Técnicas em biologia molecular parte 1

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técnicas de biologia molecular	
Importância...	
Técnicas de Biologia Molecular	
•  Manipulação e caracterização de ácidos nucléicos	
•  separação de moléculas: eletroforese	
•  clivagem em sítios específicos: endonucleases de restrição	
•  identificação de sequências específicas: hibridização	
•  produção de moléculas de DNA recombinante e manuteção em células: clonagem	
•  amplificação do DNA: reação em cadeia da polimerase	
•  determinação da sequência do DNA: sequenciamento	
•  Isolamento e caracterização de proteínas	
Eletroforese em gel	
•  Objetivo: separação de moléculas de ácidos nucléicos de acordo com seu tamanho	
•  Princípio: quando submetidas a um campo elétrico, moléculas de ácidos nucléicos 
migram em uma matriz de gel de acordo com seu tamanho	
•  molécula de ácido nucléico: carga negativa	
	
	
	
	
	
Eletroforese em gel	
	
	
	
	
	
Cátions Ânions 
+ 
Catodo 
+ 
Anodo 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
Eletroforese em gel	
•  Objetivo: separação de moléculas de ácidos nucléicos de acordo com seu tamanho	
•  Princípio: quando submetidas a um campo elétrico, moléculas de ácidos nucléicos 
migram em uma matriz de gel de acordo com seu tamanho	
•  molécula de ácido nucléico: carga negativa	
•  matriz de gel: material poroso e inerte que “peneira” o ácido nucléico de acordo 
com seu volume	
•  gel de agarose	
•  gel de poliacrilamida	
	
Eletroforese em gel	
•  Princípio	
	
Macromoléculas 
Gel de agarose 
Poros do gel 
Gel de agarose 
- 
+ 
Eletroforese em gel	
•  Procedimentos	
•  Preparo da amostra	
	
	
	
Tampão de 
amostra 
Eletroforese em gel	
•  Procedimentos	
•  Preparo da amostra	
	
•  Corrida do gel	
	
	
- 
+ 
Eletroforese em gel	
•  Procedimentos	
	
	
	
	
	
	
Eletroforese em gel	
•  “Visualização do DNA”	
•  DNA: incolor no gel	
•  utilização de corantes fluorescentes (brometo de etídio)	
•  liga-se ao DNA e intercala-se entre as bases	
•  fluoresce em luz UV	
	
	
	
	
Eletroforese em gel	
•  Aplicações	
•  separação de moléculas de DNA	
•  DNA linear	
•  DNA circular	
•  separação de moléculas de RNA	
•  RNA: fita única e formação de estruturas secundárias	
•  estruturas secundárias podem interferir no padrão de migração - como resolver esse problema?	
Enzimas de restrição	
•  Objetivo	
•  como manipular e analisar longas moléculas de DNA?	
•  utilização de enzimas de restrição para clivagem do DNA em sítios específicos	
•  Enzimas de restrição	
•  endonucleases (rompimento das ligações fosfodiéster)	
•  reconhecimento de sequências específicas	
•  pequenas: 4 a 8 pares de bases	
•  palindrômicas	
•  clivagem em posição definida na sequência reconhecida	
EcoRI	
5’-GAATTC-3’	
3’-CTTAAG-5’	
Enzimas de restrição	
•  Características	
•  encontradas em procariotos	
•  recebem o nome do organismo de onde foram isoladas e purificadas	
	
	
	
Abreviação	
 Significado	
 Descrição	
E	
 Escherichia	
 Gênero	
Co	
 coli	
 Espécie	
R	
 RY13	
 Cepa	
I	
 1a identificada	
 Ordem de identificação	
Enzimas de restrição	
•  Tipos de “corte”	
•  extremidades lisas ou cegas	
	
	
	
	
G T 
C 
T 
A A 
5´ 
3´ 
A C 
T T 
A 
G 5´ 
3´ 
Corte cego 
Hpal (isolada do H. parainfluenzae)	
Enzimas de restrição	
•  Tipos de “corte”	
•  extremidades coesivas	
	
	
	
	
EcoRl (isolada da E. coli)	
G 5´ 
T C T 3´ A A G 5´ 
A A C T T 3´ 
Corte coesivo 
Enzimas de restrição	
•  Aplicações	
•  Tecnologia do DNA recombinante (clonagem e experimentos de expressão de 
proteínas)	
•  Avaliação de polimorfismos e mutações	
Molécula de DNA recombinante 
(criada in vitro por meio da ligação de 
segmentos de DNA que não estão 
unidos em condições normais) 
Hibridização	
•  Objetivo: identificação de moléculas de DNA	
•  Princípio	
•  a capacidade de o DNA desnaturado se reanelar 
permite a formação de moléculas híbridas quando 
segmentos de DNA desnaturados, homólogos e 
com origens diferentes são misturados em 
condições apropriadas	
•  reanelamento: pareamento de bases -> específico -
> identificação de moléculas	
	
	
Hibridização	
•  Como identificar moléculas de ácidos nucléicos com a hibridização?	
•  utilização de moléculas com sequência definida (sondas)	
•  marcação de sondas	
1) Por incorporação: síntese da sonda na presença de um precursor marcado	
- nucleotídeo com porção fluorescente	
- nucleotídeo com átomos radioativos	
2) Adição de marcador a uma das extremidades da sonda já sintetizada	
- adição de fosfato radiomarcado à extremidade 5’ (polinucleotídeo quinase)	
	
	
Hibridização	
	
	
	
Hibridização	
•  Identificação de segmentos de DNA separados por eletroforese: Southern blot	
	
	
	
	
	
	
	
1. Clivagem do DNA por enzimas de restrição	
2. Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose	
3. Desnaturação do DNA (imersão em solução alcalina)	
4. Transferência para membrana positivamente carregada (produção de impressão 
ou marca na membrana)	
5. Incubação com sonda de DNA contendo sequência complementar à que se 
quer pesquisar - hibridização	
6. Identificação da sonda (marcada)	
Hibridização	
•  Identificação de segmentos de DNA separados por eletroforese: Southern blot	
	
	
	
	
	
	
	
Hibridização	
•  Identificação de moléculas de RNAs separadas por eletroforese: Northern blot	
•  digestão enzimática desnecessária (moléculas de RNA são menores)	
•  avaliação qualitativa: o RNAm “A” é expresso no tipo celular “B”?	
•  avaliação quantitativa: o tratamento de uma cultura celular com o indutor “X” 
influencia a expressão do RNAm do gene “Y”	
	
	
Northern blot	
Clonagem	
•  O que é? É a produção de moléculas de DNA recombinante e a sua manutenção nas 
células ou o isolamento de determinada sequência de DNA e obtenção de diversas 
cópias in vitro	
•  vetor: fornece a informação necessária para propagação do DNA clonado	
•  inserto: DNA de interesse inserido no vetor	
	
•  Vetor: molécula de DNA	
•  origem de replicação (replicação independente do cromossomo do hospedeiro)	
•  marca de seleção (identificação)	
•  sítios reconhecidos por enzimas de restrição	
Clonagem	
•  Vetores mais comuns: plasmídeos	
•  DNA circular encontrado em procariotos	
•  origem de replicação	
•  genes que codificam resistência a 
antibióticos (marca de seleção)	
•  sítios de restrição	
•  Outros vetores: vírus bacterianos	
•  Vetores de expressão: controle da expressão 
dos genes no inserto de DNA (promotores)	
Clonagem	
Inserção de fragmento de DNA 
(inserto) no vetor: enzimas de 
restrição, DNA ligase e ATP 
Introdução do vetor com o inserto em 
um hospedeiro (transformação) 
Seleção das bactérias transformadas 
Clonagem	
Clonagem	
Aplicações	
• amplificação de fragmentos de DNA (genes, promotores, oligonucleotídeos)	
• produção de proteínas em larga escala	
	
• construção de bibliotecas de DNA	
• experimentos	
	
Clonagem	
Construção de bibliotecas de DNAComo clonar um gene a partir da biblioteca de DNA? 
Clonagem	
Ensaio de gene repórter	
• O que é?	
–  Gene utilizado para estudar um gene de interesse →	
	
Conferem aos organismos em que são expressos características facilmente 
identificáveis ou quantificáveis	
–  Não expresso normalmente na célula transfectada	
• Como “prepará-lo”?	
	
	
	
Gene de 
interesse 
Gene 
repórter 
Ensaio de gene repórter	
Exemplos de gene repórter: proteína verde fluorescente	
	
	
	
	
	
	
	
A victoria 
Ensaio de gene repórter	
Exemplos de gene repórter	
• Luciferase	
–  Luciferina → oxiluciferina	
	
	
 	
 	
 LUZ → quantificação	
	
• Beta-galacosidase	
–  Substrato: X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- beta-D-galactopiranosídeo)	
	
	
Produto da reação oxidado em composto azul insolúvel	
	
	
Ensaio de gene repórter	
Como introduzir o gene repórter em uma célula?	
• Transfecção	
–  Introdução de moléculas exógenas em células 	
–  DNA plasmidial	
	
• Em geral, a transfecção é seguida pela expressão de um ou mais genes presentes no 
DNA introduzido	
–  Ensaio de gene repórter	
	
• Métodos	
–  Precipitação do fosfato de cálcio	
–  Lipossomos	
–  Eletroporação	
	
	
Ensaio de gene repórter	
Mistura da suspensão de células com o DNA a ser transfectado	
	
	
	
	
Exposição breve a pulsos elétricos	
(abertura de poros nas membranas celular e nuclear)	
	
	
	
	
	
Entrada do DNA exógeno	
	
Ensaio de gene repórter	
Possíveis aplicações	
	
• A transfecção foi bem sucedida?	
	
• O gene de interesse foi expresso?	
• Atividade de um promotor	
	
Ensaio de gene repórter	
•  DNA plasmidial: gene(s) de interesse	
–  Questão do estudo: o T3 influencia a atividade transcricional do TR?	
–  Genes de interesse:	
•  Gene que codifica o TR	
•  Gene que codifica a luciferase, dirigido por promotor contendo TRE 	
	
TR CMV Luciferase TRE 
Ensaio de gene repórter	
	
	
Ensaio de gene repórter	
	
	
1.  Coleta das células 
 
2. Suspensão das células em solução tampão 
 (PBS, cálcio, glicose) 
Centrifugação 
4000 rpm 
3 min 
Pellet: células 
Sobrenadante: meio 
 de cultura 
Ensaio de gene repórter	
	
	
3.  Mistura da suspensão de células ao DNA plasmidial 
4.  Transferência da suspensão de células + DNA plasmidial 
para cuvetas de 0,4 cm 
5.  Eletroporação 
DNA plasmidial 
TR 
TRE-luciferase 
+ 500 µL suspensão de 
células 
(10 x 106 células) 
 500 µL /cuveta 
(10 x 106 células) 
950 µF e 0,3 kV 
Ensaio de gene repórter	
	
	
6. Ressuspensão das células eletroporadas em meio de 
cultura 
 
 
 
7. Distribuição da suspensão de células em placas de 12 
poços e tratamentos 
1 mL/poço 
Veículo T3 10-5M 
T3 
10-6M 
T3 
10-7M 
Ensaio de gene repórter	
37oC e 5% CO2 24h 
13000 rpm por 2’ 
20 µL do lisado celular + 
20 µL do substrato da enzima luciferase 
Lise celular 
150 µL tampão de lise 
Luminômetro 
Ensaio de gene repórter	
Luminômetro 
 
Substrato da luciferase 
 + 
Lisado celular 
 
 
 
Avaliação da emissão de luz 
(Proporcional à ativação do promotor TRE) 
Luciferina 
 
Luciferase ↓ 
 
 oxiluciferina + 
luz 
Ensaio de gene repórter	
Unidades Luz Média Taxa de ativação 
Veículo 2.000 
(controle) 2.100 2100 1 
2.200 
T3 10-8M 17.500 
18.000 19.500 9,3 X 
19.500 
T3 10-7M 20.000 
21.000 21.000 10 X 
22.000 
Reação em cadeia da polimerase	
•  Amplificação de segmentos específicos de DNA, por meio de reação de replicação 
do DNA in vitro (“no tubo de ensaio”)	
	
	
Reação em cadeia da polimerase	
•  O que é necessário para a realização de uma PCR?	
	
	
Molde de DNA 
Iniciador 
DNA polimerase 
(tampão/cofatores) 
Nucleotídeos 
Helicase? 
5’ 
3’ 
3’ 
5’ 
5’ 
 
3’ 
3’ 
 
5’ 
Reação em cadeia da polimerase	
•  Qual a outra forma de separar a dupla-fita de DNA?	
	
	
aumento de 
temperatura TERMOCICLADOR 
Reação em cadeia da polimerase	
•  Procedimento	
	
	
	
1. Separação da dupla-fita de DNA molde 
(aquecimento) 
2. Anelamento do iniciador 
(resfriamento) 
3. Polimerização 
(resfriamento) 
Depois de várias repetições / ciclos, 
quantas moléculas de DNA haverá? 
Reação em cadeia da polimerase	
•  Procedimento	
	
	
	
Depois de várias repetições / ciclos, 
quantas moléculas de DNA haverá? 
Reação em cadeia da polimerase	
•  Problema: temperatura de desnaturação do DNA (94oC)	
•  possibilidade de desnaturação da polimerase	
•  acrescentar polimerase após cada etapa de desnaturação?	
	
	
	
	
•  Utilização de DNA polimerase isolada de bactérias encontradas próximas de vulcões 
•  Thermus aquaticus - Taq polimerase 
 
 
 
Reação em cadeia da polimerase	
•  Procedimento	
	
	
	
Reação em cadeia da polimerase	
Reação em cadeia da polimerase	
•  RT-PCR (reação de PCR com transcrição reversa)	
	
	
	
	
Reação em cadeia da polimerase	
•  Aplicações da RT-PCR	
•  diagnóstico de doenças genéticas	
•  avaliação da expressão gênica em células e tecidos	
•  inserção de genes de eucariotos em procariotos	
	
	
	
	
Reação em cadeia da polimerase	
•  PCR em tempo real	
•  amplificação e quantificação simultâneas de uma molécula alvo de DNA	
•  como o DNA é quantificado à medida que é amplificado?	
	
	
	
	
Corantes que se intercalam na dupla-fita de DNA 
Reação em cadeia da polimerase	
•  PCR em tempo real	
•  amplificação e quantificação simultâneas de uma molécula alvo de DNA	
•  como o DNA é quantificado à medida que é amplificado?	
	
	
	
	
Sondas de DNA marcadas 
Sequenciamento	
Por que sequenciar o DNA?	
	
	
	
	
	
	
Sequência dos genes 
Sequência de seus produtos funcionais 
Função celular específica 
Sequenciamento	
•  Princípio	
•  reação de PCR: desnaturação, 
anelamento e polimerização	
•  adição de desoxinucleotídeos e 
didesoxinucleotídeos	
	
	
Sequenciamento	
•  O que ocorre quando a polimerase incorpora um didesoxinucleotídeo em vez de um 
desoxinucleotídeo?	
•  A polimerização de nucleotídeos pela polimerase cessa quando um 
didesoxinucleotídeo é incorporado	
	
	
	
Sequenciamento	
•  Resultado	
	
	
	
	
Sequenciamento	
•  Gel do sequenciamento	
	
	
	
	
Comparação das 
posições de cada 
conjunto de bases: 
sequência da 
molécula de DNA	
Sequenciamento	
•  Alternativa: marcação de cada tipo de didesoxinucleotídeo (A, T, C e G) com um 
fluorórofo diferente - distinção por fluorometria em uma única mistura	
	
	
	
	
	
	
Sequenciamento	
•  Automatização: sequenciadores computadorizados	
	
	
	
	
	
	
	
Sequenciamento	
Sequenciamento	
•  Sequenciamento pelo método de shotgun	
•  múltiplas cópias do genoma são quebradas em fragmentos de 2000 e 1000 pares 
de bases	
•  seringa pressurizada	
	
	
	
Sequenciamento	
•  Sequenciamento pelo método de shotgun	
	
	
	
	
	
	
DNA genômico 
Fragmentos de DNA (gerados por 
passagem atravésde seringa 
pressurizada - shotgun) sequenciados 
Alinhamento de sequências contínugas 
Sequência final 
Sequenciamento