Metabolismo dos Nucleotídeos

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Metabolismo dos Nucleotídeos
Prof. Msc. Andriu Catena - Biomédico
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
Modelo “Escada retorcida”
Corrimãos são formados por fosfatos e desoxirribose, enquanto os degraus são constituídos pelos pares de bases nitrogenadas
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
A estrutura da molécula de ADN foi descoberta conjuntamente pelo norte-americano James Watson e pelo britânico Francis Crick em 7 de Março de 1953, o que lhes valeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1962, juntamente com Maurice Wilkins.
Do ponto de vista químico, o ADN é um longo polímero de unidades simples (monômeros) de nucleotídeos, cuja cadeia principal é formada por moléculas de açúcares e fosfato intercalados unidos por ligações fosfodiéster. Ligada à molécula de açúcar está uma de quatro bases nitrogenadas. A sequência de bases ao longo da molécula de ADN constitui a informação genética.
3
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
RNA – Ácido Ribonucleico
Dogma Central da Biologia Molecular
https://www.youtube.com/watch?v=9kOGOY7vthk
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Mutações
Epigenética
Ctrl + C
Ctrl + V
Gêmeos idênticos: clones perfeitos?
Câncer
Síndrome da Lise Tumoral (SLT)
Consequência metabólica
Resposta ao tratamento do câncer
u
Quimioterápicos:
Antimetabólitos
ANÁLOGOS ESTRUTURAIS: bases púricas, pirimídicas e nucleosídeos.
5-fluorouracil (Fura)
FUTP
FdUMP
u
Quimioterápicos:
Antimetabólitos
ANÁLOGOS ESTRUTURAIS: bases púricas, pirimídicas e nucleosídeos.
5-fluorouracil (Fura)
FUTP
FdUMP
u
Quimioterápicos
5-fluorouracil (Fura)
O Flúor presente na molécula do 5-Fluorouracil inibe a formação de dTMP
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u
Quimioterápicos:
Antimetabólitos
6-Mercaptopurina (6-MP)
- Redução da síntese de novo
 Citidina Desoxicitidina Citosina arabinosídeo (AraC) 
Citosina arabinosídeo trifosfato (araCTP) 
dCTP
Quimioterápicos:
Antimetabólitos
Citosina arabinosídeo (AraC)
Quimioterápicos - antifolatos
Metotrexato (MTX)
Quimioterápicos
Metotrexato (MTX) e FdUMP
Quimioterápicos: inibidores da glutamina
Azasserina e Acivicina
 2 moléculas de glutamina;
 IMP  XMP  GMP
Síntese de novo das PURINAS:
 síntese de carbamoil fosfato;
 UTP  CTP
Síntese de novo das PIRIMIDINAS:
Diagnóstico de doenças virais e parasitarias (infectocontagiosas)
Identificação do defeito genético
Diagnóstico
Medicina preventiva
Farmacogenética
Terapêutica
Doenças com componente genético
Câncer: diagnóstico, prognóstico e tratamento
Perícia criminal
Teste de Paternidade
Diagnóstico de Doenças Metabólicas
Ferramentas Moleculares
 Kary Mullis, geneticista 
Nobel Prize em Química (1993) pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA
PCR
PCR é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.
Etapas:
Desnaturação;
Anelamento;
Extenção 
(polimerização).
O número de bases nos alvos pode variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
PCR
Componentes químicos da PCR
Termociclador: equipamento eletrônico para ser utilizado em laboratórios que utilizam técnicas baseadas na manipulação ou identificação de DNA.
PCR
PCR – como visualizar?
RT-PCR
qPCR
RT-PCR
RT-PCR
qPCR
O PCR em Tempo Real permite o monitoramento do produto de PCR gerado durante a corrida através da ajuda de corantes intercalantes ou oligonucleotídeos marcados com fluorescência.
Semelhanças com a PCR convencional
 A sequência-alvo a ser amplificada é flanqueada por primers.
Método de amplificação de ácidos nucléicos, que acontece em um termociclador;
Depende da reação em cadeia da polimerase;
Diferenças da PCR convencional
As medidas são realizadas durante cada ciclo e exibidas na tela em tempo real
Corantes fluorescentes e o termociclador é capaz de medir essa intensidade; 
A fluorescência aumenta de forma proporcional à quantidade de amplicons;
qPCR
qPCR
SYBR Green (2ª Geração)
dsDNA + corante livre
(fluoróforo fraco)
Ligado a dupla fita
(fluorescencia 1.000x)
Corante é excitado a 497 nm e emite a 520 nm.
Corante ligante mostra aumento da fluorescência quando ligado ao esqueleto de dsDNA.
CORANTE INTERCALANTE NÃO-SATURANTE
qPCR
Métodos de detecção – Corantes intercalantes dsDNA
Probes de hidrólise
qPCR
Métodos de detecção – Corantes intercalantes dsDNA
Sequenciamento
https://www.youtube.com/watch?v=e3UOaIXukeQ
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Sequenciamento
Eletroferograma parcial de uma sequência de DNA
Sequenciamento
 Investigação do gene;
 Mutações muito próximas.