3 Enzimas de Restriçao

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Enzimas de 
Restrição 
Enzimas de Restrição 
• Enzimas que reconhecem e clivam o DNA em 
pontos específicos. 
• Identificadas pela 1ª vez em E. coli (1978) 
• Mecanismo de defesa natural contra 
bacteriófagos. 
Descoberta das enzimas de Restrição 
• Mecanismo de defesa de bactérias. 
• 2 processos: Metilação 
 Restrição 
Mecanismo das enzimas de Restrição 
• Atualmente são utilizadas como ferramentas 
em técnicas de BioMol: 
– Marcador molecular 
– Isolamento de genes 
– Clonagem molecular 
– Engenharia Genética 
 Utilização enzimas de Restrição 
• Atualmente adquiridas comercialmente: 
 Utilização enzimas de Restrição 
• Pode se encontrar a enzima certa utilizando a Bioinformática. 
 
• Softwares como pDRAW® encontra as melhores opções de 
enzimas disponíveis e ainda realizam simulações (in sílico) dos 
resultados esperados. 
 Estou quero isolar uma sequência de 
DNA, qual enzimas de Restrição utilizar? 
Região de isolamento 
Comando para o Software 
 Estou quero isolar uma sequência de 
DNA, qual enzimas de Restrição utilizar? 
Visualização do resultado da simulação 
Visualização do resultado 
da simulação 
Eletroforese da simulação 
 Nomenclatura 
• As enzimas de restrição são nomeadas de 
acordo com o organismo de origem. 
 
 Como as enzimas de restrição atuam na 
prática? 
• Reconhecem uma sequência de nucleotídeos específica e depois cortam 
a molécula de DNA. 
 
• Estas sequências específicas são chamadas de sítios de restrição. 
 
• Os sítios de restrição geralmente são sequências de 4-8 nucleotídeos. 
 
 Como as enzimas de restrição atuam na 
prática? 
• Algumas sequências de reconhecimento 
podem ser palíndromos. 
Palíndromo: ambas as fitas do 
DNA tem a mesma sequência, 
mas de polaridade inversa. 
 
 Como as enzimas de restrição atuam na 
prática? 
• Algumas enzimas podem ser classificadas de acordo 
com a sequência de clivagem: 
 
• Não ambíguas 
Exemplo: 
BamHI - só reconhece a sequência 
 
 
• Ambíguas 
 Exemplo: 
HInf I - reconhece sequências de 5bp começadas por GA 
e que terminem em TC, dentro da sequência pode ser 
qualquer nucleotídeo (N). 
 
 Como as enzimas de restrição atuam na 
prática? 
• Após o reconhecimento da sequência/sítio de 
restrição a enzima realiza a clivagem. 
Obs. Setas (↓) ou barras (/) indicam local da clivagem. 
 Como as enzimas de restrição atuam na 
prática? 
• A clivagem é realizada por meio do 
rompimento da ligação fosfodiéster e/ou 
pontes de hidrogênio 
 Como as enzimas de restrição atuam na 
prática? 
• Existem dois tipos de clivagem. 
a) Clivagem no eixo de simetria 
Moléculas com extremidades 
abruptas ou cegas 
Moléculas com extremidades 
coesivas ou sobrepostas 
b) Clivagem simetricamente situada ao 
redor do eixo de simetria 
...TC GA... 
...AG CT... 
3 ’ 
5 ’ 3 ’ 
5 ’ 
+ 
...GAA TTC... 
...CTT AAG... 
+ 
3 ’ 
5 ’ 3 ’ 
5 ’ 
• A enzima de restrição pode cortar apenas uma 
ou várias vezes a sequência de DNA. 
 
 
 Como as enzimas de restrição atuam na 
prática? 
Tipos de enzimas de restrição 
Características Tipo I 
 
Tipo II Tipo III 
Estrutura 3D Metilação 
 Clivagem 
 Metilação 
 Clivagem 
Enzima de restrição 
Enzima de Metilação 
Sequência de 
reconhecimento 
Assimétrica Assimétrica Palíndromo 
Local da clivagem Não é específico, 
pode ocorrer fora do 
sítio de clivagem 
(1000 pb) 
Específico, dentro ou 
nas extremidades do 
sítio de clivagem 
Não é específico, 
pode ocorrer fora do 
sítio de clivagem 
 (± 20 pb) 
Consumo de ATP Sim Não Sim 
Tipos de enzimas de restrição 
Sítio de corte aleatório cerca de 1000 pb 
distante da sequência de reconhecimento 
Sítio de corte específico, ou muito próximo ao 
sítio de reconhecimento que geralmente é um 
palíndromo. 
Sítio de corte cerca de 24-26 pb a jusante da 
sequência de reconhecimento que é 
assimétrica. 
• Enzimas de restrição diferentes, mas que 
possuem a mesma sequência de clivagem. 
 
• Diferem nas condições ótimas de reação e na 
estabilidade 
 
 Isquizômeros 
• Adicionar a um tubo Eppendorf. 
– 6 µL de água ultrapura 
– 2 µL do tampão da enzima 
– 10 µL amostra de DNA 
– 2 µL da enzima (1U/ µL) 
 
• Incubar na temperatura exigida. 
• Inativar quando necessário. 
 
Reação com enzima de restrição 
• Composição do tampão 
– Diferem na força iônica (concentração de sal) 
– Diferem no cátion principal (Na+, Mg+, K+) 
– Manutenção do pH da reação 
 
• Temperatura de incubação 
– A maioria das enzimas cliva melhor a 37ºC 
– Exceções: Bactérias termófilas – clivam melhor entre 50 a 60ºC 
 
• Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37ºC, 
recomenda-se a incubação a 20ºC 
 
• Digestão com múltiplas enzimas (T°≠) 
 
Fatores que influenciam a cinética 
enzimática 
• Hidrólise simples: 
– Digestão do DNA com uma única enzima de restrição 
– Determinação relativa das orientações dos fragmentos 
no DNA linear 
 
 
 
Tipos de reações com enzimas de 
restrição 
• É uma compilação do número, da ordem e da distância entre 
locais do corte do enzima de restrição ao longo de um 
segmento de DNA. 
 
• As unidades do mapa são expressadas em pares de bases 
ou para distâncias mais longas em pares de kilobases. 
 
• O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vetor 
bem caracterizado de plasmídeo ou de bacteriófago, 
onde a sequência é conhecida 
 
• Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para 
caracterizar um DNA desconhecido e um pré-requisito a 
manipulá-lo para outras finalidades. 
 
 
Mapas de Restrição 
• Existem dois métodos para elaborar um mapa de restrição: 
– Mapeamento utilizando digestões múltiplas 
– Mapeamento utilizando digestões parciais 
 
• Construção de mapas de restrição com hidrólises múltiplas: 
– Hidrólise do DNA: 
– Separadamente com hidrólises simples 
– e com pares de enzima 
 
• Aplicar uma eletroforese em gel para os fragmentos obtidos 
 
• (Permite a separação dos fragmentos gerados de diferentes 
tamanhos!!!) 
 
Mapas de Restrição 
Considere o fragmento de DNA: 
5´AAGAATTGCGAATTCGACTTAAGGGCCGCGCCGAAGCTTTAAAGGTTATATTTCC-3’ 
Quantos fragmentos resultarão da clivagem com as seguintes enzimas e 
indique o número de nucleotídeos e pb de cada fragmento: 
EcoRI: ( G↓AATTC): 
_________________________________________________________ 
HaeIII: ( GG↓CC): 
___________________________________________________________ 
NotI: (GC↓CCGG): 
___________________________________________________________ 
Com as três enzimas juntas: 
____________________________________________________ 
 
Atividade 
Mapas de Restrição 
0.5 
1.0 
2.5 
5.0 
8.0 
10.0 
7.0 
6.2 
5.8 5.8 
0.8 
1.2 
0.8 
0.4 
0.8 
0.8 
1.2 
5.8 
7.0 
7.0 
0.8 0.4 5.8 
0.8 5.0 1.2 
Modelo I 
Modelo II 
HindIII SalI 
HindIII SalI 
Porque o fragmento 0,4 vem dentro entre 0,8 e 5,8? Porque é o corte de HindIII+ SalI. 
Mapas de Restrição 
• Construa o mapa de restrição a partir dos 
dados apresentados abaixo. 
Mapas de Restrição 
• Construa o mapa de restrição a partir dos dados 
apresentados abaixo. Saiba que o seguimento é circular 
e tem 12 kb.