apostila pratica de bioquimica

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APOSTILA DAS AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA
Profa. Ana Célia Ruggiero 
CURSO DE FARMÁCIA 
ANO 2016�
PRÁTICA 1 - CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS - 
INTRODUÇÃO
Ácidos concentrados hidrolisam e desidratam carboidratos formando furfurais ou hidroximetilfurfurais, aldeídos derivados do furano, Na presença de derivados fenólicos ocorre formação de complexos coloridos.
Figura 1 – reação de formação do furfural a partir da ação de ácido forte sobre uma pentose
Figura 2 – reação de formação do hidroximetil furfural a partir da desidratação de uma hexose. 
Carboidratos, que apresentam em sua estrutura molecular os grupos aldeído ou cetona livres, apresentam poder redutor e são denominados açúcares redutores (Figura 3). 
Figura 3 – Reação de oxidação-redução entre aldose e os ions Cu 2+.
OBJETIVOS
Mostrar que açúcares, que se desidratam em furfurais ou hidroximetilfurfurais na presença de ácidos minerais concentrados, complexam-se com fenóis e seus derivados de forma característica, permitindo a identificação qualitativa dos mesmos. Mostrar como os carboidratos podem reduzir íons cúpricos (Cu2+) a íons cuprosos (Cu1+), resultando numa mistura de açúcares ácidos. Os açúcares capazes de reduzir tais agentes são denominados açúcares redutores. O amido é identificado através da reação com o iodo molecular que interage com as hélices da amilose formando um complexo de coloração azul escura. 
PROCEDIMENTOS 
1. Reação de Molisch
Indica qualitativamente a presença de carboidratos em geral que formam furfurais (pentoses) ou hidroximetilfurfurais (hexoses) pela ação desidradante de ácidos concentrados na presença de (-naftol.
Prepare cinco tubos de ensaio e coloque 1,0 mL das seguintes soluções em cada tubo:
- Tubo 1: 1,0 mL de água (branco);
- Tubo 2: 1,0 mL da solução de amido 1%;
- Tubo 3: 1,0 mL da solução da sacarose 0,1 mol.L-1;
- Tubo 4: 1,0 mL da solução da glicose 0,1 mol.L-1;
- Tubo 5: 1,0 mL de solução da sacarina 0,1 mol.L-1.
Adicione 1,0 mL do Reativo de Molisch em todos os tubos e agite. A seguir e coloque 2,0 mL de ácido sulfúrico concentrado vagarosamente pela parede do mesmo, sem agitar. Observe. O que ocorre? Explique. 
2. Reação de Seliwanoff (para cetoses)
Ceto-hexoses produzem furfurais mais rapidamente que aldo-hexoses, permitindo diferenciá-las pelo aparecimento rápido da coloração vinho.
Prepare os tubos: 
- Tubo 1: 1,0 mL de glicose 0,1 mol.L-1
- Tubo 2: 1,0 mL de frutose 0,1 mol.L-1
- Tubo 3: 1,0 mL de água destilada (branco).
Adicione 1,5 mL de ácido clorídrico concentrado e 0,5 mL do reativo de Seliwanoff. A cada um dos tubos. Aqueça em banho-maria fervente por 15 segundos. O que acorre? Por quê?
3. Reação de Bial (para pentoses)
Pentoses desidratadas por ácidos concentrados originam furfurais. Estes na presença de orcinol formam complexos de cor verde.
Prepare os tubos: 
- Tubo 1: 1,0 mL de glicose 0,1 mol.L-1
- Tubo 2: 1,0 mL de xilose 0,1 mol.L-1
- Tubo 3: 1,0 mL de maltose 0,1 mol.L-1
- Tubo 4: 1,0 mL de água (branco).
Adicione em todos os tubos 2,0 mL do reativo de Bial. Aqueça em banho-maria fervente por 15 segundos. O que ocorre? O que se conclui em relação aos açúcares analisados?
4. Reação de Benedict (para açúcares redutores)
Prepare sete tubos de ensaio contendo as seguintes soluções aquosas:
- Tubo 01: 1,0 mL de água destilada (branco);
- Tubo 02: 1,0 mL da solução de glicose 0,1 mol.L-1
- Tubo 03: 1,0 mL da solução de frutose 0,1 mol.L-1
- Tubo 04: 1,0 mL da soluça de maltose 0,1 mol.L-1
- Tubo 05: 1,0 mL da solução de lactose 0,1 mol.L-1
- Tubo 06: 1,0 mL da solução de sacarose 0,1 mol.L-1
- Tubo 07: 1,0 mL da solução de amido 1%.
A seguir adicione 1,5 mL do reativo de Benedict a cada um dos tubos e coloque-os em banho-maria por três minutos. O que acontece? Explique os resultados.
5. Hidrólise da sacarose (sacarose invertida) 
Coloque em um tubo de ensaio 2,0 mL da solução de sacarose (0,1 mol.L-1) e adicione 1,0 mL de HCl 1,0 mol.L-1. Ferva o tubo de ensaio durante cinco minutos em banho-maria. Retire-o do banho, resfrie e alcalinize com gotas de hidróxido de sódio a 6 mol.L-1. Adicione 1,5 mL do reativo de Benedict. O que ocorre? Conclua.
6. Identificação de amido a partir do lugol.
O iodo metálico presente no lugol se complexa com a cadeia de (-amilose, a partir de dois grupos hidroxilas e dois hidrogênios. Esta reação permite identificar amido.
Coloque 5,0 mL de uma solução aquosa de amido a 1% em um tubo de ensaio. Adicione 2 gotas da solução de lugol. Agite. Coloque em banho-maria fervente e deixe aquecer por cinco minutos. O que ocorre? Explique. Resfrie e observe novamente. O que ocorreu?
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Caracterizar os resultados que permitiram a identificação dos carboidratos e discutir os resultados positivos obtidos nos experimentos, bem como os negativos. 
�REAÇÕES DE RANCIFICAÇÃO 
Introdução
	As gorduras quando expostas ao ambiente, sofrem o processo de rancificação, que lhes altera a natureza química e modifica suas propriedades organolépticas. A rancificação é hidrolítica, quando catalisada por enzimas, que liberam os ácidos graxos, aumentando a acidez da gordura, ou auto-oxidativa , pelo O2 do ar.
	A rancidez oxidativa ocorre em óleos e gorduras que contém ácidos graxos insaturados, levando á formação de compostos que os tornam impróprios para o consumo. Quando o oxigênio é adicionado às cadeias insaturadas de ácidos graxos, peróxidos e hidroperóxidos são formados. Estes compostos são degradados dando origem a aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, álcoois, de baixa massa molar, que são responsáveis pelas características organoléticas, físicas e químicas associadas à rancificação oxidativa.A rancificação auto-oxidativa de ácidos graxos poliinsaturados processa-se com rapidez nos óleos secantes, como o de linhaça, rico em ácidos graxos poliinsaturados.
	Reações de rancificação tem sido objeto de muita atenção no plano químico, visto que ocorrem através de mecanismos, que envolvem radicais livres e estes são responsáveis pela degradação de moléculas orgânicas através de sua auto-oxidação.
	A rancidez oxidativa se inicia com a abstração de um hidrogênio (fase de iniciação) a partir da ação de fatores externos como luz, calor, presença de metais, etc. Ocorre a formação de radicais livres, que podem reagir com o oxigênio atmosférico formando peróxidos e hidroperóxidos (fase de propagação), com a formação de novos radicais livres, que irão atacar outras moléculas de lipídios. Na fase terminal os radicais livres reagem entre si, formando moléculas estáveis. 
Indução:
RH ( R( + H
R( + O2 ( RO(2
Propagação: 
RO(2 + RH ( R( +RO2H
RO(2H ( RO( + OH(
RO(2H ( RO(2 + H
Terminação
R(+ R( ( R-R
R(+ RO(2 ( RO2R
R(+ OH( ( ROH 
	A determinação de acidez por métodos qualitativos e quantitativos pode nos fornecer dados valiosos do estado de conservação de um óleo ou gordura. Um processo de decomposição, seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, altera a concentração dos íons hidrogênio. Um dos métodos para a determinação da acidez é a titulação, que avalia a acidez titulável, ou por meio da determinação colorimétrica ou eletrométrica do pH. Outra avaliação muito utilizada é da quantidade de peróxidos formados. 
Objetivos: Avaliar a qualidade de óleos através da determinação dos índices de acidez e de peróxido.
 1. Determinação de índice de acidez livre de um óleo
A auto-oxidação de cadeias graxas, também conhecida como lipoperoxidação, tem como produtos finais aldeídos e ácidos carboxílicos de baixa massa molar o que torna óleos e gorduras impróprias para o consumo.
Procedimento experimental
	Pese de 5,0 de 10,0 gramas de óleo vegetal em uma balança analítica diretamente em um erlenmeyer de 125,0 mL, adicione25,0 mL da mistura éter/etanol (proporção 1:1) e 3 gotas de fenolftaleína.
	Faça um experimento controle sem a amostra.
	Titule com hidróxido de sódio 0,01 mol.L-1. A cor que identifica a viragem deve persistir por 30 segundos. Anote o volume de hidróxido de sódio gasto na titulação da amostra (Va) e do branco (Vb)
	Calcula-se o índice de acidez livre através da seguinte fórmula:
IA% = (Va – Vb) (mL) de NaOH x MNaOH (mol.L-1) x massa molar do ácido oléico (g.mol-1)
 massa da amostra (g) x 10
Va:	volume de NaOH 0,01 mol.L-1 obtido na titulação da amostra 
Vb:	volume obtido na titulação do branco 
A massa molar usada é a do ácido oléico presente em abundância nos óleos vegetais (Massa Molar = 282).
2. Determinação do índice de peróxido 
PROCEDIMENTO
	Pesar 5,00 ( 0,05g de óleo ou gordura em um frasco erlenmeyer de 250 mL com tampa esmerilhada. 	Adicionar 30 mL da mistura de ácido acético glacial e clorofórmio (3 partes de ácido acético + 2 partes de clorofórmio) e agitar até a dissolução da amostra. 
	Adicionar exatamente 0,500 mL de solução saturada de iodeto de potássio e aguardar por 1 minuto, com agitação ocasional. A seguir adicionar 30 mL de água destilada e 0,5 mL de solução de amido. 
 	Titular com solução de tiossulfato de sódio 0,01 mol/L, até o desaparecimento da coloração escura. 
	RESULTADOS 
	A partir do volume de tiossulfato obtido na titulação calcule o índice de peróxido utilizando a relação: 
V = volume em mL de tiossulfato de sódio 
M = molaridade da solução de tiossulfato de sódio
m = massa da amostra em gramas. 
OBS. Como o índice de peróxido é calculado em milimol por 1000g de amostra a fórmula acima já contém as transformações. 
Para o relatório, PESQUISE: 
QUAIS OS NÍVEIS DE ACIDEZ ACEITÁVEIS NO BRASIL E DO VALOR DO ÍNDICE DE PERÓXIDO. 
QUAL A RELAÇÃO ENTRE O ÍNDICE DE ACIDEZ E A QUALIDADE DE UM AZEITE. FUNDAMENTE O PRINCÍPIO DO MÉTODO E DISCUTA OS RESULTADOS OBTIDOS.
 A RELAÇÃO COM A QUALIDADE DA MATERIA PRIMA DA INDÚSTRIA. 
�
COLESTEROLEMIA: DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE COLESTEROL 
Introdução
	O colesterol é um esterol pertencente a classe dos esteróis, classificados como lipídios. Sua estrutura é derivada do anel esteroidal (ciclo pentano per-hidrofenantreno) e dá origem aos hormônios esteroides, vitaminas D2 e D3. É sintetizado metabolicamente e também é obtido através da dieta. Entretanto, quando há um aumento na sua concentração metabólica, favorece a formação e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) também conhecidas popularmente como “mau colesterol ou colesterol ruim”. Estas lipoproteínas tendem a se depositar nas paredes das artérias conduzindo a aterosclerose.
	Neste experimento, determinaremos quantidade ou concentração de colesterol no plasma pela reação de Lieberman-Burchard. Os valores normais de colesterol no sangue por este método estão entre 150 a 240 mg/100,0 mL. Sua determinação é importante, pois a possibilidade de aterosclerose tem sido correlacionada à quantidade de colesterol circulante.
Princípio do método
	Admite-se que o anidrido acético condensa-se com a hidroxila do colesterol originando o éster correspondente. Se o esterol original tem uma insaturação na molécula, ocorre uma desidratação pela ação do H2SO4 concentrado, com a formação da cor verde, absorvida na região de 650 nm do espectro. 
Protocolo
a)	 Solução padrão de colesterol: 100 mg de colesterol em 100,0 mL de clorofórmio. 
b) Amostra: Retire o sangue e coloque em anticoagulante (heparina ou EDTA). Centrifugue imediatamente e separe o plasma.
Curva-padrão e teste realizados consecutivamente.
	Tubos
	Padrão colesterol (mL) 
	CHCl3 (mL)
	Anídrido acético mL)
	H2SO4(mL)
	
Incubar
no escuro
por
20
minutos
à T.A. 
	Absorbância
	B
	0,0
	5,0
	2
	0,1
	
	
	1
	0,1
	4,9
	2
	0,1
	
	
	1
	0,1
	4,9
	2
	0,1
	
	
	2
	0,2
	4,8
	2
	0,1
	
	
	2
	0,2
	4,8
	2
	0,1
	
	
	3
	0,3
	4,7
	2
	0,1
	
	
	3
	0,3
	4,7
	2
	0,1
	
	
	4
	0,4
	4,6
	2
	0,1
	
	
	4
	0,4
	4,6
	2
	0,1
	
	
	5
	0,5
	4,5
	2
	0,1
	
	
	5
	0,5
	4,5
	2
	0,1
	
	
	
	PLASMA 
(mL)
	
	
	
	
	
	T
	0,5
	4,5
	2
	0,1
	
	
	T
	0,5
	4,5
	2
	0,1
	
	
Leitura: ( = 650 nm
Construa a curva padrão. Obtenha a equação da reta e determine a concentração de colesterol no ovo, não se esqueça de considerar todas as diluições. 
REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS 
OBJETIVO
Evidenciar as diversas reações, que permitem identificar alguns grupos R dos resíduos dos aminoácidos componentes das proteínas, assim como reações de identificação de proteínas com reativo específico para caracterização das mesmas. Destacar a desnaturação proteica por diversos tipos de situações desnaturantes.
Procedimento 
SOLUÇÃO DE ALBUMINA: Prepare uma solução a 2% de albumina. 
SOLUÇÃO DE GELATINA: Prepare uma solução a 2% de gelatina em água destilada quente, para dissolução completa. 
1. EXISTÊNCIA DE AMINOÁCIDO SULFORADOS
Adicione 1 mL de cada uma das soluções de proteína em dois tubos de ensaio e 1 mL NaOH 6,0 mol.L-1 em cada um deles. . Aqueça os tubos em banho Maria fervente por 5 minutos. Adicione 10 gotas de ácido acético concentrado e 10 gotas de acetato de chumbo a 10%, em cada um dos tubos. Agite vigorosamente. Haverá formação de um precipitado preto. 
2. REAÇÃO DE MILLON 
	Os fenóis quando aquecidos com sais mercuriais formam derivados mercurais que em presença de HNO3 sofrem nitração formando compostos de coloração vermelho tijolo. A tirosina é o único aminoácido encontrado nas proteínas que contém grupo fenólico, portanto somente as proteínas que contém tirosina dão a reação de Millon positiva. 
	Coloque 2,0 mL da solução de cada uma das proteína em tubos de ensaio. Adicione 1,0 mL do reativo de Millon a cada um deles e aqueça em banho Maria fervente por 5 min.
3. REAÇÃO DE HOPKINS-COLE
	Na presença de ácidos, muitos aldeídos se condensam com o anel indólico do triptofano formando compostos coloridos. Na reação de Hopkins-Cole as proteínas que contém triptofano, reagem com o ácido glioxílico (que contém um grupamento aldeídico ligado a uma carboxila) e pela ação do H2SO4 concentrado formam composto de cor violeta na interface. 
	Em dois tubos de ensaio distintos adicionar 1 mL das soluções das proteínas e 3 mL do reativo de Hopkins-Cole a cada um deles. Inclinar o tubo e adicionar 2 mL de H2SO4 concentrado em cada um deles, pelas paredes dos tubos, vagarosamente. Aguardar alguns minutos e observar a formação de um anel violeta, se houver a presença de triptofano na proteína. 
4. REAÇÃO DE SAKAGUSHI
	Os aminoácidos que contém produtos de substituição das guanidinas dão coloração vermelha quando tratados com (-naftol e hipoclorito. É o caso das proteínas que contém arginina. 
	Em tubos de ensaio coloque 1,0 mL das soluções das proteínas; adicione 1,0 mL de NaOH 2,5 mol.L-1, 0,5 mL de (-naftol (0,4 % em etanol) e 1,0 mL de hipoclorito de sódio 0,5% a cada um dos tubos. 
5. REAÇÃO XANTOPROTEÍCA
	Coloque 1,0 mL das soluções de proteína, gelatina e albumina, em dois tubos de ensaio. Adicione 0,5 mL de HNO3 concentrado em cada tubo, leve ao banho-maria fervente por dois minutos. Resfrie e observe a coloração. A seguir acrescente 4,0 mL de hidróxido de sódio a 20% a cada um dos tubos e observe novamente a coloração. Discuta a especificidade dessa reação. 
6. REAÇÕES DE DESNATURAÇÃO DAS PROTEÍNAS 
6. 1. Ação do calor
Em três tubos de ensaio coloque 2,0 mL da solução de albumina (proteína); aqueça-os em banho Maria fervente por 5 minutos. Observe. Tente solubilizar o precipitado em solventes comuns: 2 mL de álcool etílico, 2 mL de acetona e 2 mL de clorofórmio respectivamente nos3 tubos. Conclua.
6. 2. Ação do ácido orgânico forte
Em 2 tubos de ensaio coloque 1,0 mL da solução de albumina e 1,0 mL de gelatina, a seguir adicione 1,0 mL de ácido tricloro-acético a 5% em cada um deles. Agite vigorosamente. Observe e conclua.
6.3. Ação de solventes orgânicos
Prepare três tubos de ensaio com 1,0 mL da solução de albumiina; a cada tubo adicione os seguintes solventes:
Tubo 1 - 1,0 mL de álcool etílico; 
Tubo 2 - 1,0 mL de acetona; 
Tubo 3 - 1,0 mL de clorofórmio 
Agite os tubos vigorosamente. Observe e conclua
DOSAGEM DE PROTEÍNAS TOTAIS NO PLASMA PELO MÉTODO DE BIURETO 
Princípio do método
Substâncias que contém dois ou mais laços peptídicos produzem, em meio fortemente alcalino, uma cor violeta quando diluída com sulfato de cobre. A cor deve-se à formação de complexos de coordenação entre o íon cúprico e quatro grupos amina de duas cadeias proteicas adjacentes.
 Complexo de coordenação entre os íons Cu2+ e quatro nitrogênios, dois de cada cadeia uma de cadeias peptídicas adjacentes. 
METODOLOGIA 
AMOSTRA: Coletar o sangue em anticoagulante (heparina ou EDTA), centrifugar imediatamente e separar o plasma
Prepare os seguintes tubos: 
	�Tubos
	H2O
(mL)
	CuSO4
(mL)
	Ácido cólico
(mL)
	ALBUMINA
(mL)
	NaOH
(mL)
	Absorbância
	 B
	0,50
	0,30
	0,2
	0,00
	2,0 
	
	1
	0,45
	0,30
	0,2
	0,05
	2,0
	
	2
	0,40
	0,30
	0,2
	0,10
	2,0
	
	3
	0,30
	0,30
	0,2
	0,20
	2,0 
	
	4
	0,20
	0,30
	0,2
	0,30
	2,0
	
	5
	0,10
	0,30
	0,2
	0,40
	2,0 
	
PLASMA 
	
AMOSTRA 
	H2O
(mL)
	CuSO4
(mL)
	Ácido cólico
(mL)
	PLASMA 
(mL)
	NaOH
(mL)
	Absorbância
	
	0,45
	0,30
	0,2
	0,05
	2,0
	
	
	0,45
	0,30
	0,2
	0,05
	2,0
	
Ler de imediato a 540 nm.
ALBUMINA PADRÃO: 1g/100 mL de H2O destilada
Faça a curva padrão utilizando os valores de absorbância do padrão de albumina e determine a quantidade de proteínas totais no plasma. 
FATORES QUE ALTERAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
Objetivo
Evidenciar a atividade enzimática como catalisador biológico, sua necessidade de manter um meio ideal para a realização da catálise e de que maneira alguns fatores podem interferir nesta catálise levando, a desnaturação com consequente perda da atividade. 
1. ATIVIDADE ENZIMÁTICA
 	Utilize a solução de (-amilase a 0,1% ou saliva filtrada. Enumere oito tubos de ensaio (de 0 a 7); adicione 50,0 mL de amido 1% a um erlenmeyer de 125,0 mL e leve-o ao banho-maria a 37 °C. Após cinco minutos acrescente ao frasco 1,0 mL da solução de amilase a 0,1%. Imediatamente homogeneíze; anote o tempo e retire uma amostra de 3,0 mL (tempo zero) e adicione duas gotas de lugol. Não retire o sistema do banho. De três em três minutos, retire amostras de 3,0 mL do erlenmeyer, transferindo-as aos tubos sequencialmente enumerados, adicionando em seguida duas gotas de lugol, como foi feito para o primeiro tubo. Utilize para a comparação duas gotas de lugol em 3,0 mL de água destilada.
2. Efeito da temperatura
a)	Prepare seis tubos de ensaio (de 1 a 6) e adicione em cada tubo, 2,0 mL de amido e 1,0 mL da solução de tampão fosfato (1,0 mol.L-1) pH 7.
Coloque os tubos:
 1 e 2 no gelo,
 3 e 4 a 37°C 
 5 e 6 em água fervente 
por aproximadamente cinco minutos para equilíbrio térmico. Não retire os tubos dos meios. 
c)	Adicione 0,1 mL da solução de amilase a 0,1% a cada tubo (coloque no fundo do tubo e agite bem, conserve os tubos nos meios), aguarde exatamente 10 minutos e teste a hidrólise do amido com iodo (2 gotas de lugol) . Analise os resultados.
3. Efeito do pH
a)	Prepare os seguintes tubos:
- Tubo 1 - 1,0 mL da solução de tampão fosfato 1 mol.L-1 , pH 7 + 2,0 mL amido 1%.
- Tubo 2 - 1,0 mL da solução de acido clorídrico 1 mol.L-1, pH 2 + 2,0 mL da solução de amido 1%.
- Tubo 3 - 1,0 mL da solução de tampão tris 1mol.L-1, pH 12 + 2,0 mL da solução de amido 1%.
b)	Adicione 0,5 mL da solução de amilase a 0,1% em cada tubo (no fundo, agitando bem).
c)	Espere durante 10 minutos.
d)	Adicione duas gotas de lugol.
e)	Analise os resultados.
Obs. Solução de (-amilase preparada em água destilada e deionizada. Testar previamente as concentrações utilizadas, pois amilase estocada pode sofrer alterações.
	
Questões
1)	Faça um gráfico, que evidencie o efeito da temperatura na atividade enzimática.
2)	Fale a respeito da ação do pH na atividade enzimática observada \SÍMBOLO SYMBOL \f "Playbill" \s 13in vitro\SÍMBOLO SYMBOL \f "Playbill" \s 13.
3)	Explique por que desnaturação implica em perda da atividade enzimática.
CINÉTICA ENZIMÁTICA: CINÉTICA DA INVERTASE (SACARASE) 
Introdução
	A invertase é uma enzima hidrolítica (nome sistemático: beta-frutofuranosidase), é uma sacarase que catalisa a hidrólise da sacarose, dando como produtos a glicose e a frutose. 
	
	Figura 1 – Hidrólise da sacarose 
		
Seu nome comum, invertase, deve-se ao fato de que a hidrólise da sacarose leva à inversão da rotação óptica do meio reacional, basicamente em consequência do surgimento de frutose, quando observado em polarímetro. O produto de hidrólise da sacarose, o xarope de glicose mais frutose, é conhecido como “açúcar invertido” e apresenta diversas características interessantes em relação ao xarope de sacarose: maior poder edulcorante (devido à presença da frutose), maior possibilidade de concentração (os monossacarídeos formados são mais solúveis que o dissacarídeo original), ponto de ebulição mais alto e ponto de congelamento mais baixo (em virtude da maior pressão osmótica do produto). A hidrólise enzimática da sacarose é preferível à hidrólise ácida, uma vez que não resulta na formação indesejável de sabor, assim como impurezas coloridas. O açúcar invertido é utilizado em confecções de balas, prevenindo a cristalização do açúcar, o que proporcionaria uma textura desagradável com característica arenosa ao produto e indesejável ao consumidor. Outra aplicação interessante e em maior escala, em nível mundial, é na indústria de refrigerantes. 
	A invertase é classificada na família GH32 de glicosídeos hidrolases, que inclui mais de 370 elementos, sendo relatados em vegetais (aspargo, beterraba, cebola, chicória, entre outras), bactérias, leveduras (Saccharomyces sp.) e fungos filamentosos (Aspergillus sp.). Leveduras (Saccharomyces sp.) produzem diferentes tipos de invertases: intracelulares, ligadas à parede, e, mais raramente, extracelulares.
OBJETIVOS:
	Determinação dos parâmetros cinéticos da enzima invertase. 
PRINCÍPIO DO MÉTODO
	Sendo a sacarose um açúcar não redutor, pode-se medir a atividade hidrolítica da enzima pelo aparecimento de açúcar redutor (glicose mais frutose) após sua incubação com a enzima. 
	Para se determinar a quantidade de açúcar redutor formada, utiliza-se uma curva-padrão de açúcar redutor elaborada previamente, nas mesmas condições. 
PROTOCOLO
a) Extração da enzima: Pesar 50g de levedura seca (Saccharomyces cerevisae) e colocar num balão volumétrico de 250 mL e completar o volume com bicarbonato de sódio 0,154M, levar ao banho-maria a 45ºC para a autólise, por 6 a 8h. A seguir centrifugar a suspensão por 20 min. a 10.000 rpm, desprezar o sedimento e guardar o sobrenadante para as provas enzimáticas. 
b) Solução de invertase: Pode-se utilizar uma solução estoque da enzima invertase (0,32 unidades/mL). Neste caso, preparar a solução de invertase a 0,01% em água destilada.
CURVA PADRÃO DO AÇÚCAR REDUTOR
	Tubos
	H2O
(mL)
	Solução padrão
glicose a 0,01%
	Reativo de Somoggy
(mL)
	
	Reativo de Nelson
(mL)
	H2O
(mL)
	Absorbância
	1
	1,0
	0,0
	1
	Agitar bem
	1
	7
	
	1
	1,0
	0,0
	1
	e
	1
	7
	
	2
	0,6
	0,4
	1
	levar ao
	1
	7
	
	2
	0,6
	0,4
	1
	banho-
	1
	7
	
	30,4
	0,6
	1
	maria
	1
	7
	
	3
	0,4
	0,6
	1
	por 10
	1
	7
	
	4
	0,2
	0,8
	1
	minutos
	1
	7
	
	4
	0,2
	0,8
	1
	
	1
	7
	
	5
	0,0
	1,0
	1
	
	1
	7
	
	5
	0,0
	1,0
	1
	
	1
	7
	
Leitura: comprimento de onda de 530 nm
		Com os dados obtidos construir a curva-padrão (absorbância x concentração de glicose).
	ATIVIDADE DA ENZIMA 
	Tubos
	H2O
(mL)
	SACAROSE 
0,01%
	ENZIMA
(mL)
	
	Reativo de Somoggy (mL)
	
	Reativo de Nelson
(mL)
	H2O
(mL)
	Abs
	1
	1,0
	0,0
	0,5
	
Incubar 
37°C por
10 min.
	1
	Agitar bem e
	1
	7
	
	2
	0,8
	0,2
	0,5
	
	1
	levar ao
	1
	7
	
	3
	0,6
	0,4
	0,5
	
	1
	banho-maria
	1
	7
	
	4
	0,4
	0,6
	0,5
	
	1
	por 10
	1
	7
	
	5
	0,2
	0,8
	0,5
	
	1
	minutos
	1
	7
	
	6
	0,0
	1,0
	0,5
	
	1
	
	1
	7
	
Leitura: comprimento de onda de 530 nm
Homogeneizar a solução da enzima imediatamente antes de cada retirada.
Adicionar a enzima no fundo do tubo e agitar bem. 
RESULTADOS: 
 A partir da curva padrão do açúcar redutor e da equação da reta obtida calcular a concentração de açúcar redutor produzido pela atividade da invertase. Faça isso substituindo os valores da absorbância obtidos no experimento da atividade enzimática no lugar do Y na curva padrão e calcule o X. Esses valores correspondem à quantidade de açúcar redutor formado. 
Divida todos os valores por 10 para obter a velocidade por minuto. 
Construir o gráfico da concentração de substrato (sacarose) em função da velocidade da reação ([S] X vel. da reação).
Construa o gráfico duplo-recíproco: inverso da concentração de substrato em função do inverso da velocidade da reação ( 1/[S] X 1/V).
A partir do gráfico duplo recíproco, calcular: 	Km e Vmax. 
Obs: Uma unidade da enzima invertase corresponde a quantidade que leva à formação de 2 mols de açúcar redutor por minuto ou a quantidade de enzima que catalisa a hidrólise de 1 mol de sacarose por minuto sob condições padrões.
�
DOSAGEM DA VITAMINA C – ÁCIDO ASCÓRBICO 
FUNDAMENTAÇÂO DA TÉCNICA
	 Baseia-se na redução estequiométrica do 2,6-dicloro-fenol indofenol pelo ácido ascórbico que é oxidado para ácido desidroascórbico, de acordo com a reação:
	A forma oxidada do corante é azul em meio alcalino e vermelha em meio ácido. A titulação deve ser efetuada na presença de uma mistura de ácido acético e ácido metafosfórico para:
inibir a reoxidação do corante pelo oxigênio do ar, na presença de catalisadores do ar
inativar enzimas
precipitar proteínas e liberar o ácido ascórbico que esteja ligado a proteínas. 
PROCEDIMENTO
CURVA PADRÃO 
Inicialmente titular a solução padrão de ácido ascórbico, para construção a curva padrão. 
Titule as soluções a seguir de diferentes concentrações de ácido ascórbico:
	Tubos
	Solução estoque ácido ascórbico ((L) 
	Água destilada
	Volume DCIF (mL)
Titulado 
	1
	100
	4,90
	
	1
	100
	4,90
	
	2
	200
	4,80
	
	2
	200
	4,80
	
	3
	300
	4,70
	
	3
	300
	4,70
	
	4
	400
	4,60
	
	4
	400
	4,60
	
	
TITULAÇÃO DA AMOSTRA 
PREPARO DAS AMOSTRAS: 
1,0 mL de suco + 4,0 mL de ácido metafosfórico (volume final 5,0 mL) 
PREPARE 2 AMOSTRAS PARA TITULAÇÃO. 
	
	AMOSTRA (mL) 
	Água destilada
	Volume DCIF (mL)
	 Suco
	5,0 
	- 
	
	 Suco 
	5,0
	-
	
RESULTADOS
Construir um gráfico do volume de DCIF (diclorofenol indofenol) em função da concentração do ácido ascórbico (mg/mL), para a solução padrão.Obtenha a equação da reta e com ela determine a concentração de vitamina C no suco testado. O padrão foi preparado com 10 mg de ácido ascórbico em 10 mL de ácido metafosfórico. Calcule a quantidade de ácido ascórbico para 100 mL de suco ou de acordo com o volume apresentado na embalagem.