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Enzimas de restrição e eletroforese
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Enzimas de Restrição e Eletroforese Enzimas clivar unir encurtar estender DNA copiar inserir remover Enzimas - Polimerases: fazem cópias de moléculas - Ligases: unem moléculas de ac. nucléicos - Topoisomerases: introduzem ou removem superenrolamentos de DNA circular covalentemente fechado - Enzimas Modificadoras: removem ou adicionam grupamentos químicos - Nucleases: clivam, encurtam e degradam ácidos nucléicos Enzimas Propriedades particulares: - atividades múltiplas: polimerases (produzir e degradar) - enzimas que atuam em RNA Polimerase - Síntese a partir de uma fita molde - DNA iniciador ou primer - RNA não precisa de iniciador Polimerase Polimerase Polimerase Polimerase Ligase - Reparar descontinuidades em fitas individuais de DNA durante a replicação --- 3’ okasaki 5’ --- 3’ okasaki 5’ --- 3’ okasaki 5’ --- ligase ligase ligase ligase Ligase Ligase Enzimas Modificadoras - Modificam o DNA pela adição ou pela remoção de grupos químicos específicos - Fosfatase alcalina: remove o fosfato da extremidade 5’ - Polinucleotídeo - quinase: insere fosfato na extremidade 5’ - Desoxinucleotidil transferase terminal: adiciona desoxirribonucleotídeos a extremidade 3’ Enzimas Modificadoras Enzimas Modificadoras Nuclease - Degradam moléculas de ácidos nucléicos através da quebra da ligação fosfodiéster Nuclease Nuclease Nucleases - Exonucleases: remoção de um nucleotídeo da extremidade do DNA - Endonucleases: quebra da ligação fosfodiéster no interior da molécula de DNA Exonuclease Exonucleases Endonucleases Endonuclease de Restrição - Grupo especial de endonucleases que clivam DNA de fita dupla em sítios de reconhecimento específicos Restrição Controlada pelo Hospedeiro Endonuclease de Restrição Endonuclease de Restrição Extremidade Cega Extremidade Adesiva ou Coesiva Extremidade Adesiva ou Coesiva Enzimas de Restrição Extremidade Adesiva ou Coesiva GGATCC AGATCT GATC Digestão de Restrição DNAendonuclease de restrição Mg²+ ditiotreitol pH temperatura DNA (digerido) EDTA ou ∆ 70°C Clonagem Gênica Clonagem Gênica Eletroforese Separação de moléculas quando submetidas a um campo elétrico - Tamanho da molécula - DNA (carga negativa) - Difusão em matriz gel: - agarose: 1 a 30 Kb (ideal 10 a 12 Kb) - poliacrilamida: 1 a 300 pb Eletroforese Eletroforese Preparo do Gel Inserção do DNA Eletroforese Eletroforese Corante Fluorescente Transluminador Gel de Agarose Fósforo Radioativo Auto-Radiografia Eletroforese de Topoisómeros a b c d Eletroforese de Topoisómeros D B C A + _ Eletroforese em Campo Pulsado Mapeamento - RFLP gene 1 gene 3gene 2polimórfica polimórfica A A A A BB B gene 1 gene 2 gene 3polimórfica polimórfica AA A B B? A indivíduo 1 indivíduo 1’ Mapeamento - RFLP gene 1 gene 3gene 2polimórfica polimórfica A A A A BB B indivíduo normal indivíduo doente gene 1 polimórfica polimórfica gene 2 gene 3 A A AAB B? Mapeamento - RFLP Mãe Pai Filho 1 AdotadoFilho 2 Filho 3 Enzimas de Restrição e Eletroforese Enzimas Enzimas Enzimas Polimerase Polimerase Polimerase Polimerase Polimerase Ligase Ligase Ligase Enzimas Modificadoras Enzimas Modificadoras Enzimas Modificadoras Nuclease Nuclease Nuclease Nucleases Exonuclease Exonucleases Endonucleases Endonuclease de Restrição Restrição Controlada pelo Hospedeiro Endonuclease de Restrição Endonuclease de Restrição Extremidade Cega Extremidade Adesiva ou Coesiva Extremidade Adesiva ou Coesiva Enzimas de Restrição Extremidade Adesiva ou Coesiva Digestão de Restrição Clonagem Gênica Clonagem Gênica Eletroforese Eletroforese Eletroforese Preparo do Gel Inserção do DNA Eletroforese Eletroforese Corante Fluorescente Transluminador Gel de Agarose Fósforo Radioativo Auto-Radiografia Eletroforese de Topoisómeros Eletroforese de Topoisómeros Eletroforese em Campo Pulsado Mapeamento - RFLP Mapeamento - RFLP Mapeamento - RFLP
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