cromatografia em coluna

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A cromatografia em coluna é uma técnica que possui diversos métodos cromatográficos de separação, ela divide-se em cromatografia gasosa (CG), cromatografia com fluído supercrítico e cromatografia líquida, podendo esta última ser classificada em cromatografia líquida clássica (CLC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Figura 1 – Representação dos tipos de cromatografia existentes
Conforme demonstrado na figura, são vários os tipos de cromatografia em coluna. 
 A cromatografia líquida clássica (CLC) é uma técnica muito utilizada para a purificação de produtos de reações químicas e isolamento de produtos naturais. A cromatografia líquida permite as análises qualitativas e quantitativas de materiais orgânicos e inorgânicos em diversas amostras. 
 As fases estacionárias mais utilizadas são a sílica e a alumina, mas estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. As fases estacionárias sólidas levam a separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição.
O processo de CLC utiliza uma coluna de vidro de diâmetro interno de 10cm ou maior. A fase móvel, denominada eluente, flui através da coluna devido à força gravitacional ou com a aplicação de pressão reduzida. O recheio da coluna é utilizado uma só vez, porque parte da amostra geralmente adsorve de uma forma irreversível. Ela pode ser feita usando-se conta-gotas ou funil de separação. O empacotamento é a etapa principal, pois ela definirá a eficiência da separação. Enquanto alumina é empacotada em sua forma original, a sílica deve sê-lo na forma de suspensão. A eluição na CLC é promovida pela ação da gravidade e as frações individuais da amostra são coletadas, manualmente ou através de um coletor de frações, na extremidade inferior da coluna. Normalmente, o número de frações coletadas é muito grande e seu processamento requer muito tempo e esforço. Em geral, emprega-se alguma técnica auxiliar e os resultados são registrados sob a forma de um cromatograma. 
Cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é importante, uma vez que consegue separar misturas que contém um grande número de compostos similares. Vários nomes têm sido utilizados para denominar esta técnica de cromatografia líquida, o nome mais empregado em português é “cromatografia líquida de alta eficiência” (CLAE).
A CLAE é um tipo de cromatografia líquida que emprega colunas recheadas com materiais especialmente preparados e uma fase móvel, eluida sob altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande variedade de compostos presentes em diversos tipos de amostra, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e detectabilidade.
Os eluentes utilizados na CLAE devem possuir alto grau de pureza e estarem livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, e é por isso que são filtradas e desgaseificadas antes do uso. 
As colunas utilizadas na CLAE são geralmente de aço inoxidável. Seu comprimento é variável, e o diâmetro também, dependendo se a separação é analítica ou preparativa. Essas colunas são reutilizaveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução. 
A vantagem dessa técnica se deve ao fato da grande versatilidade, é possível utilizar várias fases estacionárias existentes.
Há sete diferentes mecanismos que governam as separações em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Cromatografia por adsorção
O mecanismo de separação da cromatografia líquido-sólido (CLS) ou por adsorção baseia-se na competição entre moléculas da amostra e as da fase móvel, para ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária). 
Na cromatografia por adsorção, o método consiste no uso de uma coluna recheada com um sólido (fase estacionária) e uma fase móvel líquida, onde a adsorção consiste num aumento da concentração do soluto (que está em excesso na fase móvel), entre as superfícies das fases móvel e estacionária.
Devido à vasta literatura em cromatografia em camada delgada (CCD), os resultados podem ser transferidos quase diretamente para a CLS, é possível prever as retenções dos componentes da amostra nessas colunas. E por causa da simplicidade da CCD, é muito mais fácil usar a CCD antes e transferir as condições de separação para a CLAE, na qual se pode usufruir de sua maior eficiência. 
Cromatografia por partição
A cromatografia líquido-líquido (CLL) foi desenvolvida para a separação de vários aminoácidos, usando uma fase estacionária de água em sílica e clorofórmio como fase móvel. O mecanismo de separação, baseia-se nas diferentes solubilidades, os componentes mais solúveis na fase estacionária são relativamente retidos por ela enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente pela fase móvel.
Cromatografia líquida com fase ligada
A fase estacionária para a cromatografia líquida com fase ligada surgiu como consequência dos problemas associados a CLL. Nesse método a fase estacionária está quimicamente ligada a superfície de um suporte, eliminando assim o problema da solubilidade da fase estacionária na fase móvel. Essa técnica baseia-se na partição, levando alguns autores a considera-la um tipo de cromatografia líquido-líquido. Em contrapartida, como essa fase estacionária também apresenta influência de grupos ativos (polares) da própria fase estacionária, também ocorre à adsorção. Assim, vários pesquisadores consideram essa técnica um método separado.
As fases reversas (apolares) são mais comumente empregadas em CLAE, podendo ser utilizada na separação de álcoois, antibióticos, alcaloides, vitaminas e etc. 
Quando é difícil manter todas as moléculas na forma não-ionizada, a cromatografia líquida por pares de íons (CLAE-PI), pode ser utilizada. Nela, a molécula do soluto iônico ou ionizável, na sua forma iônica, forma um par de íons por associação com um contra-íon orgânico adequado, dissolvido na fase móvel.
A cromatografia líquida quiral (CLQ) é empregada na separação de enantiômeros (isômeros cujas imagens especulares não são sobreponíveis). Os enantiômeros são considerados compostos quirais por terem um centro quiral, na maior parte das vezes um átomo de carbono quiral (carbono assimétrico). 
As vantagens desse procedimento são: Existem vários tipos de colunas quirais disponíveis comercialmente; as análises cromatográficas são rápidas e os enantiômeros podem ser recuperados com relativa facilidade. As desvantagens são o alto custo das colunas quirais e o difícil entendimento do mecanismo de separação quiral. 
Cada procedimento de resolução de racematos tem as suas vantagens e desvantagens; entretanto, o que tem tido maior destaque é o uso de fases estacionárias quirais. 
Na cromatografia por troca iônica (CTI), a fase estacionária, um tipo de fase ligada com grupos iônicos, como os grupos sulfônico ou carboxílico, é altamente carregada, e solutos com cargas de sinais contrários a esta são seletivamente adsorvidos da fase móvel. Os solutos adsorvidos podem ser subsequente eluídos, por deslocamentos com outros íons, com o mesmo tipo de carga, porém com maior força de interação com a fase estacionária. 
Exemplos de compostos separados por CTI são ácidos carboxílicos, bases orgânicas, peptídeos, aminoácidos e ácidos nucléicos, que podem se ionizar em solução com pH devidamente tamponado, bem como ânions inorgânicos e cátions metálicos ou complexos.
Cromatografia por bioafinidade
Na cromatografia por bioafinidade (CB), as separações ocorrem devido a interações bioquímicas altamente específicas. A fase estacionária contém grupos específicos de moléculas que podem adsorver a amostra se somente certas condições estéreas e relacionadas à carga forem satisfeitas; por exemplo, interações entre antígenos e anticorpos. A CB pode ser aplicada para isolar proteínas, lipídeos, etc., a partir de misturas complexas, sem envolver grandes gastos.
Cromatografia por exclusão
A cromatografia por exclusão (CE) é basicamente diferente de todos os outros métodos cromatográficos,uma vez que ela não se baseia em interações das moléculas de amostra com fase estacionária, e sim no tamanho das moléculas da amostra. Entretanto, não consegue separar misturas complexas, já que poucos picos aparecem no cromatograma.
Em CE as moléculas de tamanho muito grande não conseguem penetrar nos poros da fase estacionária, sendo excluídas e arrastadas pela fase móvel através da coluna em tempo curto. As moléculas da amostra que são pequenas penetram em todos os poros da fase estacionária, sofrendo permeação total, e, como a fase móvel está parada nos poros, a difusão é o único caminho pelo qual as moléculas saem dos poros. Como consequência, elas se movem mais lentamente que as moléculas excluídas ou com penetração parcial, sendo as últimas a chegarem no detector. De acordo com o solvente que compõe a fase móvel, há duas classificações da CE:
Cromatografia por filtração em gel (CFG), que utiliza as fases móveis aquosas, as quais podem ser acrescidas de modificadores orgânicos ou sais para variar a força iônica, ou soluções-tampão para variar o Ph. É muito utilizada para separar biopolímeros solúveis em água, especialmente as proteínas, peptídeos, e etc.
Cromatografia por permeação em gel (CPG), que utiliza fases móveis orgânicas, como tolueno, clorofórmio, etc. Muito utilizada para a separação de polímeros.
Na CLAE emprega-se uma coluna fechada e reaproveitável. Essas colunas são muito eficazes, mas oferecem resistência à vazão da fase móvel. Por isso, é necessário empregar uma bomba de alta pressão, que faz com que a fase móvel migre a uma velocidade razoável através da coluna. Essa vazão é controlada facilmente, resultando em operações mais reprodutíveis que tornam as analises executadas pela CLAE mais precisas. Vários tipos de detectores são colocados na saída da coluna, proporcionando um registro contínuo da composição do efluente. A detecção contínua de grande repetitividade na CLAE proporciona análises quantitativas de alto nível de exatidão e precisão. 
A cromatografia gasosa é utilizada para separar gases ou substâncias volatilizáveis. A separação baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre uma fase estacionária (sólida ou líquida) e uma fase móvel (gasosa).
A amostra, por meio de um sistema de injeção, é introduzida em uma coluna contendo a fase estacionária. O uso de temperaturas convenientes no local da injeção da amostra e na coluna possibilita a vaporização dessas substâncias que, de acordo com suas propriedades e as fases estacionárias, são retidas por tempos determinados e chegam a saída da coluna em tempos diferentes. 
Na cromatografia gasosa (CG) é necessário que a amostra seja suficientemente volátil, afim de que possa passar através da coluna em forma de vapor e, estável termicamente para não se decompor nas condições da separação. Pode-se aumentar sua volatilidade derivando os compostos ou aumentando a temperatura, que tem o seu limite máximo prático de aproximadamente 40ºC devido a fase estacionária, detectores etc. Por isso, somente os gases e cerca de 20% do compostos orgânicos conhecidos podem ser analisados por CG, sem modificar suas estruturas para aumentar a volatilidade. 
A cromatografia gasosa de alta resolução é diferente à CG por causa dos tipos de coluna. Na CG é utilizado colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária, enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma.