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roteiro de aulas práticas
 Faculdade de Ciências da Saùde
	
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA
DE
(MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS)
SNU0005
SUMÁRIO
Disciplina........................................................... SNUOOO5
Assuntos
AULA 1 – BIOSSEGURANÇA ........................................................................................................ 05
AULA 2 - ESTERILIZAÇÃO / DEFINIÇÃO E APRESENTAÇÃO DAS VIDRARIAS.............05
AULA 3 – MEIO DE CULTURA SÓLIDO - RECONSTITUIÇÃO DE ÁGAR SIMPLES........ 07
AULA 4 – COLORAÇÃO WIRTZ CONKLIN ........................................................................ 08
AULA 5 – MÉTODO PARA CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS ..................................... 10
AULA 6 – MÉTODOS PARA CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS – Artigos ....................... 12
AULA 7 - ASSEPSIA DAS MÃOS ................................................................................................ 12
AULA 8 - DISCUSSÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO DAS MÃOS “LIMPAS” .......... 13
AULA 9 – ESTERILIDADES COMERCIAL ................................................................................. 14
AULA 10 – AVALIAÇÃO DA ANÁLISE DA ESTERILIDADE COMERCIAL ......................... 15
AULA 11 – ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA (Contagem de coliformes a 37 e a 40) 16
AULA 12 – CONTAGEM DE Bacillus cereus ................................................................................ 18 AULA 13 – CONTAGEM DE Bacillus cereus – PARTE II ........................................................... 19
AULA 14 – MICROORGANISMOS PRESENTES EM PRODUTOS COMERCIAIS – Artigos . 21
	ASSUNTO:
	Roteiro de Aulas Práticas
	Disciplina:
	Microbiologia dos Alimentos
	Curso: 
	Nutrição
	Turmas e Turno:
	3º - Vespertino e Noturno (A e B)
	Código da Disciplina: SNU0005
	Equipe de Elaboração do Roteiro:
	Coordenador do Curso: Profa. Tatiana
	Professores da Disciplina: Renata Oliveira e Cristina Pondé
	Local de Execução das Atividades Práticas: Laboratório de Microbiologia
	Bibliografia: Bibliografia:
 FRANCO, B. Microbiologia dos Alimentos. SP: Atheneu, 2001. 
STEPHEN, J.F. Microbiologia da Segurança Alimentar. Porto Alegre: Artmed, 2005.
RIBEIRO, M.C.; SOARES, M.M.S.R. Microbioloia Prática – Roteiro e Manual Baterias e Fungos. SP: Atheneu, 2000.
	Apresentação da Disciplina: Apresentação da Disciplina: Apresentação de técnicas biológicas aplicadas à microbiologia dos alimentos. Ecologia microbiana dos alimentos. Contaminação e deterioração dos alimentos. Conservação dos alimentos. Controle microbiológico de alimentos. Padrões microbiológicos e APPCC.
	Objetivos de Aprendizagem: 
Conhecer os fatores intrínsecos e extrínsecos que controlam o desenvolvimento microbiano dos alimentos, os principais microrganismos deteriorantes dos alimentos e a sua influência na saúde do consumidor, bem como os métodos de análises.
	Título da Aula: NOÇÕES DE BIOSSEGURANÇA 
	Aula: N. 1
	Metodologia:
Aula expositiva.
	Título da Aula: ESTERILIZAÇÃO / DEFINIÇÃO E APRESENTAÇÃO DAS VIDRARIAS
	Aula: N. 2
	Objetivos de Aprendizagem: Apresentar ao aluno os materiais necessários à esterilização e as principais vidrarias a serem utilizados durantes as aulas práticas.
	Metodologia:
Aula expositiva e apresentação das seguintes vidrarias e equipamentos:
MATERIAIS:  (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
1. Vidrarias, Equipamentos e Diversos  
béquer de 500ml  
bastão de vidro  
bico de Bunsen  
proveta de 250ml  
erlenmeyer de 250ml  
algodão  
papel (de jornal ou pardo)  
tubos de ensaio  
latas  
placas de Petri  
pipetas graduadas de 1ml  
estufas  
2. Preparo de material para esterilização  
Embrulhar com papel duas placas de Petri para esterilização em estufa  
Embrulhar individualmente com papel, duas pipetas graduadas de 1ml para esterilização em estufa  
	Título da Aula: Meio de cultura sólido - Reconstituição de ágar simples
	Aula: N. 3
	Objetivos de Aprendizage: Apresentar ao aluno o meio de cultura padrão que será utilizado nas aulas que necessitem de um ágar simples sólido.
	 - Materiais necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
béquer de 500ml  
bastão de vidro  
bico de Bunsen  
erlenmeyr de 250ml  
algodão  e álcool a 70%
placas de Petri  
pipetas graduadas de 1ml  
estufas
PROCEDIMENTO:  
1. Preparo e distribuição de Meio de cultura NA:
  
Nutriente Agar (NA) 
extrato de carne em pó.......3,0g 
peptona de carne....5,0g 
agar simples.....................15,0g 
água destilada...800ml 
Diluir os compostos acima na água destilada em banho-maria, distribuir em placas de petri e encubar a 40ºC por 48 horas.
	Título da Aula: COLORAÇÃO WIRTZ CONKLIN
	Aula: N. 4
	Objetivos de Aprendizagem: Apresentar ao aluno coloração específica para identificar os esporos.
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
MATERIAIS:  
1. Vidrarias, Equipamentos e Diversos   
microscópio estereoscópio (lupa) 
microscópio  
lâminas e lamínulas  
bico de Bunsen  
alça de platina  
estufa  
autoclave 
tubos de ensaio  
placas de Petri  
2. Meios de Cultura e Reagentes   
Corante cristal violeta 
Solução de Iodo (Lugol)  
Álcool  
Safranina 
Solução verde de malaquita 
Corante azul de algodão 
PCA 
3. Culturas  
Microorganismos presentes na saliva humana 
	Descrição seqüenciada das atividades práticas: 
Metodologia:
PROCEDIMENTO:
Com a alça de inoculação colocar uma gota de água destilada sobre a superfície limpa da lâmina 
Flambar a alça no bico de Bunsen, mantendo a alça em contato com a chama até que fique avermelhada 
Deixar a alça esfriar e retire uma pequena porção da amostra a ser analisada 
Transferir sobre a gota de água na lâmina, esfregando a alça sobre a superfície, espalhando o conteúdo em uma camada fina e uniforme no centro da lâmina 
Passar cerca de cinco vezes a lâmina sobre a chama 
Colocar um pouco da solução de verde malaquita sobre a lâmina e deixe em repouso por 10 minutos 
Lavar com água e cubra com solução de safranina por 20 segundos 
Lavar com água, seque a lâmina com lenço de papel e examine ao microscópio 
As células vegetativas apresentarão coloração avermelhada e os esporos, verde.
	Exercícios: destacar o que o aluno deve saber referente ao tema.
O aluno deve ser capaz de diferenciar os esporos das células vegetativas. 
Título da Aula: MÉTODO PARA CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS
	Aula: N. 5
	Objetivos de Aprendizagem: Apresentar ao aluno os procedimentos para diluição da amostra, seguindo do plaqueamento.
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
MATERIAIS:  
1. Vidrarias, Equipamentos e Diversos   
microscópio   
lâminas e lamínulas  
bico de Bunsen  
alça de platina  
estufa  
tubos de ensaio  contendo 20ml de solução salina
pipetas graduadas
pipetador ou pêra
placas de Petri estéries
 ágar fundido
Leite UHT, embalagem fechada
	Descrição seqüenciada das atividades práticas: 
Metodologia:
PROCEDIMENTO:
1 - Preparar as diluições necessárias, 10-2, 10-3 e 10-4, a partir da diluição 10-1, da amostra preparada anteriormente, transferindo 10 mL da diluição inicial para tubos com 90 mL de solução salina peptonada e homogeneizar;
2 - Distribuir 1,0 mL de cada diluiçãono centro de placas de Petri estéreis adicionando-se cerca de 15 mL de Ágar Padrão para contagem fundido e resfriado a 45 °C. Misturar adequadamente e deixar solidificar;
3 - Incubar a 36±1 °C por 48 horas.
OBS.: Recomenda-se que a contagem padrão em placas seja efetuada com utilização de placas em duplicata, nas várias diluições.
3 - Obtenção dos Resultados:
3.1 - Serão consideradas significativas as contagens das diluições que apresentarem entre 30 e 300 colônias;
3.2 - Para calcular o número de UFC por grama do produto, multiplicar o número significativo encontrado pelo fator de diluição correspondente.
Observações:
Leituras abaixo de 30 colônias na menor diluição (10-1), expressar como “abaixo de 300 UFC/grama”.
Ausência de crescimento em 10-1, expressar como “abaixo de 10 UFC/grama”.
Leituras acima de 300 colônias na maior diluição expressar como “maior que 300 x 104 UFC/grama
	Título da Aula: Discussão de artigos – Métodos para a conservação dos alimentos
	Aula: N. 6
	Recursos necessários: Artigos científicos relacionados ao tema da aula
	Título da Aula: Assepsia das mãos
	Aula: N. 7
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
Álcool a 70% + algodão ( para limpeza das bancas
1. Água
2. Sabão neutro 
3. Papel toalha
4. Álcool a 70% - 2 litros
5. Placas de petri contendo meio de cultura sólido (ágar), já confeccionado – encontra-se na estufa – 20 a 30 unid
6. Swab – 10 unid
7. Bicos de bunsen – toda a bancada
8. Estufa a 37ºC por 24 horas
	Descrição seqüenciada das atividades práticas:
Lavagem das mãos e ante-braços com água e sabão;
Secagem com papel toalha;
Assepsia com álcool a 70% em parte da turma;
Coleta de amostras de possíveis microorganismos nas mãos (com assepsia realizada com água e sabão apenas e nas que passaram por assepsia com álcool e das mão que não passaram por assepsia) com swab – próximo ao bico de bunsen;
Semeadura das amostras nas placas de petri contendo ágar sólido próximo ao bico de bunsen;
 6. Incubar a 37ºC por 24 horas.
	Título da Aula: Discussão do crescimento microbiológico das mãos “limpas”
	Aula: N. 8
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
Álcool a 70% + algodão
1. Placas de petri utilizadas para a aula 7
2. Contador de colônias com fundo escuro – 1 unidade
3. Marcador de vidrarias – 2 unidade
	Descrição seqüenciada das atividades práticas:
Observar se houve crescimento microbiano;
Contar as colônias em UFC, marcando com o marcador de vidrarias e, após utilizar o contador com fundo escuro para melhor visualização das colônias;
Aplicar contagem total na fórmula;
Avaliar a eficácia da lavagem e assepsia das mãos com álcool a 70%.
	Título da Aula: Esterilidade comercial
	Aula: N. 9
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
Álcool a 70% + algodão
1.Estufa bacteriológica regulada a 36+ 1ºC
2. Contador de colônias com fundo escuro – 1 unidade
3. Placas de petri estéries – 15 unidades em qualquer tamanho
4. Pipetas graduadas de 1ml – 6 unidades
5. Tubos de ensaio contendo 20ml de água destilada cada – 15 unidades
6. Suco industrializado com esterilização UHT – 250ml – com embalagem lacrada
7. Pêra para pipetas e/ou pipetador automático – 5 unidades (total)
8. Bicos de bunsen – toda a bancada
9. Marcador de vidrarias – 2 unidades;
10. Ágar padrão fundido ou líquido – 300ml.
	Descrição seqüenciada das atividades práticas:
Preparar as diluições necessárias 10-2, 10-3, 10-4, a partir da amostra (SUCO) 10-1 usando a pipeta de 1ml após identificar os tubos de ensaio;
Homogeneizar;
Identificar as placas de petri com as respectivas diluições;
Distribuir 1,0ml de cada diluição para as respectivas placas de petri estéries;
Adicionar 15ml de ágar padrão líquido ou fundido e resfriado a 45ºC, misturar adequadamente e esperar solidificar.
Incubar a 36+ 1ºC por 48 horas
	Título da Aula: Avaliação da análise da esterilidade comercial
	Aula: N. 10
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
Álcool a 70% + algodão
1. Placas de petri utilizadas para a aula 7
2. Contador de colônias com fundo escuro – 1 unidade
3. Marcador de vidrarias – 2 unidade
	Descrição seqüenciada das atividades práticas:
Observar se houve crescimento microbiano;
Contar as colônias em UFC, marcando com o marcador de vidrarias e, após utilizar o contador com fundo escuro para melhor visualização das colônias;
Aplicar contagem total na fórmula;
Avaliar a eficácia da esterilidade comercial.
	Título da Aula: Análise microbiológica da água - Pesquisa de bactérias dos Grupos Coliforme e Coliforme Fecal pela Técnica do Número Mais Provável
	Aula: N. 11
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
Álcool a 70% + algodão
Alça de platina ou níquel-cromo nº 25 em cabo de Kolle – 5 unidades; 
Pipetas bacteriológicas de 1,0 e 10,0 mL com graduação decimal – 10 unid.;
Banho-maria de precisão regulado a 44,5 ( 0,2 °C com agitação; 
Estufa bacteriológica regulada a 36 (1 °C;
Frasco Erlenmeyer de 500 mL, contendo 225 mL de solução salina a 0,85% estéril, ou frasco de diluição, contendo 90 mL de solução salina a 0,85% estéril – 5 unidades;
Tubos de ensaio contendo 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubo de Durhan invertido – 5 unidades;
Tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo Lactosado Bile Verde Brilhante a 2% com tubo de Durhan invertido 5 unidades;
Tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo EC com tubos de Durhan invertidos – 5 unidades;
Culturas padrão de E. Coli e de Enterobacter aerogenes.
Bicos de bunsen.
2. MEIOS DE CULTURA
2.1 .Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
Composição
Concentração (g/L)
triptona 
20
lactose
5,0
cloreto de sódio
5,0
lauril sulfato de sódio
0,1
fosfato dibásico de potássio
2,75
fosfato monobásico de potássio
2,75
pH final
6,8 ( 0,2
	Descrição seqüenciada das atividades práticas:
Preparo da amostra
pesar 25 g (ou 10 g) da amostra de forma asséptica;
transferir para um triturador (ou saco do Stomacher) e adicionar 225 mL (ou 90 mL) de solução salina 0,85%, estéril;
homogeneizar durante dois minutos em velocidade máxima;
preparar diluições decimais seriadas (1:100; 1:1000), adicionando 10 mL da diluição anterior em 90 mL de solução diluente (solução salina 0,85%) estéril;
agitar os frascos vinte vezes antes de cada retirada de amostra.
( Teste presuntivo para coliformes
Inocular 3 tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose, com 1 mL da primeira diluição;
Repetir a mesma operação para as diluições subsequentes;
Incubar os tubos por 24 e 48 ( 2 h a 36 ( 1 °C;
Após 24 h verificar os tubos com produção de gás. Reincubar os tubos negativos por mais 24 h;
Para cada diluição, anotar o número de tubos com produção de gás no período de 48 ( 2 h.
( Teste confirmativo para coliformes
Transferir uma alçada (com o auxílio da alça de inoculação) de cada tubo positivo do teste presuntivo para outro tubo contendo 10 mL de caldo lactosado bile verde brilhante;
Incubar os tubos por 24 e 48 ( 2 h a 35 ( 0,5 °C;
Após 24 h verificar os tubos com produção de gás. Reincubar os tubos negativos por mais 24 h;
Para cada diluição, anotar o número de tubos com produção de gás no período de 48 ( 2 h;
Verificar na tabela o NMP de coliformes;
Expressar o resultado como NMP de coliformes por mL ou g de amostra, conforme o caso.
( Teste para coliformes fecais
Transferir uma alçada (como auxílio de uma alça de inoculação) de cada tubo positivo do teste presuntivo para outro tubo contendo 10 mL de caldo EC;
Incubar a 44,5 ( 0,2 °C por 24 h;
Verificar o número de tubos com produção de gás, somente considerar os resultados confiáveis quando os controles apresentarem crescimento com gás para Escherichia coli e ausência de crescimento ou crescimento sem gás para Enterobacter aerogenes;
Verificar na tabela o NMP de coliformes;
Expressar o resultado como NMP de coliformes fecais por mL ou g de amostra.
( Teste para verificar a presença de Escherichia coli
Selecionar os tubos positivos do caldo EC e semeá‑los , por estrias em ágar EAM;
Incubar a 35 °C por 24 h;
Verificar a presença de colônias típicas de E coli, colônias negras com brilho verde metálico. 
	Título da Aula: Contagem de Bacillus cereus
	Aula: N. 12
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
Álcool a 70% + algodão
Estufa bacteriológica regulada a 30±1°C;
Microscópios;
Pipetas bacteriológicas de 1,0 mL com divisões decimais – 5 unidades;
Bastão de vidro em L ou alça de Drigalski (1 para cada amostra);
Placas de Petri contendo meio de Vermelho de fenol, gema de ovo, polimixina – 5 unidades;
Placas de Petri contendo meio de Ágar gelatina – 3 unidades – para PARTE II;
Tubos de Ágar Nutriente inclinado – 10 unidades;
Tubos de ensaio contendo meio para fermentação da glicose 5 unidades – para PARTE II;
Corantes para Gram – para PARTE II;
Solução de HgCl2 a 3% - para PARTE II;;
Vaselina líquida esterilizada – para PARTE II;
Tubos estéreis de 12x120 mm – 10 unidades;
	Descrição seqüenciada das atividades práticas:
. Semear 0,1 mL da diluição 10-1 da amostra no centro da placa de Petri contendo o meio Vermelho de fenol, gema de ovo, polimixina;
. Espalhar por toda a superfície da placa, com o auxílio do bastão de vidro em “L” ou da alça de Drigalski;
. Deixar secar por cerca de 15 minutos, inverter a placa e incubar a 30±1 °C por 18 a 24 horas;
. Verificar o crescimento de colônias características. Neste meio elas se apresentam redondas, planas, secas, com aparência de vidro moído, translúcidas e geralmente com bordos regulares, róseas e com halo de precipitação devido a ação da lecitinase;
. Marcar e contar as colônias suspeitas. O número significativo de colônias está entre 5 e 50;
. O resultado obtido representa a contagem presuntiva de Bacillus cereus.
	Título da Aula: Contagem de Bacillus cereus – PARTE II
	Aula: N. 13
	Recursos necessários: (referência máximo de 25 alunos por laboratório) – POR LABORATÓRIO SOLICITADO
Álcool a 70% + algodão
Ver aula N. 13
	Descrição seqüenciada das atividades práticas:
. Provas complementares de IDENTIFICAÇÃO
1. Isolamento
. Isolar em Ágar Nutriente um número de colônias correspondente a raiz quadrada do número total de colônias características presentes na placa, com o isolamento mínimo de 5 colônias;
. Incubar a 30±1 °C por 18 a 24 horas;
. Examinar, pela coloração de Gram, as culturas obtidas. O Bacillus cereus é um bastonete Gram positivo e esporulado.
2. Teste da Gelatinase
. Semear, por estrias, as culturas puras, em placas contendo Ágar gelatina e incubar a 30±1°C por 24 horas;
. Após incubação espalhar HgCl2 pela superfície das placas;
. Após alguns minutos, verificar a presença de um halo transparente ao redor da colônia. Este halo indica que houve a hidrólise da gelatina, sendo o Bacillus cereus gelatinase positiva.
Teste da Fermentação de Glicose
. Aquecer os tubos contendo o meio para fermentação, em banho-maria em ebulição por aproximadamente 10 minutos, para remover o oxigênio do meio e esfriar em água gelada;
	
. Semear no meio anterior, uma porção de cada cultura pura isolada;
. Estratificar com uma camada de vaselina líquida esterilizada, para manter a anaerobiose e incubar a 30±1°C por 18 a 24 horas;
. Verificar se houve mudança da coloração do meio para o amarelo, indicativa da fermentação do açúcar, com a produção de ácido. O Bacillus cereus é fermentador da glicose.
Obtenção e expressão dos resultados:
. Exemplo
Calcular o número de Bacillus cereus por grama (ou mililitro) do produto como no exemplo a seguir:
Número total de colônias típicas na placa: 25 (N)
Número de colônias isoladas: 5 (I)
Número de colônias confirmadas: 3 (n)
Cálculo: (S x D)/A
onde S = (n/I) x N
S = total de colônias confirmadas
D = diluição
A = fator da alíquota
Cálculo: [(3 / 5) x 25 x 10]/0,1 = 15 x 102 = 1,5 x 103
. Expressão do resultado:
Bacillus cereus ............... 1,5 x 103 U.F.C./g
Observação: Recomenda-se, na realização do teste, o uso de placas em duplicata.
	Título da Aula: Microorganismos presentes em produtos comerciais – discussão de artigos e aula expositiva
	Aula: N. 14
	Recursos necessários: 
Artigos científicos
Bibliografia Principal: 
 FRANCO, B. Microbiologia dos Alimentos. SP: Atheneu, 2001.
 STEPHEN, J.F. Microbiologia da Segurança Alimentar. Porto Alegre: Artmed, 
 2005.
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Semestre – 2012.1