Técnicas de estudo de RNA e transcriptomas

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Técnicas de análise de RNA
Extração de RNA 
- Agentes desnaturantes (ex: isotiocianato de guanidina, Trizol)
-Inibidores de RNAse
-Água DEPC (dietilpirocarbonato)
-DNAse livre de RNAse
Eletroforese de RNA
–agentes desnaturantes : Formaldeído
Formamida
Hidróxido de metilmercúrio
Glioxal/DMSO
Lavagem com PBS e centrifugação das células
Adição de TRIzol 
Lise por passagem em seringas de 18 gauge ou por 
agitação vigorosa 
Adição de clorofórmio
Agitação e centrifugação 
Transferência de sobrenadante para novo tubo
Precipitação do RNA com isopropanol
Ressupensão em água DEPC (dietilpirocarbonato)
Extração de RNA usando TRIzol
TRIzol ou TRI reagente 
(reagente de tiocianato de guanidina e fenol ácido) 
Pureza e Quantificação do RNA
Quantificação por
espectrofotometria:
- DNA  1 UA260nm = ~50 µg/mL
- RNA  1 UA260nm = ~40 µg/mL
Eletroforese de RNA
• Eletroforese em gel de agarose (1-2 %)
Desnaturante (formaldeído)
• Coloração com Brometo de etídio
Eletroforese de RNA
 Eletroforese em gel de agarose (1-2 %)
Desnaturante (formaldeído)
 Coloração com Brometo de etídio
Isolamento de mRNA
Oligo 
dT
5’3’
• Métodos clássicos (em pequena escala)
– Northern blot
– RT-PCR
– Quantitative real-time PCR
Análise da expressão gênica
Vinblastina
Taxol
Northern blot
RNase H
RT-PCR
RT-PCR 
A transcrição reversa foi feita 
com oligo-dT
A PCR realizada com iniciadores 
específicos para o gene da 
actina A
mRNA Poli A+ isolado de 0.25, 
0.5, or 1 µg de RNA total de 
fígado de camundongo 
(canaletas 1 - 3). 
C: Controle negativo. 
B: mRNA isolado de 103 ou 104
células HeLa (canaletas 1 & 2)
M: 123 bp ladder.
Quantitative Real-Time PCR (qPCR)
1) Iniciadores forward e reverse
são estendidos com Taq DNA 
polimerase como em um PCR 
tradicional. 
2) Uma sonda ligada a dois 
fluorocromos anela a uma 
seqüência gênica entre os dois 
iniciadores. 
3) À medida que a polimerase 
estende os iniciadores a sonda 
é deslocada. 
4) A atividade 5’ exonucleasica da 
DNA polimerase cliva o corante 
repórter da sonda. 
5) Após ser liberado do quencher, 
um sinal fluorescente é emitido. 
Uma das opções de 
visualização do resultado 
da qPCR é a janela de 
amplificação. 
 Esta opção mostra a 
quantidade de fluorescência 
obtida em cada ciclo de 
amplificação. 
O ciclo threshold (Ct) é 
aquele no qual a quantidade 
de fluorescência ultrapassa 
um limite crítico 
previamente determinado 
(nível threshold) 
representado pela linha 
escura horizontal. Amostras 
que ultrapassam este nível 
são positivas. 
• Métodos em larga escala
– Microarrays
– RNAseq
Análise da expressão gênica
Microarrays
• Experimento de Microarray
 Fabricação da lâmina/chip
O “Spotter” e fixação no U.V.
Marcação direta
scanner
Escaneamento 
Aquisição dos 
dados
GenePix
Quantarr
ay
RNASeq
1
2
Análise e contagem das sequências obtidas por RNASeq
• https://www.youtube.com/watch?v=O4bBZ_U
OcK8
• https://www.youtube.com/watch?v=hlbbtgauw
pg