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2º Lista de exercícios: Aminoácidos, peptídeos e proteínas. 1. Usando os valores da Tabela, calcular o pI do ácido aspártico e da lisina. Tabela: Valores de pK de alguns grupos ionisáveis Grupo pK COOH (terminal) 3,3 COOH (Asp, Glu) 3,8 Imidazol (His) 6,3 NH2 (terminal) 8,0 NH2 (Lis) 10,0 OH (Tir) 10,1 Guanidino (Arg) 12,0 2. Uma amostra de 100 ml de glicina 0,1 M foi titulada com NaOH 2M. O pH da solução foi determinado após cada adição de NaOH e, os pontos importantes da titulação foram designados por I a VI, na figura. Para cada pergunta, justificar a resposta dada. a) em que ponto da curva predomina a espécie H3N + -CH2-COOH? b) em que ponto a carga real média da glicina é +1/2? c) que região da curva corresponde ao pI da glicina? d) em que região da curva predomina a espécie H3N + -CH2-COO -? e) em que ponto da curva 50% dos grupos COOH estarão dissociados? f) 50% dos grupos NH2 estarão dissociados em que região da curva? g) onde a carga real média da glicina é zero? h) onde a carga real média da glicina é -1/2? i) que ponto da curva representa o final da titulação? j) qual é o ponto cujo pH é igual ao pK do grupo NH2? k) qual é o ponto cujo pH é igual ao pK do grupo COOH? l) onde existe 50% de H3N + -CH2-COO - e 50% de H2N-CH2-COO - ? m) onde existe 50% de H 3 N + -CH2-COOH e 50% de H3N + - CH2-COO - ? o) em que ponto(s) a glicina pode atuar como um tampão? p) em que região da curva a glicina apresenta baixa capacidade tamponante? q) em que região da curva os grupos COOH estarão completamente titulados? r) em que ponto(s) os grupos NH2 estão completamente titulados? 3. Usando os valores da Tabela 2, determinar o pI do peptídeo Asp-Lis. O peptídeo Lis- Asp terá o mesmo pI? Justificar a resposta. 4. Usando os valores da Tabela 2, predizer qual será a carga dos seguintes tetrapeptídeos em pH 3; 6,5 e 10: a) Lis-Gli-Ala-Gli; b) Lis-Gli-Ala-Glu; c) His-Gli- Ala-Glu; d) Glu-Gli-Ala-Glu; e) Gli-Gli-Ala-Lis. 5. Cada um dos aminoácidos pode existir em duas formas: eletricamente neutra e carregada (positiva ou negativamente). Por outro lado, a carga elétrica de um grupo funcional é determinada pela relação entre o seu pK e o pH da solução e, quantitativamente, essa relação é dada pela equação de Handerson-Hasselbach. Sabendo-se que a histidina tem três grupos ionizáveis, escreva o equilíbrio relacionando todas as espécies e determine qual é a carga da molécula em pH 7,0. 6. As histonas, proteínas existentes no núcleo das células dos eucariotos, ligam-se fortemente ao DNA (que é rico em grupos fosfato). O pI das histonas é elevado e da ordem de 10,8. Qual é o tipo de aminoácido que deve predominar nesse tipo de proteína? De que maneira eles contribuem para a forte ligação da histona ao DNA? 7. A tabela mostra o aumento do número de resíduos de alanina no peptídeo provoca um aumento no valor do pK do grupo COOH desse peptídeo e uma diminuição do pK do grupo NH2. Qual é a explicação para esses fatos? Peptídeo pK1 pK2 Ala 2,34 9,69 Ala-Ala 3,12 8,30 Ala-Ala-Ala 3,39 8,03 Ala-Ala-Ala-Ala 3,42 7,94 8. O ácido poli-glutâmico é um polipeptídio sintético que em pH 4,0 apresenta uma estrutura em -hélice. Entretanto, em pH 7,0 a sua estrutura é do tipo randon-coil. Como se explica essa mudança de conformação em função do pH? 9. Usando os valores da Tabela 1, indicar qual será a direção seguida pelas seguintes proteínas em uma eletroforese: a) ovalbumina em pH 5,0; b) lactoglobulina em pH 5,0 e pH 7,0; c) quimotripsinogênio em pH 6,0 e pH 11,0. 10. Utilizando os dados da Tabela 1 justificar qual é o pH que deve ser empregado para separar as seguintes proteínas através de uma eletroforese: a) soralbumina e hemoglobina; b) mioglobina e quimotripsinogênio; c) ovalbumina, soralbumina e uréase. 11. Qual é a relação entre a solubilidade de uma proteína e o seu pI? Quando uma proteína está dissolvida em uma solução cujo pH é igual ao seu pI, a sua conformação é alterada? E a sua estrutura primária? 12. Em pH 3,3 uma determinada proteína encontra-se na forma do seu cloridrato. O que se pode deduzir em acerca do pI dessa proteína? 13. Se uma proteína encontra-se na forma de proteinato de sódio em pH 8,5, o que se pode deduzir acerca do seu pI? 14. O HCl pode atuar sobre uma proteína provocando uma hidrólise da molécula, uma precipitação reversível ou uma desnaturação. O que ocorre em cada um desses casos e quais as condições utilizadas para se obter tais efeitos? 15. Como a solubilidade de uma proteína é afetada pela desnaturação? A desnaturação é necessariamente um processo irreversível? 16. Considerando-se os diferentes pKs dos aminoácidos dados na Tabela 2, é possível afirmar que as proteínas podem atuar como sistemas tampão? 17. A soralbumina bovina apresenta 0,58% em peso de triptofano (PM= 204). Quando submetida a uma filtração em gel de Sephadex essa proteína apresenta um peso molecular de 70.000. Calcular quantos resíduos de triptofano existem na molécula de soralbumina. 18. A lisina (PM= 146) representa cerca de 10,5% do peso da ribonuclease. Calcular o peso molecular mínimo dessa proteína sabendo-se que em cada molécula existem 10 resíduos de lisina. 19. A tropomiosina (PM= 93.000), uma proteína encontrada nos músculos, sedimenta mais vagarosamente em um campo centrífugo que a hemoglobina (PM= 65.000). Os coeficientes de sedimentação dessas proteínas são 2,6 e 4,31 S, respectivamente. Sabendo-se que para proteínas de mesma forma, quanto maior o peso molecular maior a velocidade de sedimentação, que característica estrutural da tropomiosina seria responsável por esse baixo coeficiente de sedimentação? 20. A mobilidade eletroforética relativa de uma proteína, em gel de poliacrilamida-SDS diminui de 0,67 para 0,64 após a adição de ditiotreitol 1 mM. Qual é a explicação para tal fato? 21. Em uma eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, uma proteina de peso molecular 90.000 move-se mais lentamente que uma outra de peso molecular 40.000. Entretanto, em uma filtração em gel de Sephadex, a proteína de peso molecular 90.000 é a que primeiro emerge da coluna. Como se explica tal fato? 22. É correto falar-se em pK de uma proteína? Por que? 23. Uma proteína apresenta capacidade tamponante máxima em pH 5,0. O que se pode deduzir acerca da sua composição em aminoácidos? Se a capacidade tamponante máxima ocorresse em pH 8,0, o que se poderia concluir acerca da composição em aminoácidos dessa proteína? 24. Qual é o número mínimo de grupos ionizáveis que podem ser encontrados em uma molécula de proteína? 25. Quantos peptídeos diferentes podem ser formados com apenas três aminoácidos: a) usando qualquer um deles em qualquer posição; b) usando apenas uma vez cada um deles. 26. Calcular o comprimento da molécula de uma proteína que contém 780 aminoácidos se: a) ela estiver na forma de -hélice; b) se ela estiver totalmente estendida (configuração ); c) se ela apresentar 40% de -hélice e 60 % de configuração . 27. Uma E. coli apresenta 10 6 moléculas de proteínas (PM= 40.000). Sabendo-se que o peso molecular médio dos aminoácidos é 120, calcular o comprimento total das cadeias polipeptídicas considerando-se que todas elas estão na forma de -hélice. Se elas estivessem somente em configuração , qual seria o comprimento total? 28. Uma proteína de PM= 240.000 apresenta regiões em -hélice e regiões em configuração. Sabendo-se que o comprimento da molécula é 5,06.10 -5 cm e que o peso molecular de cada resíduo de aminoácido é 120, determinar a porcentagem da molécula que se encontra em -hélice. 29. Usando os valores de peso molecular dados na Tabela 1, predizer a ordem de eluição das seguintes proteínas em uma coluna de filtração emgel: citocromo c, triptofano sintetase, hemoglobina, ATP sulfurilase e xantina oxidase. 30. Utilizando-se uma coluna de gel de Sephadex, foi determinada a relação Ve/Vo para as seguintes proteinas: mioglobina= 2,8; hemoglobina= 2,1; fosforilase a= 1,4; catalase= 1,3; ferritina= 1,0. Utilizando os PM dessas proteinas (ver Tabela 1) calcular o PM da toxina da difteria sabendo-se que nesse caso, Ve/Vo = 2,0. 31. Determinar o número de cadeias polipeptídicas existentes na molécula da hemoglobina (PM = 64.000) sabendo-se que: o resíduo N-terminal é valina (PM= 117) e que para cada 100 g de hemoglobina existem 0,73 g de valina. 32. Para um aminoácido monoamino monocarboxílico, K1 e K2 designam as constantes de dissociação dos grupos COOH e NH2, respectivamente. Demonstrar que: 2 pKpK pI 21 33. O grupo -carboxila do ácido glutâmico tem um pK3= 4,3. Qual é a fração desses grupos que estará desprotonada em uma solução diluída de pH 5,0 ? Porque o pK desse grupo é sempre maior que o do grupo -COOH? 34. O grupo -amino da lisina tem um pK3= 10,5. Qual é a fração desses grupos que estará protonada em uma solução diluída de pH 9,5 ? Porque o pK desse grupo é sempre maior que o do grupo -NH2? 35. A carboximetilcelulose (CM-celulose), uma resina trocadora de cátions, é obtida pela carboximetilação (-CH2-COOH) da celulose. Se no seu laboratório você dispuser de uma coluna de CM-celulose (o pK do grupo COOH é 4,8) equilibrada em pH 7,0 e, se nessa coluna você aplicar uma amostra contendo uma mistura de citocromo c, lisozima e ovalbumina, qual(is) dessa(s) proteina(s) ficará (ão) retida(s) na coluna? Utilizar os dados da Tabela 1 e considerar que a interação entre as proteínas e a resina é apenas do tipo eletrostático. 36. A dietilaminoetil celulose (DEAE-celulose) é uma resina trocadora de ânions. Se você aplicar uma mistura de soralbumina bovina, urease e quimotripsinogênio a uma coluna de DEAE-celulose (o pK do grupo NH2 é 9,4) equilibrada em pH 7,0, o que acontecerá com cada uma dessas proteínas? Utilizar os dados da Tabela 1 e considerar que a interação entre as proteínas e a resina é apenas do tipo eletrostático. 37. A maioria dos animais é incapaz de digerir a lã devido ao fato dela ser uma proteína cuja molécula apresenta um grande número de pontes dissulfeto (S-S). Entretanto a traça, que apresenta grandes quantidades de H2S em seu trato digestivo, é capaz de digerir a lã. Como se explica esse fato? 38. Os anticorpos possuem sítios de ligação que são complementares a estruturas específicas dos antígenos. Considerando-se que tanto os antígenos como os anticorpos podem ser proteínas, como se explica a forte interação entre antígeno-anticorpo? 39. A toxina do Clostridium botulinum é uma das mais venenosas substâncias conhecidas e o seu consumo é fatal. Entretanto, se o alimento deteriorado, for aquecido em banho-maria durante 15 a 20 minutos, ele poderá ser ingerido sem que ocorra a morte do indivíduo. Qual é a explicação bioquímica para esse fato? 40. A temperatura requerida para inativar a ribonuclease é drasticamente reduzida quando ela é tratada inicialmente com ácido perfórmico. Qual é a explicação para tal fato? 41. A soralbumina bovina e a hemoglobina de cavalo têm um PM= 64.500. Considerando-se essas informações é correto afirmar que essas duas proteínas têm a mesma estrutura terciária? 42. A hemoglobina é uma proteína formada por quatro subunidades (duas e duas ) e, reage com o oxigênio conforme a equação que segue. Se os cristais da deoxihemoglobina são expostos ao oxigênio, eles se quebram. O mesmo não acontece com os da mioglobina desoxigenada. Qual é a explicação para tal fato? Hb (deoxihemoglobina) Hb (oxihemoglobina) 43. A ribonuclease de pâncreas bovino (PM= 12.600) e a soralbumina bovina (PM= 68.500) são proteínas globulares constituídas por uma única cadeia polipeptídica. Utilizando-se apenas essa informação seria possível prever qual delas apresenta uma maior relação resíduos hidrofílicos/resíduos hidrofóbicos? 44. Uma determinada enzima é constituída por quatro subunidades idênticas. Em determinadas condições, essas quatro subunidades podem ser dissociadas. Para se testar a atividade das subunidades, deve-se assegurar que não mais existem tetrâmeros em solução. Que tipo de cromatografia deveria ser escolhido para separar os monômeros dos tetrâmeros? Por que? 45. Vinte miligramas de uma mistura de proteínas foram aplicados a uma coluna de DEAE-celulose. Desse total, cerca de 30% correspondem a uma determinada enzima. Após a cromatografia observou-se que cerca de 18,9 mg de proteína foram recuperadas. Entretanto, nenhuma atividade enzimática foi detectada. Como seria possível explicar esses resultados? 46. Uma enzima requer elevadas concentrações de magnésio para exercer sua atividade enzimática. Por outro lado, a remoção de tais íons a inativa irreversivelmente. Na tentativa de se purificar essa enzima, foram utilizadas tanto a cromatografia de troca iônica como a de filtração em gel. Em ambos os casos a enzima sofreu inativação. O que pode ter acontecido? Que modificações poderiam ser efetuadas a fim de melhorar o procedimento de purificação? 47. Duas proteínas P1 e P2 apresentam o mesmo peso molecular. Em pH 5.5, cerca de 75% das estruturas dessas duas proteínas estão na forma de -hélice. Entretanto, quando em pH 8.5, a proteína P1 perde toda estrutura de -hélice e se enrola ao acaso (randon coil). Se o pH da solução é abaixado até 5.5 a estrutura original de P1 é restabelecida. Baseado nessas informações proponha uma maneira de separar essas duas proteínas. 48. Calcular a densidade do tropocolágeno sabendo-se que ele pode ser considerado como sendo um cilindro de 2.800 Å de comprimento por 14 Å de diâmetro e que cada uma das três cadeias polipeptídicas contém 1.000 resíduos de aminoácidos. Dados: 1 Dalton: 1.67.10 -24 g; PM médio dos resíduos de aminoácidos: 120. 49. As proteínas e outros polieletrólitos ligam-se às resinas trocadoras de íons através de ligações eletrostáticas. A afinidade de uma substância por um trocador de íons depende do número e da força de seus grupos carregados bem como dos grupos existentes no trocador iônico. Através da variação do pH e da força iônica, esses polieletrólitos podem ser deslocados do trocador iônico. De acordo com essas informações, qual será o tipo de gradiente a ser usado (crescente ou decrescente) para um: a) trocador de cátions? b) trocador de ânions? 50. Predizer a ação da tripsina (T) e da quimotripsina (Q) sobre os peptídeos: a) Lis-Asp-Gli- Ala-Ala-Glu-Ser-Leu; b) Ala-Ala-His-Arg-Glu-Lis-Fen-Ser c) Tir-Cis-Lis-Ala-Arg-Arg-Gli-Ala; d) Fen-Ala-Glu-Ser-Ala-Gli-Gli-Ala e) Val-Ala-Lis-Glu-Glu-Fen-Val-Met-Tir-Cis-Glu 51. A composição em aminoácidos de um peptídeo P é: Lis (1); Arg (2); Asx (1); Tre (1); Ser (2); Gln (1); Pro (1); Gli (3); Ala (2); Val (1); Cis (1); Ile (1); Fen (2). Após a hidrólise ácida parcial desse peptídeo, foram purificados e seqüenciados nove outros peptídeos: Val-Fen-Ser-Cis; Asn-Lis-Ser-Gli; Cis-Gln-Ile-Gli; Ile-Gli-Ala; Arg-Val; Ala-Ala-Asn; Ser-Gli-Pro; Arg-Fen-Tre-Gli; Pro-Arg-Fen-Tre. Determinar a sequência de P. 52. A análise de um determinado peptídeo revelou a seguinte composição em aminoácidos: Asp (1); Lis (1); Pro (2); Ser (1). O tratamento de P com o reagente de Sanger, seguido de hidrólise ácida, revelou DNP-Ser. Após hidrólise ácida parcial de P foram isolados quatro outros peptídeos que, após hidrólise ácida apresentaram as seguintes composições: P1: Pro (1); Ser (1); P2: Pro (2); Ser (1); P3: Lis (1); Pro (1); P4: Asp (1); Lis (1). Levando em conta essas informações, determinar a seqüência de P. 53. Após a hidrólise de uma proteína com quimotripsina foi isolado um peptídeo P queapresentou a seguinte composição em aminoácidos: Tre (1); Ser (2); Pro (1); Gli (1); Val (1); Cis (1); Fen (1); Tir (1). O tratamento de P com o reagente de Edman revelou dos seguintes derivados: Ser, Ser, Tre, Val. Ao se tratar o peptídeo P com termolisina, obteve-se um peptídeo P1 que, tratado com o reagente de Edman revelou: Fen, Pro, Gli, Cis. Finalmente, a hidrólise ácida parcial de P com HCl 6N resultou na obtenção de um peptídeo A, contendo: Pro(1); Val (1); Fen (1). Deduzir a seqüência de P. 54. Um peptídeo tríptico P apresenta a seguinte composição em aminoácidos: Lis (1); Asx (1); Tre (1); Glx (1); Val (1); Leu (1); Ile (1); Fen (1). A carga desse peptídeo é -1 quando em pH 6.5. O tratamento de P com o cloreto de Dansyl, seguido de hidrólise ácida, revelou DNS-Ser. O tratamento de P com carboxipeptidade liberou sucessivamente Lis, Leu, Ile, Val. Finalmente, o tratamento de P com quimotripsina forneceu um peptídeo P1 cuja composição em amino ácidos é: Asx (1); Val (1); Leu (1); Ile (1). Determinar a seqüência de P. 55. Determinar a seqüência do peptídeo P sabendo-se que ele apresenta a seguinte composição em aminoácidos: Asx (1); Lis (1); Glx (1); Gli (2); Leu (1); Fen (1). Após o tratamento de P com carboxipeptidase seguido de cromatografia em papel, observou-se o aparecimento de Asp (mancha forte), Gli e Leu (manchas mais discretas). O tratamento de P com o reagente de Sanger seguido de hidrólise ácida revelou DNP-Gli. Quando o peptídeo P foi submetido à ação da tripsina, deu origem aos peptídeos P1 e P2. Quando submetido à ação da quimotripsina, deu origem a P3 e P4. As características desse quatro novos peptídeos são: Peptídeo Tripsina Quimotripsina Carboxipeptidase 2,4 FDNB P1 Sim Não Lis Gli P2 Sim Não Asp Glu P3 Não Sim Asp Leu P4 Não Sim Fen Gli 56. Um peptídeo tríptico revelou Arg, Asp e Glu após hidrólise ácida. Quando submetido a uma eletroforese em pH 6.5, migrou para o pólo positivo. Quando tratado com cloreto de Dansyl, revelou DNS-Glu. Após o tratamento de P com o reagente de Edman, obteve-se um peptídeo P1, neutro em pH 6.5, que apresentou quantidades equimoleculares de Arg, NH3, Asp, Glu. Quando P1 foi tratado com cloreto de Dansyl, obteve-se DNS-Glu. Finalmente, após o tratamento de P1 com o reagente de Edman obteve-se um peptídeo P2, neutro em pH 6.5. Determinar a seqüência de P. 57. A hidrólise ácida de um pentapeptídeo P revelou: Glu (2); Lis (1). Quando tratado com tripsina, o peptídeo P deu origem a dois outros peptídeos. Quando submetidos à eletroforese em pH 7.0, um deles migrou para o pólo negativo (cátodo) e o outro migrou para o pólo positivo (ânodo). O tratamento de um deles, com o reagente de Sanger revelou a presença de DNP-Glu. O tratamento do pentapentapeptídeo P com quimotripsina deu origem a dois outros peptídeos além de Glu livre. Determinar a seqüência de P. 58. Um peptídeo P apresenta a seguinte composição em aminoácidos: Lis (1), His (1); Asp (1); Glu (2); Ala (1); Ile (1); Val (1); Tir (1). O tratamento de P com 2,4 DNFB revelou DNP-Asp. O tratamento de P com carboxipeptidase liberou Val. A ação da tripsina sobre P provocou o aparecimento de dois outros peptídeos P1 e P2. A composição em aminoácidos de P1 é: Lis (1); Asp (1); Glu (1); Ala (1); Tir (1) e a de P2 é: His (1); Glu (1); Ile (1); Val (1). O tratamento de P com quimotripsina deu origem aos peptídeos P3 e P4. A composição de P3 é Asp (1); Tir (1); Ala (1). Após hidrólise ácida parcial de P4 foram detectados entre outros, os seguintes peptídeos: His-Glu; Glu- Ile. Determinar a seqüência de P.
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