Proteínas e Sistemas de Expressão

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02/03/2016 
1 
Proteínas e 
Sistemas de expressão I 
Aula 3 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo 
Ciências Físicas e Biomoleculares 
IFSC - USP 
1 
Síntese de proteínas: 
Tradução e transcrição em procarioto e eucarioto; 
 
Objetivos da expressão de proteínas na produção industrial; 
 
A escolha do Sistema de expressão 
 
1. Sistema de expressão 1: bactéria E. coli 
 1.1. Vetores comerciais 
 1.2. Problemas com expressão em E. coli 
 1.2.1. Gene exógeno 
 1.2.2. Ìntrons 
 1.2.3. Sequências de terminação 
 1.2.4. Viés de códons 
 1.3. Como escapar de códons raros 
2- Problemas devido às limitações de E. coli como hospedeira 
para a síntese 
 2.1 – Produção de proteases 
 2.2 – Glicosilação 
 2.3 – Ligações dissulfeto 
 2.4 – Sistema de secreção 
 2.5 – Enovelamento incorreto 2 
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2 
Biotecnologia Clonagem gênica 
Produtos úteis são obtidos de culturas microbianas 
Passado: Limitação da lista de produtos aos compostos 
naturalmente sintetizados por microrganismos 
 
Muitos medicamentos importantes que não são produzidos por 
microrganismos, mas sim por organismos mais complexos, não 
podiam ser obtidos por essa maneira 
Mudança: Clonagem gênica 
3 
Biotecnologia Clonagem gênica 
P
C
R
 –
 R
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 P
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Lodish et al.,Molecular Cell Biology, 5th ed 
Vetor de clonagem 
4 
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3 
Digestão 
Biotecnologia 
Clonagem gênica 
E. coli DH5 
Ligação 
transformação 
Produção de 
grandes quantidades 
de plasmídeos com 
o gene de interesse 
 
 
MiniPrep 
5 
+ 
1 2 3 
1 – Vetor + gene ligados 
2 – marcador de peso molecular 1kb Plus 
3 – Vetor + gene após digestão 
Vetor de 
expressão 
E. coli BL21 
Indução 
Purificação 
Biotecnologia Clonagem gênica 
6 
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4 
Prática: produção de proteínas recombinantes 
não é tão fácil!! 
1) Organismos específicos 
2) Vetores especiais 
3) Rendimento satisfatório 
7 
Síntese de proteínas 
 
Tradução e transcrição em procarioto e eucarioto 
8 
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5 
Síntese de proteínas 
 
Tradução em procarioto 
9 
Procariotos 
10 
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6 
Procariotos 
11 
Transcrição 
DNA mRNA 
Procariotos 
12 
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Transcrição e tradução em bactérias 
5´ 3´ 
13 
20 Aminoácidos 
 
Gly – Glicina 
Ala- Alanina 
Val – Valina 
Leu – Leucina 
Ile – Isoleucina 
Ser- Serina 
Thr – Treonina 
Cys – Cisteína 
Met – Metionina 
Glu – Ácido glutâmico 
Asp – Ácido aspártico 
Lys – Lisina 
Arg – Arginina 
Asn – Asparagina 
Gln – Glutamina 
Phe – Fenilalanina 
Tyr – Tirosina 
His – Histidina 
Trp – Triptofano 
Pro - Prolina 
 3 nucleotídeos = 1 códon = 1 aminoácido 
N-formilmetionina 
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8 
Tradução em Procariotos 
mRNA Proteínas 
15 
16 
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9 
Expressão em E. coli 
Amplamente direcionada 
para 3 diferentes locais: 
 
- Citoplasma; 
- Periplasma (ambiente 
mais oxidante); 
- Meio de cultura através 
da secreção 
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Sistemas de transporte de proteínas em procariotos 
ou 
Peptídeo sinal 
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Síntese de proteínas 
 
Tradução e transcrição em eucarioto 
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Eucariotos 
Célula animal 
Célula vegetal 
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Eucariotos 
21 
22 
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23 
V
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) 
V
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24 
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1) Clivagem proteolítica 
(RE, CG e vesículas) 
 
2) Glicosilação (adição de cadeias 
de carboidratos) 
 
3) Ligações de dissulfeto 
 
4) Folding apropriado e 
organização multimérica 
(somente protéinas com 
folding apropriados passam 
para o CG e para a membrana) 
Modificações principais 
em proteínas que 
passam pelo Retículo 
Endoplasmático: 
25 
Glicosilação 
Ligações dissulfeto 
(adição de cadeias de carboidratos) 
Reação ocorre na asparagina-alvo 
Promove: 
Folding correto 
estabilidade 
Auxilia estabilizar estrutura terciária e quaternária 
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• Lúmen do retículo endoplasmático 
rugoso Eucariotos 
• Espaço periplasmático somente em 
proteínas secretadas e nos domínios 
exoplasmáticos das proteínas de 
membrana 
Procariotos 
(bactérias) 
Ligações dissulfeto 
Protein disulfide isomerase (PDI) DsbA 
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Modificações principais em proteínas que passam 
pelo Retículo Endoplasmático: 
Chaperonas que auxiliam no processo 
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 Proteínas 
 
Estrutura Primária 
(Sequência de aa) 
 
Estrutura Secundária 
(folding local – α hélice e β folha) 
 
Estrutura Terciária 
(conformação tridimensional do polipeptídeo) 
 
Estrutura Quaternária 
(complexo de mais de um polipeptídeo) 
 
 
Funções 
Regulação 
Estrutura 
Movimento 
catálise 
Transporte 
Sinalização 
Sequência 
Estrutura 
Função 
29 
Objetivos da expressão de proteínas na 
produção industrial: 
- Fermentação segura e controlada 
- Fermentação barata 
- Alto Nível de Produção recombinante (escala de g/L e não de mg/L) 
- Fácil recuperação das proteínas expressadas 
- Não degradação da proteína expressada 
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A escolha do Sistema de expressão 
Biotecnologia Industrial – vários sistemas de expressão: 
 
- Bactérias 
- Fungos leveduriformes (Leveduras) 
- Fungos filamentosos 
-Animais 
- Plantas 
31 
A escolha do Sistema de expressão 
Microrganismos possuem crescimento extremamente rápido, 
superando qualquer organismo superior como plantas e animais. 
Quantidades imensas podem ser produzidas sob condições 
ambientais corretas em pequenos períodos de tempo e requerem 
um pequeno espaço físico 
Bactérias (Procariotos) 
Leveduras (Eucariotos) 
Fungos filamentosos (Eucariotos) 
Algas (Eucariotos) 
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Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Preferencialmente utilizadas porque oferecem: 
1. Requerimento de fontes de carbono baratas; 
2. Acúmulo de biomassa rápido; 
3. Amenabilidade para fermentação em alta densidade celular 
4. Processo de escalonamento (Scale up) simples 
 Sahdev et al., Mol Cell Biochem (2008) 307:249–264 
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A escolha do Sistema de expressão 
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Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Escherichia coli – é o microrganismo mais utilizado para expressão de 
proteínas heterólogas 
 
- Geneticamente bem caracterizada; 
- Várias ferramentas já surgiram e foram melhoradas; 
 
35 
E. coli DH5a é a mais usada para clonagem de rotina. 
Genótipo: 
dlacZ DeltaM15 Delta(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rK-
mK+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 
 
- blue/white screening 
- Mutação lacZDelta M15 permite a triagem para células 
blue/white; 
- Mutações em recA1 and endA1 aumenta a estabilidade do inserto 
e melhora a qualidade do plasmídeo preparado por minipreps. 
- Mutação recA1 reduz recombinação homóloga para um inserto 
mais estável. 
- Mutação em endA1 reduz a digestão por endonuclease de 
restrição de plasmídeos para um rendimento mais alto na 
extração plasmideal. 
- hsdR17(rK-mK+) reduz atividade da endonuclease de restrição 
EcoK. 
Biotecnologia 
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19 
Expression vector appropriate host strain 
pBAD vectors Top10, >LMG194 
pET vectors BL21 (DE3) 
pGEX vectors BL21 
pMal vectors BL21, TB1 
pProEx vectors BL21, DH10BpQE vectors M15 or M15 [pREP4] 
pRSET vectors BL21 (DE3) pLysS 
pTrcHis vectors BL21 
Biotecnologia Clonagem gênica 
37 
Escherichia coli – é o mais utilizado 
Clonagem 
Expressão 
Bem sucedida 
Proteína ativa Proteína inativa 
Não há expressão 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Desafios!! 
Transformação 
http://anatomias.mediasmile.net/biologia.htm 
Hospedeira para replicação 
 
Hospedeira para expressão 
Vetores de replicação 
 
Vetores de expressão 
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Apesar de haver sistemas sofisticados de expressão em 
E. coli, existem muitas dificuldades associadas à produção 
de proteínas nesse hospedeiro 
2 Grupos de Problemas 
1- Aqueles devido à sequência do gene exógeno 
 
2- Aqueles devido às limitações de E. coli como hospedeira 
para a síntese 
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Os sinais de cada organismo 
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21 
A expressão do gene depende de este estar 
cercado por uma coleção de sinais que 
podem ser reconhecidos pela bactéria. 
1) Promotor: marca onde a transcrição deve iniciar (reconhecida pela 
RNA polimerase) 
2) Terminador: marca onde a transcrição deve parar 
 
3) Sítio de ligação do ribossomo (RBS): sequência nucleotídica curta 
reconhecida pelo ribossomo no qual ele deve se ligar no mRNA 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
41 
Os genes de organismos superiores também são cercados por 
sinais de expressão, mas suas SEQUÊNCIAS não são as mesmas 
que as de E. coli. Por isso, um gene exógeno (não bacteriano) 
pode permanecer inativo em E. coli - a bactéria pode não 
reconhecer seus sinais!! 
Solução: 
 Inserção do gene exógeno em um VETOR de modo a colocá-lo sob o 
controle de um conjunto de sinais de expressão de E. coli 
 
Se for possível: gene será transcrito e traduzido 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
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Vetores de expressão 
Veículos de clonagem que suprem a falta desses sinais e por isso são 
utilizados na produção de proteínas recombinantes 
 Promotor 
Componente crítico do vetor de expressão 
A) Controla o primeiro estágio de expressão gênica, a ligação do RNA-
polimerase ao DNA; 
 
B) Determina a frequência na qual o mRNA é sintetizado. 
 
 
C) Possibilidade de regulação do promotor (Indução e Repressão) 
Existem os PROMOTORES FRACOS E OS FORTES 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
https://www.ufpe.br/biolmol/plasmideos-mapas_e_comentarios.htm 
43 
Por que regular a expressão de um gene? 
-Efeito tóxico da proteína recombinante: efeito danoso sobre a 
bactéria. Monitorar a sua síntese pode impedir o acúmulo em níveis 
tóxicos; 
-Diminuição do nível de transcrição: um nível muito alto pode 
afetar a capacidade de replicação do plasmídeo recombinante, 
levando à sua eventual perda na cultura 
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CAP (proteína ativadora de catabolismo) e lacI controlam o operon lac 
- CAP possibilita que a bactéria utilize fontes alternativas de 
carbono, como lactose, na ausência de glicose; 
 
- lacI – repressor que impede a expressão do operon lac na 
ausência de lactose. 
45 
Regulação gênica é um processo complexo, que envolve o promotor 
apenas indiretamente. Contudo muitas sequências importantes para a 
indução ou a repressão estão em regiões adjacentes ao promotor. 46 
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RNA 
polimerase 
Operon lac 
Promotor lac 
IPTG 
47 
Por que usar vetores comerciais? 
http://www.resourcesgraphics.com/vector-graphic/vector-icon-vector-graphic/a-classic-expression-vector-material.html 
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/PEIA-Misc/pcDNA3-3-
TOPO-Mammalian-Vector.html 
48 
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25 
Vetor de expressão comercial 
Vetores comerciais voltados para expressão de proteínas 
heterólogas usam o mesmo tipo de controle de expressão, sendo 
induzidos com a presença de IPTG que é análogo à Lactose, mas 
nunca é degradado no meio de cultura 
49 
Novagen 
IPTG 
Remove a 
proteína lacI 
repressora do 
operador 
Vetor de expressão comercial 
50 
02/03/2016 
26 
1ª fase – Clonagem em 
Vetor e E. coli para clonagem 
Primers com sítio 
de restrição 
2ª fase – Clonagem em 
Vetor de Expressão em E. coli para 
clonagem 
De acordo com o gene de resistência 
apresentado no plasmídeo 
51 
3ª fase – Transformação do 
Vetor de Expressão em E. coli para 
Expressão 
Miniprep 
Transformação 
E. coli BL21 (DE3) 
E. coli DH5α 
Controle de expressão 1 
52 
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27 
3ª fase – Transformação do 
Vetor de Expressão em E. coli para 
Expressão 
Miniprep 
E. coli DH5α 
Transformação 
E. coli BL21 (DE3) pLysS 
Controle de expressão2 
Em caso de toxicidade! 
53 
Vetor de expressão e linhagens de E. coli 
 
Atenção com o vetor 
e com a linhagem 
da bactéria!! 
 
Neste caso: 
 
lacI no plasmídeo 
 
em cis 
 
Ou 
 
em trans 
54 
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28 
Por que usar vetores comerciais? 
http://www.resourcesgraphics.com/vector-graphic/vector-icon-vector-graphic/a-classic-expression-vector-material.html 
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/PEIA-Misc/pcDNA3-3-
TOPO-Mammalian-Vector.html 
1) Possibilidade de controle de expressão 
2) Sistema de fusão - vantagens 
55 
Novagen 
Cassetes: 
Promotor + operador +RBS+start codon+ HIS6 +gene+stop codon 
Sistema de fusão 
 Vetor de expressão comercial 
 
Sistema de fusão 
Sítio múltiplo 
de clonagem 
56 
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29 
 Vetor de expressão comercial 
 
Sistema de fusão Peptídeo curto + Proteína 
Produto é uma proteína híbrida: peptídeo curto, codificado pela fase de 
leitura de E. coli, fusionado à porção aminoterminal da proteína exógena 
Vantagens: 
1) Impedimento de pareamentos de base intracadeia causados por estruturas 
secundárias o que interfere na interação do ribossomo com seu sítio de 
ligação; 
2) Presença de peptídeo bacteriano no início da proteína pode estabilizar a 
molécula e impedir degradação pela célula hospedeira; 
3) O segmento bacteriano pode ser um peptídeo sinal e direcionar a proteína de 
E. coli para sua posição correta na célula; 
4) O segmento bacteriano pode ajudar na purificação permitindo que a proteína 
de fusão seja recuperada por cromatografia de afinidade. 57 
4ª fase: Expressão e purificação 
IPTG 
Antibiótico de acordo com o gene de 
resistência presente no vetor 
58 
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 Vetor de expressão comercial 
 
Sistema de fusão 
Desvantagem 
Pode haver alterações na proteína recombinante decorrentes da presença 
deste segmento bacteriano remoção deste fragmento através de um 
tratamento da proteína de fusão com um composto químico, ou enzima, que 
cliva a cadeia polipeptídica na junção entre seus 2 componentes ou em um 
sítio próximo à ela. 
Peptídeo curto - - Proteína 
Não permite clivagem!! Permite clivagem!! 
59 
 Vetor de expressão comercial 
 
Sistema de fusão 
His-
Tag 
Proteína de 
interesse 
His-
Tag 
Proteína de 
interesse 
+ TROMBINA 
60 
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31 
Qual linhagem de E. coli usar? 
http://anatomias.mediasmile.net/incompetent.jpg 
61 
Vetor de expressão e linhagens de E. coli 
 
BL21 Star™(DE3): F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) 
 
BL21 Star™(DE3)pLysS: F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) 
pLysS (CamR) 
 
 
 
- DE3 – contém lisogene DE3 que contém o gene da T7 RNA polimerase sob o 
controle do promotor lacUV5, o qual requer IPTG para induzir aexpressão. 
 
-Mutação no rne gene (rne131) codifica uma enzima RNase E truncada que 
perde a habilidade em degradar RNAm, resultando em um aumento da estabilidade 
do RNAm.  São úteis para expressão de proteínas recombinantes em altos níveis, 
com isso não são indicadas para expressar genes tóxicos. 
 
- E. coli B/r strains – não contém lon protease e são deficientes na protease da 
membrana celular OmpT  redução da degradação de proteínas heterólogas 
 
-BL21 Star™(DE3)pLysS –contém o plasmídeo pLysS que produz lisozima T7 
para reduzir o nível da expressão basal do gene de interesse. Contém o gene para 
resistência ao cloranfenicol e contém origem p15A que permite compatibilidade 
com os plasmídeos pUC- ou pBR322-derived. 62 
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Vetores e linhagens comerciais são 
interessantes, pois permitem: 
 
- Regular a expressão do gene em estudo; 
- Permitem estabilidade dos RNAm; 
- Diminuição da degradação por não apresentar algumas proteases; 
- Alguns permitem que a purificação da proteína seja mais fácil 
e/ou eficiente; 
 
 
63 
5ª fase: Eletroforese em gel de poliacrilamida 
64 
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33 
 Purificação por afinidade da proteína His6-Ers em resina de íons 
níquel. Legenda: M-marcador, FS-fração solúvel, FI-fração 
insolúvel, NL-proteínas não ligadas, LAV-lavagem, 25-25 mM 
imidazol,50-50 mM imidazol, 100- 100 mM imidazol, 200- 200 
mM imidazol, 300-300 mM immidazol. 
 
By Raissa Gutierrez 
65 
Problemas com expressão 
em E. coli? 
http://1.bp.blogspot.com/_aguR8wNTXac/SfPbYf1ODII/AAAAAAAAAbk/UevCilGLZ4Q/s400/Microbiology+cartoon2.JPG 
66 
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34 
Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
1- Problemas devido à sequência do gene exógeno 
1.1 – Íntrons – bactérias não removem íntrons dos transcritos 
 Alternativa: usar o DNA complementar (cDNA) preparado a 
 partir do mRNA; 
 
1.2 – Sequências que agem como sinais de terminação em E. coli.
 Alternativa: alterar através de mutação dirigida por 
 oligonucleotídeos; 
 
1.3 – Viés de códons do gene pode não ser o ideal para a tradução em 
E. coli e os tRNA podem ter dificuldades na tradução do gene. Isso pode 
reduzir a quantidade de proteína a ser sintetizada. 
67 
 3 nucleotídeos = 1 códon = 1 aminoácido 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Códons raros em E. coli 
Há sempre uma tendência da célula a utilizar 
mais um códon do que outro para o mesmo 
aminoácido códons raros 
Os RNAs de transferência de cada célula reflete a 
tendência de códons do seu RNA mensageiro 
68 
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Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Códons raros ou menos utilizados em E. coli 
69 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Códons raros em E. coli 
 O requerimento de um ou mais tRNA durante a superexpressão de um gene 
alvo heterólogo em E. coli resulta em uma taxa de tradução mais baixa 
devido a diferenças no uso de códons. 
 Se sistemas de vetores de expressão de altos níveis em E. coli são 
utilizados, a presença de pequeno número de códons raros no gene 
heterólogo não leva a redução significante na síntese da proteína alvo. No 
entanto, se há um grupo de códons raros em um gene a ser expressado, há 
lentidão, especialmente quando há sucessivos códons raros na região N-
terminal. 
70 
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36 
Códons raros em E. coli 
- como escapar 
dessa?? 
http://chapabranca.files.wordpress.com/2008/10/desespero.gif 
71 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? 
http://img.dailymail.co.uk/i/pix/2007/09_01/littleCartoon0609_468x305.jpg 
A) Em alguns casos, aumentar a concentração do 
aminoácido limitante no meio de cultura pode 
melhorar a expressão!! Não tem papel 
significante na mudança dos níveis de utilização 
de códons da maioria dos tRNA isoaceptores 
correspondentes àquele códon raro. 
72 
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Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? 
B.1) Manipular o número de cópias do gene de tRNA 
respectivo através de plasmídeo. Ex.: pRIG, pRARE, 
pACYC, pSC101 
http://2.bp.blogspot.com/_ymBY53jID_w/SiCR-aW-xII/AAAAAAAAJuo/YOyhmR7Aca4/s400/desesperada.jpg 
B) Estudos já mostraram melhoras no rendimento quando E. 
coli hospedeira é utilizada com expressão adicional de 
argU (AGG/AGA), glyT (GGA), ileX (AUA), leuW (CUA), 
proL (CCC) através do aumento da dose gênica dos 
respectivos tRNA. 
73 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? 
http://chapabranca.files.wordpress.com/2008/10/desespero.gif 
B.2) Células que já possuem cópias extra de tRNAs 
 
BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL (Stratagene, USA)  cópias extra 
de tRNAs (argU, ileY, leuW e proL), contorna os problemas de 
expressão de genes ricos em CG heterólogos. 
 
Rosetta™ possui tRNAs para os códons AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 
GGA. 
 
Rosetta 2™ possui tRNA para o códon CGG. 
 
74 
02/03/2016 
38 
Apesar destes avanços, a utilização ótima de 
códons raros para a superprodução de uma 
proteína eucariótica ativa cataliticamente em um 
nível industrial ainda permanece como um desafio. 
Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
Códons raros em E. coli - como escapar dessa?? 
75 
Glazer Microbial Biotechnology – Fundamentals of Applied Microbiology 
Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
Quando obtém-se corpos de inclusão... 
Citoplasma 
não 
diferenciado 
Alta 
concentração 
de proteína 
Grandes 
chances de 
associação 
intermolecular 
Grandes 
chances de 
agregação 
Condições do citoplasma: pH, força iônica e potencial redox 
diferentes do ambiente normal de enovelamento destas proteínas nas 
suas conformações finais 
E. coli 
76 
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
Quando obtém-se corpos de inclusão... 
Corpos de inclusão: agregados insolúveis de proteínas inativas 
 
- Facilmente purificados do homogenado de E. coli; 
- São obtidos em altos níveis de expressão; 
- Resistentes a proteases celulares o que confere menor degradação; 
- Retém o mínimo de impurezas e portanto necessitam de menos 
passos de purificação  mais rapidez; 
- Há uma perda de proteína ao se recuperar, mas esta é compensada 
por um nível muito alto de expressão 
 
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
Quando obtém-se corpos de inclusão... 
Principal desafio: converter em produto corretamente enovelado, solúvel e 
eficiente; 
 
Desvantagens: 
-Recuperação reduzida; 
-Necessidade de otimização rigorosa de condições de refolding para cada tipo 
de proteína; 
-Possibilidade de que o procedimento de re-solubilização possa afetar a 
atividade da proteína reenovelada. 
 
Portanto, as vezes, a purificação de uma proteína solúvel é menos cara e mais 
rápida quando comparada a purificação e refolding de corpos de inclusão 
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
 
2- Problemas devido às limitações de E. coli como 
 hospedeira para a síntese 
 
2.1 – Produção de proteases 
2.2 – Glicosilação 
2.3 – Ligações dissulfeto 
2.4 – Sistema de secreção 
2.5 – Enovelamento incorreto 
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2.1 - E. coli pode produzir proteases que podem degradar a 
proteína recombinante. 
 
 
• E. coli BL21 (Novagen, USA) é o organismo ideal para a rotina de 
expressão de proteína 
 
•Deficientes nas proteases lon e OmpT, da membrana 
externa, através de uma modificação genética que reduz 
a degradação de proteínas heterólogas expressadas.Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
 
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 Sistema de expressão 1 
Procarioto - Bactérias 
2.2 – E. coli pode não processar a proteína recombinante 
corretamente. Algumas proteínas eucarióticas são 
glicosiladas e a glicosilação é extremamente incomum em 
bactérias; 
 
Glicosilação – existe uma certa glicosilação não enzimática em E. coli, 
mas o produto em geral resulta com algumas variações com relação 
à produzida nas células eucarióticas. Neste caso, em geral, não tem 
solução, é uma limitação da utilização de E. coli para sintetizar 
proteínas eucarióticas 
 
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
 2.3 - E. coli geralmente é incapaz de sintetizar as ligações 
dissulfeto presentes em muitas proteínas eucarióticas. Com 
isso, a proteína pode ficar insolúvel e formar corpos de 
inclusão e pode ser inativa. 
 
• Proteínas com formação de ligação dissulfeto estável somente ocorre no periplasma, 
catalisada pelas oxidoredutases tiol-dissulfeto conhecidas como proteínas Dsb (DsbA e DsbC) 
http://www.sciencemag.org/content/303/5657/534.full.pdf?sid=7f6370d4-2232-45a2-895c-788c9b24548f 
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A família Origami possui mutações na tireodoxina redutase e 
na glutationa redutase que facilita a formação de ligações de 
dissulfeto no citoplasma e, consequentemente, permitem um 
arranjo (forma) da proteína apropriada, aumentando a solubilidade 
da mesma. 
  inclui as deficiências de Ion e OmpT das linhagens BL21, 
melhorando a solubilidade das proteínas recombinantes 
 
Linhagens E. coli Origami-B são derivadas de uma mutante de lacZY da 
BL21 para controlar precisamente os níveis de expressão pelo ajuste fino da 
concentração do IPTG como no caso do mutante lacY 
OrigamiTM2 (Novagen) 
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Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
2.4 - Falta um sistema eficiente de secreção em E. coli 
 
A maioria das linhagens de E. coli não tem uma via bem organizada 
de translocação pela membrana externa 
Algumas sequências sinais podem auxiliar esta secreção para o meio 
extra-celular através de uma via dependente de partícula de 
reconhecimento de sinal (SRP dependente). 
GTPase pode se ligar tanto à uma sequência sinal 
de certas proteínas a serem secretadas (sendo 
altamente hidrofóbica) ou à segmentos 
transmembrânicos de proteínas de membrana 
interna assim que elas emergem dos ribossomos 
 complexo é direcionado à membrana 
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Sistema de expressão 1 
 
Procarioto - Bactérias 
2.4 - Falta um sistema eficiente de secreção em E. coli 
 
• Sequência sinal da OmpA tem sido usado em alguns estudos 
para translocar alguns peptídeos recombinantes para o periplasma 
para provável secreção no meio de cultura; 
 
 
• Co-expressão de dois fatores de secreção (secY e secE) tem 
sido utilizado para aumentar a secreção de algumas proteínas. 
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Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
2.5 - E. coli pode não enovelar a proteína corretamente 
Enovelamento correto – E. coli que sintetize grandes quantidades de 
proteínas chaperonas  adaptadas para auxiliar no dobramento de novo da 
proteína, facilitando a obtenção conformacional própria do polipeptídeo 
expressado, e/ou localização celular sem se tornar parte da estrutura final 
Chaperonas evitam a formação de corpos de inclusão e agregação 
DnaK e GroEL (chaperonas de enovelamento) 
IbpA (chaperona de suporte – holding) 
ClpB (chaperona desagregadora) 
 
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http://4.bp.blogspot.com/_wLLEpWhLkEw/SFG-d3gxm5I/AAAAAAAAAD4/MYMLo9cnftk/s320/d%25C3%25BAvida.jpg 
Sistema de expressão: bactérias – E. coli 
 
E se nada disso der certo... 
Modifique: 
- A Temperatura de expressão: diminua a temperatura (15-23C) 
 interações hidrofóbicas determinando corpos de inclusão são 
temperatura-dependentes; 
 heat shock proteases são menos ativas a menor temperatura; 
 
- A composição do meio: 
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Referências bibliográficas 
 
Brown TA. Clonagem gênica e análise de DNA – Uma introdução. 4 
ed., Porto Alegre, Ed Artmed, 2003. – Capítulo 13 
 
Gad SC. Handbook of Pharmaceutical Biotechnology. New Jersey, Ed. 
Willey, 2007. – Capítulo 1.1 
 
Sahdev S, Khattar SK, Saini KS. 2008. Production of active eukaryotic 
proteins through bacterial expression systems: a review of existing 
biotecnology strategies.Mol Cell Biochem. 307:249-264. 
 
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