P03 Genética

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QUESTÕES SOBRE GENÉTICA MOLECULAR – TERCEIRO CONTEÚDO
Na extração de DNA, tanto no método caseiro quanto no método laboratorial, são consideradas três etapas gerais, quais são e o que acontece em cada uma delas? 
Lise das células, remoção de contaminantes e precipitação do DNA purificado
Na etapa da lise celular, usamos um bastão específico para a maceração do material em questão dentro do microtubo, depois utilizamos um detergente para lisar as membranas celulares (Dodecil sulfato de sódio ou outo detergente para auxiliar na solubilização das membranas, com aumento da temperatura para aproximadamente 60°C). Na remoção de contaminantes, usa-se alguns reagentes químicos (fenol clorofórmico para desnaturar proteínas) e uma centrífuga a remoção de contaminantes como RNA, membranas, proteínas e outras macromoléculas. Na terceira fase depois da retirada do microtubo da centrífuga espera-se encontrar o material dividido em duas fases, a fase aquosa onde deve estar o DNA e fase fenólica, onde irá ser transferido i material sobrenadante para outro tubo e fazer a precipitação do DNA.
É usado o etanol para ''sequestrar'' a água e como o DNA é solúvel em água ele irá precipitar. 
Explique detalhadamente as etapas de uma Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), outra técnica utilizada corriqueiramente nos laboratórios de genética molecular.
O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes. Na etapa 1, o DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a 92°-95°C por cerca de 30 segundos. Na etapa 2, o DNA desnaturado é helicoidizado a um excesso de primers de oligonucleotídeos sintéticos incubando-os juntos a 50-60°C por 30 segundos. A temperatura ideal de helicoidização depende da composição básica do primer. Na etapa, a DNA-polimerase é usada para replicar o segmento de DNA entre os sítios complementares aos primers oligonucleotídicos. O primer fornece as 3'-OH necessárias para a ampliação covalente, e o DNA genômico desnaturado fornece a função molde desejada. A polimerização geralmente é feita a 70-72°C por 1,5 minutos. Os produtos do primeiro ciclo d replicação são então desnaturados, e helicoidizados a primers oligonucleotídicos e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido.
Quais as características da DNA polimerase utilizada? Porque essas características são fundamentais ao desenvolvimento dessa técnica? E a partir de qual bactéria foi extraída a enzima inicialmente.
A taq DNA polimerasee é termoestável e amplica as sequências de DNA in vitro. Esta polimerase permanece ativa durante a etapa de desnaturação pelo calor. Como resultado, a polimerase não precisa não precisa ser adicionada após cada ciclo de desnaturação. Inicialmente a enzima taq polimerase foi extraída da bactéria Thermus aquaticus.
A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) é utilizada para obter grandes quantidades de fragmentos de DNA a partir de amostras contendo quantidades ínfimas de DNA. Descreva os passos envolvidos nesta técnica completando o gráfico abaixo. 
Considere dois fragmentos de DNA que foram amplificados em uma reação de PCR, um com aproximadamente 300 pares de bases (pb) e outro com 650 pb. 
A) Explique a metodologia que permite a visualização e a distinção entre estes dois fragmentos. 
Usado o PCR, 
B) Se estes dois fragmentos são de DNA, como eles podem ser separados apenas pela diferença de tamanho (explique detalhadamente)?
Explique o que significa o termo “Tecnologia do DNA recombinante”.
Tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de técnicas que permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos. Um exemplo seria o isolamento, extração e o enxerto de gene humano para a produção de insulina em bactérias da espécie Escherichia coli.
Quais são as aplicações da tecnologia do DNA recombinante?
A Tecnologia do DNA recombinante tem uma ampla aplicação. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da sequência de um gene e consequentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável.
Como consequência do desenvolvimento desta tecnologia é atualmente possível realizar investigação de paternidade e o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através da análise de DNA.
Discuta a importância das enzimas de restrição para a tecnologia do DNA recombinante.
As várias aplicações de técnicas de DNA recombinante requerem não só a construção de moléculas de DNA recombinante, mas também a amplificação destas moléculas recombinantes, isto é, a produção de muitas cópias ou clones de tais moléculas. Isto é obtido garantindo-se que um dos DNA parentais incorporado à molécula de DNA recombinante seja capaz de auto-replicação. Na prática, insere-se o gene ou a sequência de DNA de interesse em um vetor de clonagem especialmente escolhidos. A maioria dos vetores de clonagem comumente usados são derivados de cromossomos virais ou plasmídeos.
	Um vetor de clonagem tem três componentes essenciais: (1) uma origem de replicação, (2) um gene marcador dominante selecionável, geralmente um gene que confere resistência a drogas à célula hospedeira, e (3) pelo menos um único sítio de clivagem de endonucleases de restrição – um sítio de clivagem que está presente apenas uma vez em uma região do vetor que não pertuba a origem da replicação ou o gene marcador selecionável. Os vetores de clonagem atualmente usados contêm um grupo de sítios de restrição com a denominação de poliligador ou sítio de policlonagem.
Qual é a função biológica desempenhada pelas enzimas de restrição nos organismos que a produzem naturalmente?
A função biológica das endonucleases de restrição é proteger o material genético de bactérias de “invasão” por DNA exógenos, tais como moléculas de DNA de outras espécies ou DNA virais. Como resultado, as endonucleases de restrição às vezes são referidas como os sistemas imunológicos de procariontes.
Explique como duas moléculas de DNA, obtidas de fontes biológicas diferentes, podem se unir com o uso das enzimas de restrição?
Uma característica útil de muitas nucleases de restrição é que elas fazem cortes desencontrados, isto é, elas cortam os dois filamentos de uma dupla hélice em pontos diferentes. Devido à natureza palindrômica (sequência de pares de nucleotídeos que são lindas de modo igual para frente ou para trás a partir de um eixo central de simetria) dos sítios de restrição, os cortes desencontrados produzem segmentos de DNA com pontas unifilamentares complementares. Como todos os fragmentos de DNA resultantes terão pontas unifilamentares complementares, elas farão pontes de hidrogênio umas com as outras e poderão ser reunidas em condições apropriadas de renaturação usando a enzima DNA-ligase para reconstruir as ligações fosfodiéster ausentes em cada filamento. Assim, as moléculas de DNA podem ser cortadas em pedaços, chamados de fragmentos de restrição, e os pedaços podem ser novamente unidos com DNA-ligase, quase à vontade.
Como o DNA recombinante pode ser multiplicado milhões de vezes?
Através da amplificação de moléculas de DNA recombinante. Isto é obtido garantindo-se que um dos DNA parentais incorporado à molécula de DNA recombiante seja capaz de auto-replicação. Na prática insere-se o gene ou a sequência de DNA de interesse em um vetor de clonagem especialmente escolhido. A maioria dos vetores de clonagem comumente usados são derivados de cromossomos virais ou plasmídeos.
O que são plasmídeos e como eles podem ser utilizados nas técnicas de DNA recombinante?
Plasmídeos são moléculas de DNA extracromossômicas circulares bifilamentares presentes emmicrorganismos, especialmente bactérias. Muitos plasmídeos levam genes de resistência a antibióticos, que são marcadores selecionáveis ideiais. Os plasmídeos podem ser usados como vetores de clonagem pois contém genes de resistência a ampicilina e tetraciclina e vários sítios de clivagem por enzimas de restrição.
Cite três componentes essenciais em um plasmídeos, de modo que este possa ser utilizado na tecnologia do DNA recombinante.
Uma origem de replicação, um gene marcador dominante selecionável, geralmente um gene que confere resistência a drogas à célula hospedeira, e pelo menos único sítio de clivagem de endonuclease de restrição.
Os plasmídeos que receberam um trecho de DNA de outra fonte pode ser transferido para uma células bacteriana de E. coli, processo denominado de transformação. Entretanto, nem todas as células captam este plasmídeo durante o processo. Como estas células (as que contêm o plasmídeo), podem ser identificadas dentre todas as células de E. coli? 
Esta células contendo plasmídeo podem ser identificadas através do marcador de seletividade na bactéria. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibiótico.
Em continuidade ao raciocínio da questão anterior, algumas outras vezes o plasmídeo em construção não recebeu a molécula de DNA de interesse e as extremidades geradas após o corte pela enzima de restrição se soldaram novamente entre elas mesmas, sendo que o plasmídeo adquire a conformação original. Como pode ser identificado uma célula de E. coli que recebeu um plasmídeo sem o inserto de uma outra célula que recebeu um plasmídeo com inserto?
Entretanto, é possível averiguar ao menos se, no conjunto de plasmídeos formados, a maior parte está carregada (com inserto) ou, ao contrário, vazia. Para tal os plasmídeos de clonagem têm uma segunda marca de resistência a antibióticos (em geral, tetraclina), que é perdida quando o plasmídeo é aberto e o inserto é clonado. Significa dizer que o sítio de clonagem é interno ao gene para a resistência à tetraciclina. Significa também dizer que as bactérias que têm plasmídeos vazios são resistentes a ampicilina e tetraciclina, enquanto as que têm plasmídeos com inserto só mostram resistência a ampicilina. O procedimento baseia-se na obtenção de uma réplica de uma placa de Petri contendo colônias crescidas em presença de ampicilina, que é então carimbada sobre uma nova placa de Petri contendo tetraciclina. As colônias que crescerem também em tetracilcina não interessam, mas podem ser contadas.
Alguns plasmídeos possuem uma forma de identificação pela cor da colônia onde ele foi inserido. Explique como isto é realizado?
As bactérias contendo os plasmídeos recombinantes são selecionadas pela coloração branca das colônias, ao que aquelas que receberam o vetor parental(sem um inserto clonado) apresentam colônia de cor azul, resultaeo da ação de uma Beta-gactocsidase ativa.
No sequenciamento automático de bases os seguintes fragmentos foram gerados: Primer-----A, PrimerT, Primer-C, Primer----G, Primer---A, Primer--T. Qual é a sequência de bases resultante? (Cada traço em preto depois do primer representa uma base).
Pr _ _ _ _ _ A Pr T Pr _ C Pr _ _ _ _ G Pr _ _ _ A Pr _ _ T
Quanto ao sequenciamento de bases do DNA, explique por que deve ser usado apenas um primer na reação de sequenciamento? Responda utilizando um pequeno trecho de DNA dupla hélice para esclarecer.
Por que a DNA polimerase interrompe a polimerização da cadeia crescente quando é utilizado o método de Sanger?
Leka -> As DNA-polimerases têm necessidade absoluta de uma ponta 3’-OH livre no filamento primer de DNA. Se for adicionado um 2’, 3’-didesoxinucleotídeo ao final de uma cadeia, ele irá bloquear a subsequente ampliação desta cadeia, pois os 2’, 3’-didesoxinucleotídeos não têm 3’-OH. Usando-se 2’, 3’-didesoxitimidina-trifosfato (ddTTP), (2) 2’, 3’-didesoxicitidina-trifosfato (ddCTP), (3) 2’, 3’-didesoxiadenosina-trifosfato (ddATP) e (4) 2’, 3’-didesoxiguanosina-trifosfato (ddGTP) como finalizadores de cadeia em quatro reações separadas de síntese de DNA, podem ser geradas quatro populações de fragmentos, e cada população irá conter cadeias que terminam todas na mesma base (T, C, A ou G).
Tony -> É baseado na incorporação de desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) a uma cadeia de DNA em crescimento, tendo como molde o DNA de interesse. Quando os ddNTPs são adicionados, a extensão da cadeia é interrompida pois esses didesoxinucleotídeos não apresentam um grupo hidroxila (OH) 3’ necessário para a ligação do próximo desoxinucleotídeo (dNTP). Como esses ddNTPs são marcados, podem ser detectados e a seqüência dos nucleotídeos identificada.