hipotalâmica fora do SON e do PVN. No entanto, nós não realizamos uma região maior do cérebro, uma vez que nosso objetivo foi validar nossos dados. Dito isso nossa análise de neurônios do lobo intermediário da hipófise, do núcleo do trato solitário, da área prostrema e do órgão subfonencial tanto em animais controles quanto desidratados sugere que o gene Slc12a1 não agem nessas regiões osmorreguladoras do cérebro. 
Embora nossos resultados de himunocitoquímica revelou tanto neurônios vasopressinérgicos quanto ocitocinérgico, nosso trabalho é baseado em estudos anteriores. A liberação de AVP é regida pela frequência de disparo do MCN que por sua vez é regulado pela atividade sináptica. O SON e o PVN são densamente inervados por aferências GABAergicas. Em cérebros adultos, GABA é um neurotransmissor inibitório. A baixa concentração extracelular de Cl- em cérebros adultos, causa a inversão do potencial GABA (EGABA) para um potencial relativamente mais negativo levando a hiperpolarização da membrana consequentemente abrindo canais GABAAR. no entanto, uma alta concentração extracelular de Cl- causa uma mudança no potencial de repouso despolarizando EGABA que atenua a hiperpolarização dependente de GABAAR, ou causa despolarização dependente de GABAA. Recentemente, tem sido mostrado que GABA é excitatório em neurônios vasopresinérgicos e esse efeito é potencializado pelo estresse osmótico cônico por sobrecarga salina. Esses pesquisadores atribuem esse efeito ao co-transportador NKCC1, codificado pelo gene Slc12a2. Nós sugerimos que o NKCC2, produzido pelo gene Slc12a1 também pode ser importante nesse contesto. Embora sejam estruturalmente parecidos, NKCC1 e NKCC2, diferem em propriedades funcionais, regulação transcricional e modulação da atividade pós-transcricional, que podem contribuir com seu papel relativo na função de neurônios vasopressinérgicos. Se NKCC2 inicia um papel similar em neurônios ocitocinérgico, no contexto de lactação, continua sendo estudado.
Nós mostramos que o gene Slc12a1 também é expresso na porção parvoventricular do PVN após a desidratação (fig 4). Esses neurônios se projetam para zona externa da eminência mediana, mediando assim resposta ao estresse, e para áreas pré-autonômcas, incluindo células da coluna intermediolaterais da medula espinhal e ventrolateral rostral da medula, que são componentes chave do sistema nervoso simpático que regulam a pressão sanguínea e frequência cardíaca. Nós não atribuímos uma função específica da expressão do Slc12a1 expresso em neurônios parvocelulares, mas observamos um aumento da pressão sanguínea após a desidratação, que é mediado pelo aumento da atividade do nervo simpático. É possível que a excitação de neurônios parvocelulares do PVN seja via GABAérgica, que pode ser devido a uma ativação do sistema nervoso simpáico. Este mecanismo pode ser uma explicação para etiologia da hipertensão neurogênica.
Finalmente nós observamos que o NKCC2 é um alvo molecular dos diuréticos de alça bumetamida e furosemida, drogas comumente usadas no tratamento de pacientes com edemascausados por insuficiência cardíaca congestiva. Tanto a furosemida quanto a bumetamina são capaz de atravessar a barreira ematoencefálica, os possíveis efeitos destas drogas no HNS, agora devem ser considerados, principalmente em pacientes com desidratados.