02 2013Marcadores Moleculares

Prévia do material em texto

Marcadores Moleculares
Profª Dra. Letícia da Conceição Braga
Definição
Polimorfismos genéticos: Variações nas sequências de DNA que 
ocorrem na população geral de forma estável, sendo 
encontradas com frequência de 1% ou superior.
Marcadores genéticos moleculares
 Polimorfismo de DNA
◦ Mutações pontuais: substituição ou inserção/deleção
◦ macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções
Mutações pontuais 
Substituições de nucleotídeos 
A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT 
A’. ATCTCGTGATTATAGTCGTA
TAGAGCACTAATATCAGCAT
Pequenas deleções e/ou inserções - InDels
B. ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT
B’. ATCTCGT---GTCGTA
TAGAGCA---CAGCAT
Classificação dos marcadores moleculares
 Marcadores aleatórios (RDM- Randon DNA markers): são
gerados aleatoriamente, de sítios polimórficos do genoma.
 Marcadores gene-alvo ( GTM- gene targeted marker):são
derivados de polimorfismos dentro de genes.
 Marcadores funcionais (FM- Functional markers): são
derivados de sítios polimórficos dentro de genes envolvidos
em determinada variação fenotípica .
Tipos de marcadores moleculares
Imunoensaios
 Isoenzimas Citometria de fluxo
eletroforese uni ou bidirecional
espectrometria de massa
Northern Blotting
 RNA RT-PCR
Microarray
PCR em Tempo Real
Southern blotting
RFLP 
 DNA PCR
Sequenciamento
CGH
Marcadores Moleculares detectáveis por 
Hibridização
Sequência de DNA
A T G C T C G A C G T T C G A C T T A G C
C T G C A A G C T
Sequência da Sonda
Marcadores Moleculares detectáveis por 
amplificação
Isoenzimas
 Grupo de múltiplas formas moleculares de uma
proteína, resultante de variações alélicas em sequências
codificantes.
 Rápido
 Simples
 Baixo custo
 Marcadores codominates
 Baixo nº de polimorfismos
 Influência ambiental
Marcadores Genéticos Moleculares
 RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)
 RAPD (Random amplification of polymorphic DNA)
 VNTR (Variable number tandem repeat)
 SSR (Simple sequence repeats or Microsatellite
polymorphism)
 STR (Short tandem repeat)
 SNP (Single nucleotide polymorphism)
Restriction Fragment Length Polymorphism
- RFLP
 Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição
 RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de
restrição de DNA específicos
 Polimorfismo deriva de mutação pontual: substituição,
inserção, deleção
 Utiliza-se DNA celular total
 São marcadores codominantes
 Apresentam alta reprodutibilidade
RFLP
RAPD- Fragmentos de DNA amplificados 
ao acaso
 Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo 
genoma.
 Utiliza “primers” curtos (8-12 nucleotídeos) e de sequencias 
arbitrárias, com sequencias alvo desconhecida.
 Baseia-se na amplificação de DNA utilizando um único 
“primer”.
 Detecta polimorfismo em apenas um par de bases.
 Não Permite distinguir heterozigotos.
 Baixa reprodutibilidade.
RAPD (Amplificação Randômica de DNA polimórfico)
RAPD
AA
Aa
aa
AA Aa aa
PCR com primers arbitrários: 
acúmulo de siglas!
 RAPD
◦ Random Amplified Polymorphic DNA
 DAF
◦ DNA Amplification Fingerprinting
 AP-PCR
◦ Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
 MAAP
◦ Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir todas 
as pequenas variações na técnica)
Microssatélites 
◦ também conhecido como Simple Sequence Repeat (SSR), 
 Seqüências curtas (2 a 9 bases) repetidas em tandem 
 Normalmente locus simples e multi-alélico
 Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições
◦ Escorregamento da DNA polimerase durante a replicação
◦ Crossing-over desigual entre cromátides irmãs
 Codominante
 Altamente reprodutível 
Microssatélites
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG 
GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG 
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA 
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC 
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT 
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG 
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC 
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG 
 
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
Sondas multilocaisVNTR (Variable Number Tandem 
Repeat) ou STR (Short Tanden Repeats)
..CTGATTCGAGCTAGG cacacacacaca TTGCTTGACAGGT..
..GACTAAGCTCGATCC gtgtgtgtgtgt AACGAACTGTCCA..
Alec Jeffreys, 1985 
gtgtgtgtgtgt
VNTR (Número Variável de Repetições em Tandem)
13 Loci STR com sua posição
no cromossomo
CSF1PO
D5S818
D21S11
TH01
TPOX
D13S317
D7S820
D16S539 D18S51
D8S1179
D3S1358
FGA
VWA
AMEL
AMEL
SISTEMAS DE AMPLIFICAÇÃO
PCR Multiplex
 Até 16 marcadores podem ser
utilizados por tubo.
 Pode ser utilizado pequenas
quantidades de DNA(1 ng)
 DNA de baixa qualidade e degradado.
 O uso de fluorescencias de cores
diferentes permitem a análise de
produtos de PCR de mesmo tamanho.
SSR (Repetições de Sequência Simples) ou 
Microssatélites
A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9
- Simple sequence repeats (SSR) – 13.000 marcadores disponíveis
GACTAAGCTCG
..CTGATTCGAGCTAGG cacacacacaca TTGCTTGACAGGT..
..GACTAAGCTCGATCC gtgtgtgtgtgt AACGAACTGTCCA..
CTTGACAGGT
Indivíduo Número de repetições Fragmento pb
A 15 127
B 21 139
AFLP- Polimorfismo de comprimento de 
fragmentos amplificados
 Marcadores AFLP são dominantes
 Grande poder de detecção de variabilidade genética.
 Da mesma forma que o ensaio de RAPD, o ensaio AFLP não requer 
conhecimento prévio de sequencia de DNA.
 O ensaio de AFLP é bem mais eficaz quando comparado ao ensaio de
RAPD, pois na etapa de PCR, são utilizados primers bem mais longos, o
que aumenta a especificidade da amplificação
SNP- Single Nucleotide Polymorphism
(Polimorfismo de nucleotídeo único)
 Polimorfismo baseados na alteração de uma única base no
genoma
◦ Exemplo:AAGGTTA muda para ATGGTTA
 Podem ocorrer em regiões expressas e não expressas
 Abundância no genoma e elevado grau de polimorfismo
◦ Genoma humano: 90% polimorfismo
 Detecção de diferentes alelos para genes de interesse
 Sequenciamento de DNA em grande escala
SNP- Single Nucleotide Polymorphism
(Polimorfismo de nucleotídeo único)
 São encontrados no genoma em :
◦ Individuais
◦ Haplogrupos: mutações que ocorrem próximas e são herdadas 
juntas
Indivíduo Sequencia encontrada Haplogrupo
1 GATATTCGTACGGATGTATC AG
2 GATGTTCGTACTGATGTATC GT