Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Bioquímica I – Resumo do Módulo III (Biologia Molecular) O DNA é uma molécula de função ímpar nos organismos vivos. Hoje em dia é de conhecimento geral que elas estão totalmente ligadas ao armazenamento e transmissão de informação, condição fundamental para a vida. Além dos DNA, moléculas compostas por desoxirribonucleotídeos, temos as moléculas de RNA, compostas por ribonucleotídeos e que apresentam múltiplas funções, como a de transmissão de mensagens, composição de organelas, armazenamento e transmissão de informação como o DNA, além de diversas outras coisas. A genética molecular começou a ser reconhecida como ciência apenas no século XX, quando ocorreram uma série de experimentos importantes os quais deram base para todo o conhecimento que temos atualmente sobre assunto. Dentre esses experimentos clássicos, podemos citar cinco: Experimento de Griffiths (1928) Feito a partir da manipulação de cepas de Pneumocócus (Streptococcus pneumaniae), Frederick Grifitths realizou um processo denominado transformação bacteriana, tipo de recombinação característica de bactérias. Esse experimento envolveu dois tipos de cepas: as cepas S, as quais possuiam virulência e as cepas R, que eram uma forma mutada, sem virulência. Dessa forma, utilizando cobaias, ele fez quatro testes mudando as combinações de cepas. Na primeira cobaia, ele adicionou somente a cepa S vivas, resultando na morte do camundongo. Na segunda, ele adicionou as cepas S aquecidas e portanto, mortas pelo calor. Como resultado, essa segunda cobaia permaneceu viva. Na terceira cobaia ele adicionou apenas as cepas R vivas e, como era esperado, a cobaia permaneceu viva. Na quarta cobaia ele misturou as cepas tipo S mortas pelo calor com as tipo R vivas, combinação a qual levou o camundongo ao óbito. Então, a partir disso, Griffiths descobriu a existência de um “princípio transformante”. Hoje, como mencionado acima, sabemos que o que ele fez nada mais foi do que um processo denominado transformação, na qual uma parte ou todo um genoma de um indivíduo é incorporado em outro, lhe dando características fenotípicas novas. Experimento de Avery, McLoad & McCarthy A partir dos resultados obtidos por Griffiths, em 1944, Avery, MacLoad & McCarthy publicaram a primeira evidencia direta que o matrial genético era o DNA e não uma proteína. Esse experimento utilizou uma série de lisozimas especiais para diferentes moléculas, ou seja, RNAses, Proteases, DNAses, Lipases em cepas S e depois adicionando-as em culturas com cepas R. Apenas em um caso tivemos apenas cepas R no final do experimento: quando as cepas S foram tratadas com DNAses. Dessa forma eles descobriram que o DNA era o “principio transformante” de griffiths Experimento de Hershey e Chase Através de experimentos utilizando um bacteriófago T2 (vírus), responsável por infectar E. coli, Alfred Hershey e Martha Chase publicaram em 1952 mais uma prova de que o DNA era o princípio transformante. O experimento se concentrou basicamente na marcação dos capsídios virais e do DNA desse bacteriófago. Primeiramente eles marcaram os capsídios com 35S e adicionaram o vírus em meio de cultura de E. Coli. Feito isso, ele adicionaram esse mix em uma centrífuga e feito isso, eles perceberam que a porção radioativa estava no sobrenadante enquanto o pellet de células continha pouca radioatividade. Em outro mix, eles adicionaram o mesmo bacteriófago, mas dessa vez ao invés de marcação com enxofre no capsídio, marcaram os fosfatos do DNA. Dessa forma, o material genético continha 32P, isótipo radioativo do fosforo. Após a confecção do mix desse bacteriófago com a E. coli e centrifugação, perceberam a formação de um pellet de células com radioatividade enquanto o sobrenatante era bem pouco radioativo. A partir desses resultados eles concluiram que era o DNA a molécula que era capaz de adentrar as células bacterianas e provocar a reprodução desses vírus. Experimento de Chargaff (1940) Realizado por Erwin Chargaff e seus colaboradores, foi responsável por descobrir que as quatro bases nucleotídicas do DNA eram encontradas em porções diferentes nos DNAs de organismos diferentes e que as quantidades de certas bases estavam relacionadas. A partir desses dados, eles chegaram as seguintes conclusões: 1. A composição de bases do DNA, em geral, varia de uma espécie para outra 2. Amostras de DNA isoladas de diferentes tecidos da mesma espécie têm a mesma composição de bases 3. A composição de bases de DNA em uma dada espécie não muda com a idade do organismo, seu estado nutricional ou a mudança de ambiente 4. Em todos os DNAs celulares, independentemente da espécie, o número de resíduos da adenosina é igual ao número de resíduos da timidina (ou seja %A=%T) e o número de resíduos de guanosina é igual ao número de resíduos de citidina (ou seja %G=%C). A partir disso, conclui-se que a soma dos resíduos de purinas (A ou G) é igual à soma dos resíduos de pirimidina, ou seja, A + G = T + C. Experimento de Watson & Crick (1953) A partir dos resultados de Chargaff e de dados cristalográficos fornecidos por Maurice Wilkins e Rosalind Franklin, Watson & Crick deduziram a estrutura correta do DNA. Eles posturalaram que essa molécula se organizava em uma dupla hélice dextrógira em qual cada cadeia polinucleotídica, formada por nucleotídeos, é ligada por ligações fosfodiester e as cadeias adjacentes são ligadas a partir de pontes de hidrogenio entre as bases nitrogenadas. Postularam também que as fitas de DNA eram na realidade não iguais mas sim complementares e que cada par de bases ligadas estavam a 0,34 A de distância um do outro e que cada torção da molécula é formada por 3,6 A, contendo 10 pares de nucleotídeos. Durante uma volta eles tende a assumir uma conformação um pouco mais distendida. Os ácidos nucleicos A sequência de aminoácidos de cada proteína em uma célula e a sequência nucleotídica de cada RNA são especificada pela sequência nucleotídica do DNA da célula. Um segmento de uma molécula de DNA que contém a informação necessária para a sintese de um produto biológicamente funcional, seja ele uma proteína ou DNA, é denominado gene. Uma célula costumam ter milhares dessas sequências, fazendo com que não seja uma surpresa o tamanho das moléculas de DNA, molécula responsável então pelo armazenamento e transferência de informação biológica, única função conhecida desse polímero. O RNA, ao contrário do DNA, tem amplas funcionalidades dentro de uma célula e podem ser configurar em diferentes classes dentro de uma célula. Os RNA ribossomais (rRNAs) são componentes dos ribossomos, os complexos que executam a síntese proteica. Os RNAs mensageiros (mRNAs) são intermediários, carregando a informação genética de um ou poucos genes para o ribossomo, local onde teremos a produção efetiva de uma proteína. Os RNAs transportadores (tRNAs) são moléculas adaptadoras que traduzem fielmente a informação no mRNA em uma sequência específica de aminoácidos. Por mais que essas três classes de moléculas sejam as mais conhecidas, elas não representam a maioria do RNA gerado em uma célula. Temos os RNAs especiais que apresentam diversas funções celulares. Os Nucleotídeos Os nucleotídeos são unidades monoméricas que geralmente estão associadas a formação dos ácidos nucleicos. Entretanto, essas móleculas são responsáveis por muito mais funções dentro da estruturação e metabolismo de uma célula. Dentre essas funções podemos citar: São moedas energéticas nas transações metabólicas (ATP e GTP por exemplo); Essenciais na resposta celular a hormônios e outros fatores extracelulares (cAMP); Importantes na estrutura de cofatores enzimáticos e intermediários metabólicos (Coenzima A); Armazenamento de informação genética (RNA e DNA); Estrutura dos nucleotídeos Os nucleotídeos apresentam três componentes característicos: Uma base nitrogenada (contendo nitrogênio em sua composição); Uma pentose (glicídeo) Um ou mais fosfatos Quando a molécula está livre do grupamento fostado, é denominada de nucleosídeo. As que possuem são denominadas de nucleotídeos. Estrutura de um ribonucleotídeo. Nos desoxirribonucleotídeos a hidroxila OH é substituída por um H. As bases nitrogenadas Esses nucleotídios podem ser classificados de duas formas em relação a estrutura da base nitrogenada – Adenina, Guanina, Citosina, Timina ou Uracila – relacionada aos compostos que as derivam. Quando essa parte da molécula apresenta apenas um anel, é denominada pirimidina e quando apresenta dois anéis, é denominada purina. São derivadas de purinas as bases Adenina e Guanina e de pirimidinas as bases Citosina, Timina e Uracila. As bases nitrogenadas são compostos fracamente básicos, dando esse nome característico, e também aromáticos. Graças a característica aromática, todos as moléculas absorvem luz UV a 260 nm graças a ressonância do anel. As puninas e piridimidinas O deslocamento dos eletrons entre os átomos no anel confere à maioria das ligações caráter parcial de ligação dupla. O resultado é que as pirimidinas são moléculas planares e as purinas são próximas de uma estrutura planar com uma leve prega. As bases púricas e pirimidicas são hidrofóbicas e relativamente insolúveis em água perto do pH neutro da célula. Em pH ácido elas se tornam carregadas e a sua solubilidade aumenta. Os grupos funcionais das purinas e das pirimidinas são anéis nitrogenados, grupos carbonilas e grupos amino exocíclicos. As ligações de hidrogênio envolvendo os grupos amino e carbonila são as forma mais importante de interação entre duas (ou ocasionamente três ou quatro) cadeias complementares de ácidos nucleicos. São essas ligações que fazem as bases nitrogenadas se ligarem entre si, sendo entre uma Adenina e uma Timina ou Uracila, duas ligações e entre Guanina e Citosina, três ligações. Isso, de certa forma, é a fonte para as relações e formação dos pares de bases, postulado por Watson e Crick a partir de dados de Chargaff. A base de um nucleotídeo é ligada covalemente (no N-1 das pirimidinas e nos N-9 das purinas) por uma ligação N- β- glicosídica ao carbono 1’ da pentose, e o fosfato é esterificado (ou sejam ligado por uma ligação do tipo éster) no carbono 5’. Nessa reação, a pentose, que apresenta uma hidroxila livre, que pode se configurar na posição α ou β, mas que geralmente é β, reage com uma purina ou pirimidina e um dos grupamentos nitrogenados vai reagir com a hidroxila, liberando água e gerando uma nucleosídeo. Com a adição do grupamento fosfato, temos o nucleotídeo formado. Além das bases já apresentadas acima, podemos ter outras bases diferenciadas ou secundárias que nada mais são do que modificações das que foram mencionadas. No DNA, as mais comuns são as que possuem formas metiladas das bases principais. Em alguns DNAs virais, algumas bases podem ser hidroximetiladas ou glicosiladas. Essas formas alteradas ou raras na molécula de DNA muitas vezes estão relacionada a proteção da informação genética ou em funções de regulação. Elas também pode ser encontradas em RNAs, principalmente nos transportadores. Pentoses No que diz respeito ao açúcar, o qual é uma pentose, tal carater pode variar dependendo de que ácido nucleico estamos falando. Caso tenhamos um DNA, o tipo de pentose que teremos na estrutura do nucleotídeo será uma 2-dexosi-D-ribose e caso estejamos falando de um RNA, se tratará de uma D-ribose. Esses dois açúcares são os responsáveis por determinar o que é um DNA e o que é um RNA. Além disso, a diferença desses açucares se baseia no grupo ligante do carbono 2’ da pentose. Caso seja uma hidroxila (OH), se tratará de uma ribose e, caso o que se ligue seja um hidrogênio (H), estaremos falando de um dexosirribose. Em ambos os casos, a pentose consiste em um anel de β-furanose, o qual não é planar, mas é muito próximo disso possuindo conformação pregueada. Os anéis de ribofuranose nos nucleotídeos podem existir em quatro diferentes conformações pregueadas. Em todos os casos, quatro dos cinco átomos estão em forma planar. O quinto átomo (c-2’ ou c-3’) está no mesmo lado (endo) ou no lado oposto (exo) do plano em relação ao átomo de C-5’. O grupamento fosfato e as ligações fosfodiéster Os nucleotídeos consecutivos dos ácidos nucleicos são ligados covalentemente por pontes de grupos fosfato, nas quas os grupos 5’-fosfato de uma unidade nucleotídica é ligado ao grupo 3’-hidroxila do próximo nucleotídeo, criando uma ligação fosfodiéster. Portanto, o esqueleto covalente dos ácidos nucleicos consiste em fosfatos e resíduos de pentose alternados, e as bases nitrogenadas podem ser consideradas como grupos laterais ligados ao esqueleto em intervalos regulares. Além disso, o esqueleto do DNA e do RNA possuem caráter hidrofílico graças as ligações de hidrogênio que as hidroxilas dos resíduos de açúcar podem formar com a água. Dessa forma, entendemos os ribonucleotídeos como mais instáveis que os ribonucleotídeos. Isso se dá pois como há mais uma hidroxila livre possibilitando a hidrólise da mesma em pH alcalino. As células também contêm nucleotídeos com grupos fosfatos em posições diferentes do carbono 5’. Os ribonucleosídeos 2’, 3’-monofosfato cíclicos são intermediários isoláveis e os ribonucleosídeos 3’-monofosfato são os produtos finais de hidrólise do RNA por certas ribonucleases. Outras variações são adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico (cAMP) e guanosina 3’, 5’-monofosfato cíclico (cGMP). Todas as ligações fosfodiéster no DNA e no RNA têm a mesma orientação ao longo da cadeia, conferindo a cada fita do ácido nucleico uma polaridade específica e extremidades 5’ e 3’ diferentes. Por definição, a extremidade 5’ não apresenta um nucleotídeo na posição 5’, e a extremidade 3’ não apresenta um nucleotídeo na posição 3’. Outros grupos (mais frequentemente um ou mais fosfatos) podem estar presentem em uma ou em ambas as extremidades. A orientação 5’ para 3’ de uma fita de ácido nucleico refere-se a uma extremidade da fita, não a orientação da ligação fosfodiéster individual ligando seus nucleotídeos constituintes. A estrutura dos ácidos nucleicos Assim como nas estruturas proteicas, muitas vezes é útil descrever a estrutura de ácidos nucleicos em termos de níveis de complexidade hierárquicos (primário, secundário, terciário). A estrutura primária dos ácidos nucleicos é sua estrutura covalente e sequência nucleotídica. Qualquer estrutura regular e estável adotada por alguns ou todos os nucleotídeos em um ácido nucleico pode ser considerada como estrutura secundária. O enovelamento complexo de grandes cromossomos dentro da cromatina eucariótica e o nucleoide bacteriano ou o elaborado enovelamento de grandes moléculas de tRNA ou rRNA geralmente são considerados estruturas terciárias. Watson e Crick, em 1953, postularam o modelo tridimensional da estrutura do DNA, levando em consideração todos os dados disponíveis naquele momento. O modelo consistia em duas cadeias de DNA helicoidais enroladas em torno do mesmo eixo para formar uma dupla-hélice de orientação à direita. Os esqueletos hidrofílicos de grupos fosfatos e desoxirribose alternados estão no lado de fora da dupla-hélice, orientados para a água circundante. O anel furanosídeico de cada desoxirribose está na conformação C-2’Endo. Asbases pirimídicas e puricas das duas fitas estão empilhadas dentro da dupla-hélice, com suas estruturas hidrofóbicas em forma de anel e quase planares muito perto uma da outra e perpendiculares ao eixo longitudinal. O pareamente perfeito das duas fitas cria um sulco maior e um sulco menor na superfície do duplex. Cada base nucleotídica de uma fita está pareada no mesmo plano com a base de outra fita. Watson e Crick descobriram que os pares de bases unidos por ligações de hidrogênio de G com C e de A com T são aqueles que melhor se enquadram dentro da estrutura, fornecendo uma base lógica para a regra de Chargaff que, em qualquer DNA, G=C e A=T. É importante também nos atentarmos também ao fato que podem se formar três ligações de hidrogênio entre G e C e apenas duas entre A e T. Dessa forma quanto maior for a quantidade de pareamentos de G e C, mais difícil será a abertura da fita. Quando Watson e Crick construíram seu modelo, eles tiveram que decidir inicilamente se as fitas de DNA seriam paralelas ou antiparalelas, ou seja, se suas ligações fosfodiéster 3’,5’ iriam seguir no mesmo sentido ou em sentidos opostos. Uma orientação antiparalela produziu o modelo mais convincente, sendo corroborado posteriormente por estudos com DNA- polimerases e análises de raio-X. Para explicar a periodicidade nos padrões de difração de raios X das fibras de DNA, Watson e Crick manipularam modelos moleculares para chegar à estrutura em que a distância entre as bases empilhadas verticalmente no interior da dupla-hélice seria de 3,4 Å ; uma distância de repetição secundária de aproximadamente 34 Å foi atribuída para a presença de 10 pares de bases em cada volta completa da dupla-hélice. Em solução aquosa, a estrutura é um pouco diferente da que se obteve o DNA, havendo 10,5 pares de bases por volta helicoidal e assumindo então 36 A ao invés de 34. As duas cadeias polinucleotídicas antiparalelas da dupla-hélice de DNA não são idênticas nem na sua sequência de bases e nem na sua composição. Elas são complementares entre si. Sempre que a Adenina está presente em uma cadeia, a timina é encontrada na outra. O mesmo ocorre com a Guanina e a Citosina. A dupla-hélice de DNA, ou duplex, é mantida por duas forças: as ligações de hidrogênio entre os pares de bases complementares e interações de empilhamento de base. A complementaridade entre as cadeias de DNA é atribuída à ligação de hidrogênio entre os pares de bases. As interações de empilhamento de bases, as quais são muito inespecíficas no que diz respeito à identidade das bases empilhadas, determinam a maior contribuição para a estabilidade da dupla-hélice. Por fim, esse modelo permitiu Watson e Crick visualizarem muito antes da disponibilidade de dados comprobatórios, que essa estrutura poderia ser replicada de forma lógica pela separação das duas cadeias e síntese de uma cadeia complementar a cada uma delas. Uma vez que, em cada nova cadeia, os nucleotídeos são unidos na sequência especificada pelas regras de pareamente de bases postulada por Chargaff, cada cadeia preexistente funciona como molde para direcionar a síntese de uma cadeia complementar. Dessa forma, sabemos hoje em dia que a replicação é portanto semi-conservativa e é um mecanismo elegante e inteligente de perpetuação de informação genética. As diferentes formas tridimensionais possíveis para o DNA O DNA é uma molécula extremamente flexível. Rotação considerável é possível em torno de vários tipos de ligações no esqueleto açúcar-fosfato (fosfodesoxirribose) e flutuação térmica pode produzir enovelamento, alongamento e desnaturação (fusão) das cadeias. Muitas variações significativas da estrutura de DNA de Watson e Crick são encontradas no DNA celular, algumas ou todas elas podem ser importantes no metabolismo de DNA. Essas variações estruturais geralmente não afetam as propriedades-chave do DNA descritas por Watson e Crick: complementaridade das cadeias, cadeias antiparalelas e a exigência do pareamento A=T e G=C. Variação estrutura no DNA reflete três aspectos: as diferentes conformações possíveis da desoxirribose, a rotação em torno das ligações contíguas que constituem o esqueleto de fosfodesoxirribose e a rotação livre em torno da cade C-1’-N-glicosídica. Devido a restrições estéricas, as purinas nos nucleotídeos púricos estão restritas a duas conformações estáveis com respeito à desoxirribose, denominadas syn e anti. As pirimidinas geralmente estão restritas à conformação anti, devido a interferências estéricas entre o açúcar e o oxigênio da carbonila no C-2 da pirimidina. A estrutura de Watson e Crick também é conhecida como forma B do DNA ou B-DNA. Existe, entretanto mais duas formas bem caracterizadas: as formas A e Z. A forma B é a estrutura mais estável para uma molécula de DNA de sequência aleatória sob condições fisiológicas, sendo, desta forma, o ponto de referência padrão em qualquer estudo das propriedades do DNA. A forma A é favorecida em muitas soluções que são relativamente livres de água. A forma Z é a mais modificada de todas, tendo esse formato associado a regulação gênica já que quando a molécula está nessa conformação não há expressão. Algumas sequências de DNA adotam estruturas incomuns. As variações estruturais dependentes de sequência encontras em cromossomos grandes podem afetar a função e metabolismo dos segmentos de DNA em suas adjacências. Um exemplo claro é o aparecimento de curvaturas no DNA quando temos quatro ou mais resíduos de adenosina sucessivamente em uma cadeia. Outro tipo de sequência bem comum é um palindromo, que são sequências de ácidos nucleicos de fita dupla com simetria dupla ou seja regiões de DNA com repetições invertidas de sequências de bases tendo simetria dupla nas duas cadeias de DNA. Tais squencias são autocomplementares dentro de cada cadeia e, consequentemente tem potencial de formar grampos ou estruturas cruciformes. Outras estruturas de DNA incomuns envolvem três ou até mesmo quatro cadeias de DNA (formando triplex ou tetraplex de DNA). Os nucleotídeos participantes de um par de bases do tipo Watson-Crick (A=T ou C=G) podem formar ligações de hidrogênio adicionais, especialmente com grupos funcionais ancorados no sulco maior. Os átomos que participam na ligação de hidrogênio do triplex de DNA frequentemente são denominados posições de Hoogsteen e o pareamento do tipo não Watson-Crick é chamado de pareamento de Hoogsteen. Os triplex são mais estáveis em pH mais baixos e podem se formar facilmente quando temos uma cadeia de pirimidinas em uma fita e outra só de purinas na complementar. Os tetraplex (tetraplex G) são mais ocorrentes em DNAs com altas quantidades de guanosinas e são estáveis em uma série de situações. É importante salientarmos ainda que os palindromos e as estruturas triplex e tetraplex são de grande importância para a regulação gênica. Os palindromos são geralmente sítios de reconhecimento de proteínas de DNA e as outras estruturas são responsáveis por diminuir a expressão gênica. Propriedades químicas da molécula de DNA Como o papel do DNA envolve a transmissão e reposição da informação genética, a manutenção da sua forma e sua estabilidade são fatores cruciais. A molécula podem sofrer pequenas alterações químicas naturalmente que são lentas e pequenas mas que, ainda assim, podem ser significativas. Processos como a carcinogênese e envelhecimento podem estar intimamente ligados ao acúmulo lento e irreversível de alterações no DNA. Dessa forma a preservação de sua estrutura e crucial para que os processos metabólicos ocorram de forma correta. Tanto o DNA quanto os RNAs dupla-hélices podem ser desnaturadosa partir da mudança de temperatura e pH. Em pH 7,0 e temperatura ambiente o DNA está em sua estrutura nativa mas ao ser submetido a situações de pH extremos ou ainda, de altas temperaturas, esse desenovelamento ou fusão pode ocorrer. E esse desenovelamento pode ser ainda parcial ou total. Em ambos os casos o reenovelamento ocorre mas no total ele é mais lento enquanto que o parcial, quando posto em situação “normal” de temperatura e pH reenovela rapidamente. O rompimento das ligações de hidrogênio entre pares de bases e de bases empilhadas causam desenrolamento da dupla-hélice para formar duas cadeias simples, completamente separadas uma da outra pela molécula inteira ou denominado efeito hipercrômico. A transição entre DNA de cadeia dupla e a forma desnaturada de cadeia única pode ser então detectada pelo monitoramento da absorção de luz UV a 260 nm, sendo quando mais enovelada, menor a absorção. Podemos ainda estabelecer as quantidades de G eC ou A e T a partir da temperaturas em DNAs bacterianos ou virais. Isso ocorre porque com o calor, eles desnaturam vagarosamente. A temperatura de melting ou de fusão (Tm) representa a temperatura em que 50 % desse DNA está desnaturado. Quanto maior for o percentual de G e C, maior será essa temperatura de melting. Entretanto, as taxas de desnaturação ainda podem ser afetadas por faltores com temperatura, comprimento, concentrações de fragmentos de DNA, concentrações de sais, logo, esses fatores precisam ser mantidos constantes caso queiramos medir esses parâmetros. DNAs de cadeia simples desnaturados de duas espécies podem formar o denominado duplex híbrido, sendo o grau de hibridização totalmente dependente da extensão das sequências semelhantes e dos fatores citados acima. A possibilidade de formação desses duplex é reflexo da herança evolutiva de algumas regiões muito conservadas, que provavelmente geram proteinas e RNAs os quais tem função semelhantes em diferentes espécies. Transformações não-enzimáticas Os nucleotídeos e ácidos nucleicos também podem sofrer transformações as quais não necessitam de nenhuma enzima para ocorrer. As alterações na estrutura do DNA que produzem mudanças permanentes na informação genética codificadas pelo DNA são chamadas de mutações. A partir disso podemos ter a desaminação dos nucleotídeos, as quais geram mal pareamento. É necessário ressaltar o caso da Uracila, que com a amina, assume forma de citosina. Dessa forma, não haveria como diferenciar uma base da outra e, por isso, a evolução padronizou a timina como componente do DNA muito provavelmente. Outro tipo de modificação é a hidrólise das ligações N-B-Glicosídicas entre as bases e as pentoses. Outras reações podem ser promovidas pela radiação UV, ou como os raios X ou Gama, radiações essas que cedem energia para a formação de dímeros (ligações entre grupos que não deviam se ligar) e provocar dobras, gerando consequências indesejáveis. O DNA também pode ser danificado por reagentes químicos introduzidos por usos de produtos de atividade industrial. São divididos em duas classes principais: (1) agentes desaminantes, especialmente ácido nitroso (HNO2) ou compostos que podem ser metabolizados a ácido nitroso ou nitritos e (2) agentes alquilantes. Entretanto a fonte mais importante de alterações mutagênicas no DNA é o dano oxidativo. Espécies reativas de oxigênio como peróxido de hidrogênio, radicais hidroxila e radicais superoxidos, surgem como produtos do metabolismo aérobio. As células possuem um sistema de defesa utilizando enzimas que convertem esses compostos reagentes em inofensivos. Entretanto, uma fração desses composto sempre escapa promovendo esse dano. Metilação do DNA Certas bases nucleotídicias em moléculas de DNA são metiladas enzimáticamente. A adenina e a citosina são metiladas com mais frequência do que guanina e timina. A metilação geralmente pe restrita a certas sequências ou regiões da molécula de DNA. Em alguns casos, a função dessa metilação é bem conhecida mas em outros, a sua ocorrência ainda é bastante obscura. Sabe-se entretanto que esses eventos estão relacionados a regulação transcricional e reconhecimento de DNA, no caso de E. coli. Outras funções dos nucleotídeos Além de suas funções como subunidades dos ácidos nucleicos, os nucleotídeos tem uma variedade de outras funções em cada célula, tais elas: como carreadores de energia ou moedas energéticas; como componentes de cofatores enzimáticos; e como mensageiros químicos. 1) Carreadores de energia O grupo fosfato ligado covalentemente na hidroxila 5’ de um ribonucleotídeo pode ter um ou dois fosfatos adicionais ligados. As moléculas formadas são conhecidas como nucleosídeos (?) mono, di e trifosfatos. Iniciando a partir da ribose, os três fosfatos geralmente são rotulados de a, b e y. A hidrólise de nucleosídeos trifosfatos produz energia química parada direcionar muitas reações celulares. A adenosina 5’-trifosfato, também conhecida como ATP, é a mais utilizada mas UTP, GTP e CTP também podem ser utilizados em algumas reações. 2) Cofatores enzimáticos Uma série de cofatores enzimáticos que servem para uma ampla gama de funções químicas inclui a adenosina como parte de suas estruturas. Eles não são estruturalmente relacionados, exceto pela presença de adenosina. Ou seja, o nucleosídeo não tem atividade direta sob o substrato mas, caso retirarmos ele, a atividade enzimática cai drasticamente. Evolutivamente a adenosina foi mantida para essa função apenas por uma economia. Ou seja, parece ser vantajoso termos um composto para multiplas funções. Essa economia também se aplica a estruturas das proteínas. O domínio denominado cavidade de ligação de nucleotídeo o qual tem como função se ligar a adenosina, é o mesmo e pode ser utilizado em diferentes enzimas. 3) Reguladores Células respondem a seu ambiente por receberem avisos dos hormônios ou outros sinais químicos externos. A interação desses sinais químicos extracelulares – também conhecidos como primeiros mensageiros – com receptores na superfície da célula muitas vezes leva à produção de segundos mensageiros dentro da célula, os quais, por sua vez, conduzem a mudanças adaptativas no interior da célula. Muitas vezes esses segundos mensageiros nada mais são do que um nucleotídeo. Um dos mais comuns é a adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico ou cAMP. Outro nucleotídeo regulador, o ppGpp é produzido em bactérias como resposta a uma redução de velocidade da síntese proteica durante a falta de aminoácidos. O metabolismo do DNA O DNA, assim como os outros elementos da célula, também está sujeito a processos metabólicos. Dentre esses processos podemos incluir a replicação, o reparo e a recombinação. Replicação do DNA Antes mesmo das descobertas de Watson e Crick, já sabia-se que algo dentro das células era capaz de se dividir e criar cópias fiéis de si mesmo, perpetuando a informação. Com as descobertas de Watson e Crick, os quais estipularam que cada fita de DNA é um complemento da outra além do fato de que elas podem desnaturar e renaturar, esse mecanismo inteligente e elegante de perpetuação ou replicação pode ser deduzido com mais clareza. Ademais, ficou provado tambem que as propriedades fundamentais do processo de replicação do DNA e os mecanismos utilizados pelas enzimas que o catalisam são, em essência, idênticos em todas as espécies. O ciclo celular é composto por quatro fases: G1, S e G2 configurando o período da intérfase e pela mitose, que nada mais é do que o momento da divisão celular. G1 e G2 estão relacionados ao crescimento da célula e, por conseguinte, sua preparação para a divisão mas devemos ter foco na faseS, que é quando esse crescimento cessa por um momento e ocorre a duplicação das fitas de DNA. A replicação tem um caráter semi-conservativo, ou seja, cada molécula filha possui uma fita da molécula mãe além de um recém sintetizada. Isso foi provado através por Meselson-Stahl, que através de experimentos com isótopos 14N e 15N. Primeiramente as células foram cultivadas por muitas gerações em meio contendo apenas nitrogênio pesado (15N) de modo que todo o nitrogênio do DNA fosse esse. Quando centrifugado em um gradiente de CsCl uma banda única surgia próxima ao fundo do tubo. Após obterem esses dados, eles transferiram essas células para um meio de cultura rico em nitrogênio leve (14N), deixaram as células replicarem por uma geração e levaram a centrifugação. O resultado foi uma banda mediana, distante da primeira obtida. Por fim, eles deixaram essas células por mais um tempo nesse meio com nitrogênio leve e, ao centrifugar o resultado foi a obtenção de mais uma banda, dessa vez mais próxima do topo do tubo, bem mais leve. A partir desses resultados eles conseguiram provar o caráter semi-conservativo da replicação, ou seja, as primeiras moléculas, apenas com 15N ao serem inseridas em um meio apenas com 14N geram moléculas filhas com uma fita com 15N, a qual serviu como molde e outra com 14N, a qual foi sintetizada posteriormente. Com o segundo ciclo, agora tivemos essas fitas recém-sintetizadas com 14N em sua composição funcionando como molde e gerando moléculas apenas compostas por 14N. A replicação começa em uma origem e em geral segue bidirecionalmente. O desenovelamento do DNA, ao contrário do que se pensou primariamente, não ocorre de uma única vez. Durante a duplicação do DNA, temos a abertura das fitas e formação das forquilhas de replicação, onde o DNA está sendo desenrolado e as fitas separadas rapidamente replicadas. A sintese desse DNA ocorre sempre no sentindo 5’ -> 3’, o que levou ao questionamento de muitos cientistas: como ambas as fitas, de forma continua, vão ter essa síntese em direções contrárias com apenas uma enzima? Em 1960, Okazaki descobriu que uma das novas fitas de DNA é sintetizada em pequenos pedaços, os quais, nós chamamos atualmente de fragmentos de okazaki. A partir disso concluiu-se que uma fita é sintetizada continuamente e a outra, descontinuamente. A fita contínua, também chamada de fita lider, é aquela em que a 5’->3’ segue na mesma direção do movimento da forquilha de replicação. A fita descontínua, ou fita retardada, é aquela em que a síntese 5’->3’ prossegue na direção oposta da direção do movimeno da forquilha. Antes de abordamos sobre os componentes que promovem a síntese do DNA, é importante termos em mente que existem enzimas responsáveis também por sua degradação. Essas enzimas são conhecidas como nucleases ou DNases (ou RNases, no caso do RNA). Essas enzimas se dividem em duas grandes classes: as exonucleases e as endonucleases. As exonucleases tem capacidade de degradar tanto 5’ -> 3’ quanto no sentido 3’ -> 5’ mas sempre removendo os nucleotídeos das extremidades. Já as endonucleases agem em sítios específicos do DNA ou de uma molécula de ácido nucleico. Algumas endonucleases clivam apenas sequências específicas de DNA, sendo desse grupo, as endonucleases de restrição, as quais apresentam um potencial biotecnológico. A síntese de DNA ocorre por ação de enzimas específicas, denominadas DNA- Polimerases. Primeira polimerase a ser descoberta foi a DNA polimerase I, que é uma enzima formada a partir de um único polipeptídeo. A partir de estudos com essa enzima, o porcesso de síntese de DNA pode ser caracterizado. A reação fundamental é a transferência do grupo fosforil. O nucleófilo é o grupo 3’- hidroxila do nucleotídeo na extremidade 3’ da fita em crescimento. O ataque nucleofílico ocorre no fósforo a do deoxinucleosídeo-5’-trifosfato que chega. O pirofosfato inorgâncio é liberado na reação. (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + Pirofosfato (Ppi) DNA DNA alongado A catálise por praticamente todas as DNA-polimerases envolve principalmente dois íons de Mg2+ no sítio ativo. Um desses auxilia a retirar o próton do grupo 3’-hidroxila, tornando-o um nucleófilo mais eficaz. O outro se liga ao dNTP de entrada e facilita sua saída do pirofosfato. Além desse íon, estudos recentes comprovaram que as polimerases tem duas necessidades básicas: precisam de um molde e de um primer. A reação de polimerização é guiado por uma fita-molde de DNA, de acordo com as regras de pareamento de base previstas por Watson e Crick: onde uma guanina está presente em um molde, um desoxinucleotídeo citosina é adicionado à nova fita, e assim sucessivamente. Quanto ao primer, ou iniciador, nada mais é do que um segmento de fita, complementar ao molde, com um grupo 3’-hidroxila livre, ao qual um nucleotídeo pode ser adicionado; a extremidade 3’ livre do iniciador é denominada de terminal do iniciador. Em outras palavras, parte dessa nova fita já deve estar no lugar: todas as DNA-polimerases só podem adicionar nucleotídeos a uma fita preexistente. Muitos iniciadores são oligonucleotídeos de RNA em vez de DNA, e enzimas especializadas sintetizam iniciadores quando e onde são necessários. Um sítio ativo de DNA-polimerase tem duas partes. O nucleotídeo que chega é inicialmente posicionado no sítio de inserção. Uma vez que a ligação fosfodiester é formada, a polimerase desliza para frente no DNA e o novo par formado agora é posicionado no sítio de pós-inserção enquanto no sítio de inserção, outro nucleotídeo é adicionado. A replicação prossegue com extraordinário grau de fidelidade. Em E. coli, um erro acontece apenas a cada 109 a 1010 nucleotídeos adicionados. Em números relativos, um erro ocorre a cada 1.000 a 10.000 replicações. Durante o pareamento, a geometria dos pares de bases A e T ou de G e C, além das ligações de hidrogênios específicas entre elas auxiliam no correto encaixe das bases. O sítio ativo da DNA polimerase I acomoda apenas pares de bases com essa geometria. Um nucleotídeo incorreto pode ser capaz de fazer uma ligação de hidrogênio com uma base no molde, mas ele geralmente não se encaixará no sítio ativo. Bases incorretas podem ser rejeitadas antes que a ligação fosfodiéster se forme. Além disso, um mecanismo intrínseco a praticamente todas as DNA-polimerases é uma atividade de exonuclease separada 3’ 5’ que realiza uma dupla verificação em cada nucleotídeo após sua adição. Essa atividade de nuclease permite a remoção pela enzima de um nucleotídeo adicionado recentemente e é altamente específica para pares de bases não correspondentes. Se a polimerase adicionou o nucleotídeo errado, a translocação da enzima para a posição onde o próximo nucleotídeo seria adicionado é inibida. Essa pausa cinética fornece a oportunidde para uma correção. A atividade da exonuclease de 3’ 5’ remove o nucleotídeo malpareado, e a polimerase reinicia novamente. Essa atividade é conhecida como revisão. Existem ainda outros mecanismos de revisão, como é o caso do DNA metilado de E. coli. Dessa forma ela consegue identificar qual é o DNA é naturalmente dela e qual foi exógeno. Apenas durante e um pouco após a replicação que esse DNA se torna hemi-metilado. Isso se dá pois a fita recém-formada ainda não conseguiu ser metilada. Dessa forma temos três polimerases: DNA Polimerase I: envolvida com a limpeza e reparo do DNA durante a replicação; DNA Polimerase II: envolvida principalmente com o reparo; DNA Polimerase III: envolvida com a replicação de fato;A polimerase III é a principal envolvida no processo de replicação. É ela que promove de fato a confecção dessas novas fitas de DNA. É uma enzima grande, composta por 13 subunidades, sendo as subunidades a, e e o formam a porção polimerizadora da enzima. A atividade de polimerização fica por conta da subunidade a e a de limpeza, com a subunidade e. Estágios da replicação A síntese de uma molécula de DNA pode ser dividida em três estágios: iniciação, alongamento e terminação, diferenciando-se tanto pelas reações que ocorrem como pelas enzimas necessárias. Iniciação A origem de replicação de E. coli, OriC, consiste em 245 pb e contém elementos sequenciais de DNA que são altamente conservados entre origens de replicação bacteriana. Dois tipos de sequências apresentam especial interesse: cinco repetições de uma sequência de pb (sítios R) que funcionam como sítios de ligação para a proteína iniciadora chave DnaA, e uma região rica em pares de base A=T chamada de elemento de desenrolamento de DNA (DUE). Pelo menos 10 enzimas ou proteínas diferentes participam da fase de iniciação da replicação. Elas abrem a hélice do DNA na origem e estabelecem um complexo de pré- iniciação para reações subsequentes. O componente crucial no processo de iniciação é a proteína DnaA, um membro da família de proteínas AAA + ATPase. Enquanto a proteína DnaA promove a abertura das fitas por desnaturação. A DnaB é carreada desnaturada pela DnaC e posteriormente deixada no DNA. Como uma helicase replicativa, a DnaB migra ao longo da fita simples de DNA na direção 5’ 3’, desenrolando o DNA ao longo do caminho. As helicases DnaB carregadas nas duas fitas de DNA viajam em direções opostas, criando duas forquilhas de replicação potenciais. Todas as outras enzimas na forquilha de replicação são ligadas direta ou indiretamente à DnaB. À medida que a replicação começa e as fitas de DNA são separadas na forquilha, muitas moléculas de proteínas de ligação de DNA de fita simples (SSB) se ligam e estabilizam as fitas separadas, e a DNA-girase (DNA-topoisomerase II) alivia o estresse topológico induzido à frente da forquilha pela reação de desenrolamento. A iniciação é a única fase da replicação do DNA que é conhecida por ser regulada, e ela é regulada de modo que a replicação só ocorra apenas uma vez em cada ciclo celular. O mecanismo de regulação ainda não é completamente compreendido, mas estudos genéticos e bioquímicos forneceram ideias sobre vários mecanismos regulatórios distintos. Alongamento A fase de alongamento da replicação inclui duas operações distintas, porém relacionadas: a síntese da fita líder e a síntese da fita retardada. Várias enzimas na forquilha de replicação são importantes para a síntese de ambas as fitas. O DNA parental é inicialmente desenrolado pelas DNA-helicases, e o resultante estresse topológico é aliviado pelas topoisomerases. Cada fita separada é então estabilizada pela SSB (single- strand binding protein). A partir desse ponto a síntese das fitas líder e retardada é completamente distinta Ambas as fitas são sintetizadas ao mesmo tempo por um único dímero assimétrico de DNA-polimerase III, mostrando o porquê a sintese dos fragmentos de okasaki da fita retarda é tão complexo. Esse mecanismo só é possivel porque a polimerase forma uma alça, de forma que, após a inserção do primer, ela “estica” a fita molde da fita retardada formando essa alça. A medida que a replicação ocorre, essa alça vai aumentando até que a polimerase chegue no fragmento de okasaki sintetizado anteriormente. Enquanto isso a helicase continua a abrir o DNA e a primase, a confeccionar os primers, frequentemente, para essa fita. Os fragmentos de okasaki são retirados posteriormente pela DNA polimerase I, a qual tem função exonucleolítica 5’ 3’, e que depois sintetiza os fragmentos de DNA. As ligações fosfodiester são formadas posteriormente pela DNA ligase. Terminação Nos procariotos, como o DNA é circular, existem sequências de terminação, as TER, locais onde deverá ocorrer a parada das forquilhas. Dessa forma, uma proteina TUS se liga na sequência TER formando o complexo TER/TUS que, quando uma forquilha chega nesse momento, é instantaneamente paralisada e espera a do outro lado chegar para fechar o círculo. A replicação em eucariotos Os mecanismos de replicação na sua essencia são bem conservados em todos os seres mas, em relação aos eucariotos, ele ocorre de forma um pouco mais complexa e diferenciada. Nos eucariotos, ao contrário dos procariotos, são encontradas multiplas origens de replicação, o que faz sentido dado ao tamanho dos cromossomos humanos por exemplo. Levaria mais de 500 horas para confeccionar uma nova fita caso só existisse uma origem de replicação. Além disso, assim como as bactérias, os eucariontes têm vários tipos de DNA- polimerases. Algumas foram associadas a funções especificas, como a replicação do DNA mitocondrial. Temos então a DNA-polimerase a, a qual possui atividade muito provavelmente de produção de iniciadores dos fragmentos de okasaki, tanto para o DNA quanto para o RNA. A DNA-polimerase d, que estende os iniciadores produzidos pela a e essa possui atividade comparável a DNA polimerase III dos eucariotos. Temos ainda a DNA-polimerase e que substitui a d em algumas situações, como no reparo do DNA. Sequenciamento de DNA Frederick Sanger, ao final dos anos 1970, desenvolveu uma metodologia a qual possibilitou a determinação de sequências grandes de DNA contando com o melhor conhecimento da química dos nucleotídeos e do metabolismo do DNA e em métodos eletroforéticos para separação das cadeias de DNA diferindo em tamanho por apenas um nucleotídeo. Essa eletroforese é bastante semelhante às de proteína, sendo utilizado gel de poliacrilamida ou o gel de agarose como matrizes. O processo de sequenciamente consistia na criação de um ambiente favorável para replicação e, adicionando todos os fatores e enzimas necessários. Entretanto, além dos usuais dNTPs, eram também utilizados ddNTPs, que são nucleotídeos os quais não contam com uma hidroxila no carbono 3’ e, portanto, impossibilita a ação da polimerase. A partir disso, em quatro meios distintos, um para cada base, era adicionada o molde e um iniciador marcado radioativamente. Posteriormente, era adicionado em cada um dos quatro tubos, um único tipo de dNTP e seu ddNTP análogo. No caso do sequenciamento do molde CTAGGTACCATCGA, adicionando um iniciador anterior a ele, a sequencia final esperada seria GATCCATGGTAGCT. Se em um desses tubos tivesse dATP e ddATP, essa confecção da fita, caso o ddATP fosse incorporado, poderia ser GA, GATCCA ou GATCCATGGTA. Essas fitas tem tamanhos diferentes dado o seu comprimento, e isso era discriminado no gel de eletroforese. Com esse mesmo procedimento ocorrendo em quatro tubos distintos, teriamos todas as possibilidades, sendo cada uma parando em um nucleótideo diferente e, cada uma diferindo ainda pelo peso molecular. Ao se fazer uma eletroforese e uma autorradiografia da mesma, era possível visualizar diferentes bandas, cada uma proveniente de um nucleotídeo diferente da sequência, que, quando compilados, era possível determinar a sequência a qual era complementar ao molde e que desejamos descobrir. Hoje em dia esse sequenciamento já não é mais realizado dessa forma. São utilizados leituras a laser para determinação das sequências. O principio é o mesmo de Sanger, só que dessa vez os ddNTPs são marcados com uma molécula fluorescente e ao invés de serem adicionados em quatro tubos, são adicionado em um único capilar e submetido a eletroforese. Com a migração doDNA e passagem pelo laser, o detector verifica a coloração do marcador e acusa o nucleotídeo que o contém. Dessa forma, ao final, é possível determinar qual é a sequência de DNA. Replicação de RNA O RNA é a única macromolécula conhecida que tem papel tanto no armazenamento da informação quanto na catálise (ribozimas). Todas as moléculas de RNA, exceto os genomas de RNA de certos vírus são derivadas de informação permanentemente armazenada no DNA. Durante a transcrição, um sistema de enzimas converte a informação genética de um segmento de fita dupla de DNA de um filamento de RNA com uma sequência de bases complementar a uma das fitas de DNA. Três tipos principais de RNAs são produzidos: Os RNAs mensageiros (mRNA) codificam a sequência de aminoácidos de um ou mais polipeptídeos especificados por um gene ou conjunto de genes. Os RNAs transportadores (tRNA) leem a informação codificada no mRNA e transferem o aminoácido adequado para uma cadeia polipeptídica em crescimento durante a síntese de proteínas. Os RNAs ribossomais (rRNA) são constituintes dos ribossomos, as máquinas celulares intrincadas que sintetizam proteínas. Muitos RNAs adicionais especializados têm funções regulatórias ou catalíticas ou são precursores das três classes principais de RNA. Esses RNAs de função especial não são mais considerados secundário. Nos vertebrados, esses outros RNAs especiais constituem a maioria das moléculas sintetizadas, excedendo as três classes clássicas. Durante a replicação, o cromossomo inteiro é copiado mas quando falamos de processos transcrionais, apenas algumas região participam do processo. Essas regiões configuram um gene – sequência do DNA que é responsável por codificar uma sequência primária de algum produto gênico – ou grupo de genes, que podem ser transcritos frequentemente ou então, em situações específicas. Algumas porções do genoma nunca são transcritas. A célula restringe a expressão da informação genética à formação dos produtos gênicos necessários em qualquer momento particular. O que será transcrito ou não é delimitado por sequências regulatórias específicas que marcam o início e o final dos segmentos de DNA a serem transcritos e designam qual fita no duplex de DNA será usada como molde. A soma de todas as moléculas de RNA produzidas em uma célula sob um determinado conjunto de condições é chamado de transcriptoma celular. A sintese dos RNAs se assemelha muito ao processo de replicação, tanto no mecanismo químico fundamental, na sua polaridade (direção da síntese) e no seu uso de um molde. E, como a replicação, a transcrição tem fases de iniciação, alongamento e terminação. Entrentanto, elas diferem por no caso da transcrição não necessitarmos mais de um primer e por envolver segmentos específicos no DNA e não ele por inteiro. O RNA transcrito geralmente assume forma helicoidal e pode formar ainda grampos e bolhas. A RNA-polimerase A RNA-polimerase dependente de DNA precisa, além do molde DNA, de todos os quatro ribonucleosídeos 5’trifosfatos (ATP, GTP, UTP e CTP) como precursores das unidades de nucleotídeos de RNA, bem como de Mg2+. A proteína também se liga a um Zn2+. O mecanismo de síntese de RNA se assemelha muito aos usados pelas DNA-polimerases. A RNA-polimerase alonga uma fita de RNA ao adicionar unidades de ribonucleotídeos à extremidade hidroxila 3’, construindo o RNA na direção 5’ 3’. Assim como na replicação, o grupo hidroxila 3’ atua como nucleófilo, atacando o a fosfato do ribonucleosídeo trifosfato que chega e liberando o pirofosfato. É importante salientar ainda que a geometria, assim como na DNA-polimerase I, também ajuda a determinar se o pareamento está correto. (NMP)n + NTP (NMP)n+1 + Pirofosfato (PPi) RNA RNA alongado A RNA-polimerase precisa de DNA para sua atividade e é mais ativa quando ligada a um DNA de fita dupla. A fita a qual serve de molde está em direção 3’ 5’ e o RNA sintetizado tem sequência identica a fita codante, a qual não serve de molde mas carrega a informação de fato. A RNA-polimerase dependente de DNA da E.coli é uma enzima complexa, grande, com cinco subunidade centrais e uma sexta subunidade, de um grupo denominado σ, com variantes designadas pelo peso molecular. Essa subunidade está relacionada ao direcionamento da enzima ao sítio de ligação do DNA, sendo liberada posteriormente. A holoenzima pode então variar essa região σ. As RNA-polimerases não apresentam um sítio ativo distinto de exonuclease de revisão 3’5’ e a taxa de erro acaba sendo muito maior. Entretanto, como são feitas muitas cópias em forma de RNA de um mesmo gene e por fim degradadas e substituidas, esse erro não é perpetuado e portanto não traz grandes consequências. Ainda assim, sabe-se que as RNA- polimerases pausam sua atividade quando uma base errada e podem retirar um nucleotídeo errado na extremidade 3’ fazendo o inverso da reação de polimerização. Entretanto esse mecanismo ainda é obscuro. A iniciação da síntese de RNA em pontos específicos de DNA, denominadas regiões promotoras ou promotores que dirigem a transcrição de segmentos adjacentes de DNA (genes). As sequências em que as RNA-polimerases se ligam podem ser muito variáveis, e muitas pesquisas tiveram como foco a identificação das sequências particulares que são críticas para a função do promotor. A ligação da RNA polimerase de E. coli se estende desde cerca de 70 pb (região -70) antes do sítio de início de transcrição até cerca de 30 pb (região +30). Há ainda, regiões especifícas imporantes para a interação do fator σ, que geralmente se concentram em torno das posiões -10 e -35. Após a interação, o DNA começa se abrir por mudanças conformacionais formando um complexo aberto com a enzima. Com a abertura, a transcrição é iniciada no interior do complexo, levando a uma mudança conformacional que converte o complexo na forma de alongamento, seguida pelo movimento do complexo de transcrição para longe do promotor. A medida que essa enzima anda sobre o DNA, o fator σ se dissocia e a proteína NusA se liga à RNA-polimerase em alongamento. Quando a replicação acaba, essa proteína se dissocia e a enzima pode se ligar a outra subunidade σ e realizar novamente o processo. A terminação nos procariotos pode ocorrer por influência de duas classes de sinais: uma classe se baseia em um fator proteico denominado rho (p) e a outra é independente de rho. A maioria dos terminadores independentes de rho tem duas características distintivas. A primeira é uma região que produz um transcrito de RNA com sequências autocomplementares, permitindo a formação de uma estrutura em grampo com 15 a 20 nucleotídeos no centro antes da extremidade projetada da fita de RNA. A segunda característica é um filamento altamente conservado de três resíduos A na fita molde que são transcritos como resíduos U próximos da extremidade 3’ do grampo. Quando uma polimerase chega a um sítio de terminação com essa estrutura, ela pausa. A formação da estrutura em grampo no RNA interrompe vários pares de bases A=U no segmento híbrido de RNA-DNA e pode interromper interações importantes entre o RNA e a RNA-polimerase, facilitando a dissociação. Os terminadores dependentes de rho não têm sequência de resíduos repetidos de A na fita- molde, mas em geral incluem uma sequência rica em CA chamada de elemento rut. A proteína rho se associa ao RNA em sítios de ligação específicos e migra na direção 5’ 3’ até alcançar o complexo de transcrição que é pausado no sítio de terminação. Aqui ela contribui para livberar o transcrito de RNA. A proteína rho tem uma atividadede helicase de RNA-DNA dependente de ATP que promove a translocação da proteína ao longo do RNA, sendo o ATP hidrolisado pela proteína rho durante o porcesso de terminação. O mecanismo detalhado pelo a proteína promove a liberação do transcrito de RNA não é conhecido. RNA-polimerases em eucariotos Nos eucariotos, encontramos três classes de RNA-polimerases: RNA polimerase I -> relacionada com a síntese de pré-rRNA RNA polimerase II -> relacionada com a síntese de mRNA e snRNA RNA polimerase III - > relacionada com a síntese de tRNA A RNA-polimerase II é central para a expressão gênica de eucariontes. Embora essa polimerase seja surpreendentemente mais complexa do que a sua contraparte bacteriana, a complexidade mascara uma impressionante conservação da estrutura, função e mecanismo. A Pol II isolada da levedura é uma enzima grande com 12 subunidades. A maior subunidade (RBP1) apresenta um alto grau de homologia com a subunidade b’ da RNA- polimerase bacteriana. Outra subunidade (RBP2) é estruturalmente semelhante à subunidade bacteriana b, e duas outras (RBP3 e RBP11) exibem algum grau de homologia estrutural em relação às duas subunidades a bacteriana. A RNA-polimerase II requer uma série de outras proteínas, denominadas de fatores de transcrição, a fim de formar o complexo de transcrição ativo. Os fatores de transcrição gerais necessários a cada promotor da Pol II são altamente conservados em todos os eucariotos. O processo de transcrição por essa enzima pode ser descrito em termo de várias fases – montagem, iniciação, alongamento e terminação -. O processo de transcrição Primeiramente, temos a criação de um complexo fechado que se forma quando uma proteína denominada TBP se liga a uma região rica em Timinas e Adeninas, denominada de TATA Box. O complexo TATA/TBP é estabilizado por duas subunidades da polimerase, as porção TFIIA e TFIIB. A subunidade TFIIF ajuda então a Pol II a se ligar aos seus promotores, tanto pela interação com TFIIB quanto reduzindo a ligação da molécula a sítios inespecíficos do DNA. A partir daí, outras duas subsunidades, denominandas TFIIE e TFIIH se ligam para criar um complexo fechado. A TFIIH apresenta uma atividade de helicase e promove o desenrolamento do DNA próximo ao sítio de ínicio do RNA em um processo ativo, criando assim, um complexo aberto. Além de uma atividade de helicase, a porção TFIIH promove a fosforilação na porção CTD (domínio carboxil-terminal) da polimerase (região da cauda), associadas a outras proteínas. Isso provoca uma mudança conformacional geral no complexo, iniciando a transcrição. A fosforilação do CTD também é importante durante a fase de alongamento subsequente, com o estado de fosforilação do CTD mudando à medida que a transcrição prossegue. Com essa mudança, temos alterações nas interações entre o complexo de transcrição com outras proteínas e enzimas, de modo que diferentes combinações de proteínas se liguem a esse complexo durante a iniciação e não em estágios superiores. Durante a síntese dos 60 a 70 nucleotídeos iniciais de RNA, priemiro a TFIIE e então a TFIIH são liberadas, e a Pol II entra na fase de alongamento da transcrição. A TFIIF permanece então ligada à Pol II durante o alongamento. Nesse momento temos proteínas denominadas fatores de alongamento estimulando a atividade da polimerase. Os fatores de alongamento, alguns ligados ao CTD fosforilado, impedem a pausa da transcrição e também coordenam as interações entre complexos de proteínas envolvidos no processamento pós-transcricional de mRNA. Quando o RNA já está completamente transcrito, o processo se encerra, a enzima é desfosforilada e reciclada para que possa reiniciar o processo. Processamento de RNA Muitas das moléculas de RNA em bactérias e praticamente todas as moléculas de RNA em eucariotos são processadas em algum grau após a síntese. Dificilmente uma molécula de RNA já é liberada pronta logo após a sua transcrição. Esse processamento, que é algo bastante interessante, ocorre não por ação de proteínas mas sim por ação de RNAs catalíticos, as ribozimas. Uma molécula de RNA que acaba de ser sintetizada e ainda não sofreu nenhum tipo de alteração é denominada transcrito primário. Os processamentos mais extensos ocorrem nos mRNAs eucariontes e nos tRNA tanto procarionte quanto eucarionte, mas os RNAs especiais e os ribossomais também são alvos de alterações. Em um mRNA primário podemos encontrar as sequências codificantes provenientes de um gene mas que não se apresentam de forma contínua nessa fita. Dentro de um mRNA, podemos ter três tipos básicos de processamento. Podemos ter regiões não codificantes, denominadas íntrons, as quais se concentram entre as regiões codificantes, sendo essas denominadas éxons. Em um processo denominado splicing de RNA, os íntrons são removidos do transcrito primário de forma que após esse processo, os éxons se posicionarão de maneira contínua que especifica um polipeptídeo funcional. Os mRNAs de eucariontes também são modificados em cada extrremidade. Um resíduo modificado, denominado 5’ cap ou quepe 5’ é adicionada à extremidade 5’. Já a extremidade 3’ é clivada e 80 a 250 resíduos de Adenina são adicionados para criar a denominada cauda poli(A). Esses três processos são promovidos por complexos proteícos diferentes mas que não atuam independentemente, sendo organizados em associação uns com outros e com o CTD fosforilado da Pol II. O quepe 5’ A maioria dos mRNAs de eucariontes tem um quepe 5’, um resíduo de 7-metilguanosina ligado ao resíduo terminal 5’ do mRNA por meio de uma rara ligação trifosfato 5’,5’-trifosfato. O quepe 5’ ajuda a proteger o mRNA das ribonucleases. Ele também se liga a um complexo de proteínas ligadoras de quepe específico e participa da ligação do mRNA ao ribossomo para iniciar a tradução. O quepe 5’ é formado pela condensação de uma molécula de GTP com o trifosfato na extremidade 5’ do transcrito. Em seguida, a guanina é metilada no N-7, e grupos metil adicionais são frequentemente adicionados às hidroxilas 2’ do primeiro e segundo nucleotídeos adjacentes ao quepe. Os grupos metil são derivdos da S- adenosilmetionina. Todas essas reações ocorre logo no ínicio da transcrição, após os primeiros 20 a 30 nucleotídeos desse mRNA serem adicionados. A cauda poli(A) Na sua extremidade 3’, a maioria dos mRNAs eucariótiocos tem um filamento de 80 a 250 resíduos A, que perfazem a cauda poli (A). Essa cauda serve como um sítio de ligação para uma ou mais proteínas específicas. A função da cauda poli(A) e de suas proteínas específicas, assim como o quepe 5’, é de proteção do transcritos contra a ação de exonucleases. Muitos mRNAs bacterianos também adquirem caudas poli(A), mas, ao contrário dos eucariotos, essa cauda estimula a destruição do transcrito ao invés de protege-lo. A cauda de poli (A) é adicionada em um processo que envolve diversas etapas. O transcrito se estende além do local em que a cauda de poli(A) deve ser adicionada, é clivado no local de adição da poli (A) por um componente de endonuclease de um grande complexo enzimático, novamente associado ao CTD da Pol II. O local de mRNA em que a clivagem ocorre é marcado por dois elementos de sequência: a sequência altamente conservada (5’) AAUAAA (3’), de 10 a 30 nucleotídeos no lado 5’ (a montante) do sítio de clivagem, e uma sequência não tão bem definida rica em resíduos de G e U, de 20 a 40 nucleotídeos abaixo do local da clivagem. A clivagem gera o grupo livre 3’-hidroxila que define a extremidade do mRNA, à qual os resíduos A são imediatamente adicionados pela polimerasepoliadenilada, que catalisa a reação: RNA + nATP RNA – (AMP)n + nPPi mRNA mRNA + Cauda PoliA em que n = 80 a 250. Essa enzima não precisa de um molde mas exige o mRNA clivado como um iniciador. Splicing Como dito anteriormente, tanto as regiões intronicas quanto a exonicas são transcritas para o mRNA primário. Entretanto, apenas 1977, Phillip Sharp e Richard Roberts desmentiram a informação de que todos os genes são contínuos. Eles descobriram que essas regiões não codificadoras se concentravam entre as regiões codificantes interrompendo os genes. Hoje sabe-se que a maioria dos genes de vertebrados contém essas regiões, excedendo as histonas. Há quatro classes de íntrons. As duas primeiras são os íntrons do grupo I e do grupo II, os quais diferem em detalhes dos seus mecanismos de splicing, mas compartilha uma característica: ambos sobre o denominada autosplicing, ou seja, não há nenhuma enzima proteica envolvida no processo. Os mecanismos de splicing em ambos os grupos envolvem duas etapas de reações de transesterificação, em que um grupo ribose 2’ ou 3’-hidroxila faz um ataque nucleofílico em um fósforo e uma nova ligação fosfodiéster é formada às custas da antiga, mantendo o equilíbrio de energia. Essas reações são muito semelhantes às reações de quebra e religação do DNA promovidas pelas topoisomerases e recombinases sítio-específicas. A reação de splicing do grupo I precisa de um nuclesídeo guanina ou de um cofator nucleotídeo, sendo esse segundo não utilizado como fonte de energia. Ao invés disso, o grupo 3’-hidroxila da guanosina é usado como um nucleófilo na primeira etapa da via do splicing. O grupo 3’-hidroxila da guanosina forma uma ligação 3’,5’-fosfodiéster normal com a extremidade 5’ do íntron. A 3’-hidroxila do éxon que é deslocada nessa etapa age então como um nucleófilo em uma reação semelhante na extremidade 3’ do íntron. O resultado é a remoção precisa do íntron e ligação dos éxons. Nos íntrons do grupo II, o padrão de reação é semelhante exceto pelo nucleófilo na primeira etapa, que nesse caso é o grupo 2’-hidroxila de um resíduo A dentro do íntron. Uma estrutura em laço ramificado é formada como um intermediário. A maioria dos íntrons não sobre autosplicing e esses tipos não são designados com um número de grupo. A terceira e maior classe de íntrons inclui aqueles encontrados nos transcritos primários de mRNA nuclear. São chamados de íntrons do spliceossomo, pois sua remoção é catalisada por um grande complexo proteico denominada spliceossomo e ocorre no seu interior. Dentro do spliceossomo os íntrons sofrem splicing pelo mesmo mecanismo formador de laço que os íntrons do grupo II. O spliceossomo é composto pelos snRNP (ribonucleoproteínas nucleares). Cada snRNP contém uma classe de RNA eucarionte, de 100 a 200 nucleotídeos de comprimento, conhecida como RNAs nucleares pequenos (snRNA). Cinco snRNA (U1, U2, U4, U5 e U6) envolvidos nas reações de splicing são geralmente encontrados em abundâncias nos núcleos de eucariontes. Os RNA e as proteínas no snRNP são altamente conservados em eucarionte. É necessário ressaltar ainda que o splicing desse tipo não envolve gasto de ATP mas a montagem do spliceossomo envolve. Alguns dos componentes do aparato de splicing estão presos ao CTD da RNA- Polimerase II, indicando que o splicing, como outras reações de processamento de RNA, é fortemente coordenado com a transcrição. Após o splicing, o íntron permanece no núcleo e é depois degradado. A quarta classe de íntrons, encontrada em certos tRNA, se distingue dos íntrons dos grupos I e II pelo fato da reação de splicing precisar de ATP e de uma endonuclease. A endonuclease de splicing cliva as ligações fosfodiéster em ambas as extremidades do íntron, e os dois éxons são ligados por um mecanismo semlhante à reação da DNA-ligase. Processamento diferencial de mRNA Alguns transcritos de mRNA de eucariontes produzem apenas um mRNA maduro e um polipeptídeo correspondente, mas outros podem ser processados de mais de uma maneira para produzir diferentes mRNAs e, portanto, diferentes polipeptídeos. O transcrito primário contém sinais moleculares para todas as vias de processamento alternativo e a via favorecida em uma célula é determinada por fatores de processamento, proteínas ligadoras de RNA que promovem uma via particular. Transcritos complexos podem ter ou mais de um sítio de clivagem e poliadenilação ou padrões de splicing alternativo, ou ambos. Se há dois ou mais sítios de clivagem e poliadenilação, o uso daquele mais próximo da extremidade 5’ irá remover mais da sequência do transcrito primário. Esse mecanismo, chamado de escolha do sítio de poli(A), produz diversidades nos domínios variáveis de algumas cadeias polinucleotídicas, como as da imunoglobulina, por exemplo. Se a cauda poli(A) é adicionada em posição X, o mRNA carregará aquela informação. Agora, se ela for adicionada numa posição -9X, esse mRNA terá menos informação. Quanto ao splicing alternativo, podemos ter retirada de certos regiões intronicas em um processamento, e em outras, não. Processamento de RNA ribossomal e tRNA O processamento não é exclusivo dos mRNA. Os RNAs ribossomais de bactérias, arqueobactérias e células eucariontes são feitos de precursores maiores chamados de RNAs pré-ribossomais, ou pré-rRNAs. As modificações ocorrem no nucléolo e é guiada pelos snoRNA ou RNA nucleolares pequenos. As modificações de nucleosídeos mais comuns nos rRNAs de eucariontes são a conversão dessas moleculas em nucleosídeos de outro tipo ou, ainda, a sua metilação. Os RNAs transportadores são do mesmo modo derivados de precursores maiores e ainda pode contar com nucleotídeos modificados. A maioria das células tem de 40 a 50 tRNAs diferentes, e as células eucariontes têm multiplas cópias de vários genes de tRNA. Há então remoção de nucleotídeos das extremidades 5’ e 3’ por ação de enzimas específicas promovendo o processamento desse RNA a partir desses precursores maiores. A endonuclease RNase P, encontrada em todos os organismos, remove o RNA na extremidade 5’ dos tRNAs e as extremidades 3’ são retiradas pelas Rnase D. Além disso, o trinucleotídeo CCA(3’) 3’- terminal, ao qual um aminoácido é ligado também é adicionado a tRNA durante o processamento, não existindo no momento da transcrição. Por fim, esse tRNA pode sofrer ainda modificações em algumas bases, tais como metilação, desaminação ou redução. Processamento de RNAs de função especial Os snRNAs e snoRNAs não apenas facilitam as reações de processamento do RNA mas são eles mesmos sintetizados como precursores maiores, e então processados. Muitos snoRNAs são codificados no interior dos íntrons de outros genes. À medida que os íntrons sofrem splicing a partir do pré-mRNA, as proteínas snoRNPs se ligam às sequências de snoRNA e as ribonucleases removem o RNA extra nas extremidades 5’ e 3’. Os snRNA destinados aos spliceossomos são sitentizados como pré-snRNA pela RNA-Pol II, e as ribonucleases removem o RNA extra em cada extremidade. Nucleosídeos particulares nos snRNAs também são sujeitos a 11 tipos de modificação. A função de muitos mRNAs de eucariontes é regulada por microRNAs (miRNAs). Os miRNAs são em si derivados de precursores maiores por meio de uma série de reações de processamento. Alguns deles são codificados nos íntrons de outros genes e coexpressados com esses genes hospedeiros. As ribozimas As ribozimas nada mais mais são do que um grupo de moléculas de RNA com atividade catalítica, ou seja, enzimática. As ribozimas melhor caracterizadassão os íntrons do grupo I, os quais, como vimos, sofrem autosplicing, a Rnase P e a ribozima cabeça-de-martelo. A maior parte das atividades dessas riboximas se baseia em duas reações fundamentais: transesterificação e hidrólise da ligação fosfodiéster (clivagem). O substrato para as ribozimas é frequentemente uma molécula de RNA, e pode até mesmo ser parte da própria ribozima. Quando o seu substrato é o RNA, o catalisador de RNA pode fazer uso de interações de pares de bases para alinhar o substrato para reação. Degradação de mRNAs A concentração de qualquer molécula depende de dois fatores: sua taxa de síntese e sua taxa de degradação. Quando a síntese e degradação de um mRNA estão equilibradas, a concentração do mRNA permanece em um estado estácionário. Uma mudança nessas taxas resulta ou no acúmulo ou no esgotamento desse material. Vias de degradação garantem que os mRNAs não se acumulem na célula, dirigindo a síntese de proteínas desnecessárias. O RNA mensageiro é degradado pelas ribonucleases presentes em todas as células. Na E. coli, o processo começa com um ou vários cortes por uma endorribonuclease, seguido por degradação 3’ 5’ por exorribonucleases. Em eucariontes inferiores a via de degradação principal envolve o encurtamente da cauda poli(A), em seguida, a remoção do quepe da extremidade 5’ e a degradação do mRNA na direção 5’ 3’. Uma via degradativa 3’ 5’ também existe e pode ser a via principal em eucariontes superiores. Todos os euariontes têm um complexo de até 10 exorribonucleases conservadas 3’ 5’, chamados de exossomos, que está envolvido no processamento da extremidade 3’ de rRNA, tRNA e alguns RNAs de função especial, bem como a degradação de mRNAs. Polinucleotídeo-fosforilase Essa enzima, descoberta em 1955 por Marianne Grunberg-Manago e Severo Ochoa, é capaz de catalisar uma reação de síntese de polímeros semelhantes ao RNA, a partir de ribonucleosídeos 5’-difosfatos, adicionando-os ou removendo da extremidade 3’-hidroxila do polímero, sem a necessidade de um molde. Essa enzima promove a produção de polímeros com sequências aleatórias e acredita-se que ela tenha derivado de uma RNA-Polimerase e a função de síntese tenha se mantido, mas aparentemente por retenção, pois a sua função básica é na realidade a degradação do RNA. Regulação da expressão gênica A concentração celular de uma proteína é determinada pelo equilíbrio delicado de ao menos sete processos, cada um tendo vários pontos de regulação em potencial: 1. Síntese do transcrito de RNA primário (transcrição); 2. Modificação pós-transcricional do mRNA; 3. Degradação do RNA mensageiro; 4. Síntese proteica (tradução); 5. Modificação pós-traducional de proteínas; 6. Direcionamento e transporte de proteínas; 7. Degradação de proteínas; Genes para produtos necessários em todos os momentos, como os das enzimas das vias metabólicas centrais, são expressos em nível mais ou menos constante em praticamente todas as células de uma espécie ou organismo. Esses genes, são chamados muitas vezes de genes constitutivos ou housekeeping genes e sua expressao é denominada expressão do gene constitutivo. Para outros produtos gênicos, os níveis celulares aumentam e diminuem em resposta a sinais moleculares. Esse tipo de expressão é denominada expressão gênica regulada. Produtos gênicos que aumentam de concentração sob circunstâncias moleculares específicas são chamados de induzíveis. O processo de aumentar sua expressão é a indução. A expressão de muitos dos genes codificadores de enzimas de reparo de DNA, por exemplo, é induzida por um sistema de proteínas reguladoras que responde aos níveis de dano ao DNA. Ao contrário, produtos gênicos que diminuam em concetração em resposta a um sinal molecular são denominados repressiveis, e o processo é chamado de repressão. A iniciação da transcrião é regulada por proteínas que se ligam as regiões promotoras ou próximas à ela. Pelo menos três tipos de protéinas regulam a iniciação da transcrição pela RNA-polimerase: fatores de especificidade alteram a especificidade da RNA-polimerase para um determinado promotor ou conjuntos de promotores repressores impedem o acesso da RNA-polimerase ao promotor, e os ativadores estimulam a interação RNA-polimerase- promotor. Os repressores se ligam a sítios específicos no DNA. Em células bacterianas, tais sítios de ligação, chamados operadores, estão geralmente próximos de um promotor. A ligação da RNA-polimerase, ou seu movimento ao longo do DNA após sua ligação a ele, é bloqueada quando o repressor está presente. A regulação pela proteína repressora que bloqueia a transcrição é chamada de regulação negativa. A ligação do repressor ao DNA é regulada por um sinal molecular, geralmente uma molécula pequena ou uma proteína, que se liga ao repressor e provoca uma mudança conformacional. A interação entre repressor e molécula sinalizadora aumenta ou diminui a transcrição. Em alguns casos, a mudança conformacional resulta na dissociação de um repressor ligado ao DNA do operador. Os ativadores fornecem um contraponto molecular aos repressores: eles se ligam ao DNA e estimulam a atividade da RNA-polimerase em um promotor. Esse evento é conhecido como regulação positiva. Em procariotos, muitas vezes os sítios de ligação ativadores são adjacentes aos promotores ligados fracamente ou não ligados à RNA-polimerase isolado, de modo que ocorre pouca transcrição na ausência de um ativador. Nos eucariotos se ligam aos sítios de DNA, chamados potenciadores ou enhancers, que estão muito distantes do promotor. Esses ativadores afetam a taxa de transcrição em um promotor que pode estar localizado a milhares de pares de bases de distância. Moléculas sinalizadoras podem portanto diminuir ou aumentar a transcrição dependendo de como elas afetam o ativador. Em eucariotos, a distância entre os sítos de ligação de ativadores ou repressores e promotores é superada fazendo alças (looping) no DNA entre eles. O processo de looping é facilitado em alguns casos por proteínas denominadas reguladores arquitetônicos que se ligam a sítios de intervenção e facilitam o looping do DNA. É necessario ressaltar ainda que a maioria dos sistemas eucarióticos envolve ativadores de proteínas. Proteínas regulatórias interagindo com o DNA As proteínas regulatórias geralmente se ligam a sequências de DNA específicas. Para isso, essas proteínas contam com dois domínios distintos, sendo um para a sua fixação no DNA e outro para se ligar em outra proteína. Para se ligarem especificamente a sequências de DNA, as proteínas regulatórias devem reconhecer características da superfície do DNA. A maioria dos grupos químicos que diferem entre pares de bases, consiste em grupos doadores e aceptores de ligações de hidrogênio expostos no sulco maior do DNA, e a maior parte dos contatos proteínas-DNA que conferem especificidade consiste em ligações de hidrogênio. No interior de proteínas regulatórias, as cadeias laterais de aminoácidos com ligações de hidrogênio mais frequentes com as bases no DNA são aquelas de resíduos de Asn, Gln, Glu, Lys e Arg. Motivos ligadores de DNA Vários motivos de ligações podem ser encontrados no DNA, mas podemos destacar dois mais notáveis: a hélice-volta-hélice e o dedo de zinco. A hélice-volta-hélice é um motivo de ligação o qual é crucial para a interação de muitas proteínas regulatórias bacterianas com o DNA, e motivos semelhantes ocorrem em algumas proteínas regulatórias de eucariotos. O motivo hélice-volta-hélice compreende cerca de 20 aminoácidos em dois segmentos curtos a helicoidais, cada um com sete
Compartilhar