Introdução à Virologia Molecular

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INTRODUÇÃO
Há mais diversidade biológica dentro dos vírus do que em todo o resto dos reinos bacteriano, vegetal e animal juntos. Este é o resultado do sucesso dos vírus em parasitar todos os grupos conhecidos de organismos vivos, e o entendimento desta diversidade é a chave para compreender as interações do vírus com seus hospedeiros. 
Durante o primeiro módulo da presente disciplina trataremos de “virologia molecular" em um sentido bastante amplo, isto é, “virologia a nível molecular", ou talvez até "as moléculas e os vírus”. As interações proteína-proteína, proteína-ácido nucléico e proteína-lipídeos que determinam a estrutura das partículas virais, a síntese e expressão do genoma do vírus, e os efeitos do vírus na célula hospedeira. Esta é a virologia, no nível molecular.
No entanto, antes de explorar ainda mais o assunto, é necessário compreender a natureza do vírus. Também é útil conhecer algo da história da virologia ou, mais precisamente, a forma em que a virologia, como uma disciplina de direito próprio, surgiu com a finalidade de compreender as preocupações atuais e perspectivas futuras. Estas são as finalidades deste capítulo introdutório. 
VÍRUS NÂO SÃO ORGANISMOS VIVOS
Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios e submicroscópicos. Esta simples, mas útil 
definição percorreu um longo caminho para descrever e diferenciar os vírus de todos os outros grupos de organismos vivos, no entanto, essa definição é curta e por si só, insuficiente. Claramente, não é um problema diferenciar os vírus dos organismos superiores macroscópicos. Mesmo dentro de uma definição ampla de microbiologia englobando procariotos e eucariotos microscópicos como algas, protozoários, e fungos, na maioria dos casos será suficiente. Alguns grupos de organismos procariotos, no entanto, têm ciclos de vida parasitária intracelular especializada e podem confundir a definição acima. Estes são as riquétsias e clamídias, bactérias parasitas intracelulares obrigatórias que evoluíram para estar associadas a células que podem existir fora das células de seus hospedeiros por um curto período de tempo antes de perder a viabilidade. Portanto, é necessário acrescentar cláusulas adicionais para a definição do que constitui um vírus:
Partículas de vírus são produzidas a partir da montagem de componentes pré-formados, considerando que os demais agentes crescem a partir de um aumento da soma integrada de seus componentes e se reproduzem por divisão.
Partículas de vírus (vírions) não crescem ou sofrem divisão.
Nos vírus falta a informação genética que codifica o aparato necessário para a geração de energia metabólica ou para a síntese de proteínas (ribossomos).
Não há vírus conhecido que tenha potencial bioquímico ou genético para gerar a energia necessária para conduzir todos os processos biológicos de síntese (por exemplo, síntese de macromoléculas). Eles são, portanto, absolutamente dependentes da célula hospedeira para esta função. Frequentemente pergunta-se se os vírus são vivos ou não. Uma visão é que dentro da célula hospedeira são vivos, enquanto fora dela são meramente montagens complexas de produtos químicos metabolicamente inertes. Isso não quer dizer que alterações químicas não ocorrem em partículas extracelulares de vírus, como será explicado, mas estas não são em nenhum sentido aquelas envolvidas no "crescimento" de um organismo vivo.
Um erro comum é que os vírus são menores que as bactérias. Embora isto seja verdade
na maioria dos casos, o tamanho por si só não serve para distinguir entre eles. O maior
vírus conhecido (Mimivírus, que significa "que imita micróbio”) é de 400 nm de diâmetro, enquanto que as menores bactérias (por exemplo, Mycoplasma, Ralstonia pickettii) tem apenas 200 a 300 nm. Embora sempre haverá algumas exceções e incertezas no caso de organismos que são demasiado pequenos para ver e, em muitos casos difíceis de estudar, a maior parte das orientações acima serão suficientes para definir um vírus. 
Uma série de entidades patogênicas singulares possui propriedades que confundem a definição acima e ainda são claramente mais semelhante a vírus do que outros organismos. Estas são as entidades conhecidas como viróides, virusóides, e príons. Viróides são moléculas de RNA circular muito pequenas (200-400 nucleotídeos), com uma estrutura secundária semelhante a uma haste. Eles não têm capsídeo ou envelope e estão associados a certas doenças nas plantas.  Sua estratégia de replicação é como a dos vírus, eles são parasitas intracelulares obrigatórios. Virusóides são satélites, moléculas semelhantes a viróides, um pouco maior do que viróides (por exemplo, cerca de 1000 nucleotídeos), que são dependentes da presença de replicação de certos vírus para poder se multiplicar (por esse motivo são chamados de “satélites”); são embalados em capsídeos virais como passageiros. Os príons são agentes infecciosos geralmente constituídos por um único tipo de molécula protéica, sem qualquer componente de ácido nucléico. 
A confusão decorre do fato de que a proteína príon e o gene que a codifica também são encontrados em células normais “não infectadas”'. Estes agentes estão associados com "doenças por vírus lento", tais como a doença de Creutzfeldt-Jakob em seres humanos, scrapie em ovinos, e encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos. O Capítulo 8 trata desses  agentes sub-virais infecciosos em mais detalhes. Além disso, a análise genômica tem mostrado que mais de 10% do genoma da célula eucariótica é composto por elementos móveis semelhantes a retrovírus (retrotransposons), os quais podem ter tido um papel considerável na formação destes complexos genomas (capítulo 3). Ademais, certos genomas de bacteriófagos assemelham-se a plasmídeos de bactérias em sua estrutura e na maneira como eles são replicados. A investigação, então, revelou que a relação entre vírus e outros organismos vivos é talvez mais complexa do que era anteriormente pensado. 
A HISTÓRIA DA VIROLOGIA 
É fácil considerar eventos que ocorreram antes da nossa própria experiência pessoal como pré-históricos. Muito tem sido escrito sobre virologia como uma "nova disciplina" na biologia, e isso é verdade, tanto quanto o reconhecimento formal de vírus como distintos de outros organismos vivos é de interesse. No entanto, agora percebemos que não só eram antigos povos conscientes dos efeitos da infecção pelo vírus, mas em alguns casos, eles também realizaram uma pesquisa ativa sobre as causas e prevenção de doenças de vírus. Talvez o primeiro registro escrito de uma infecção por vírus consiste de um hieróglifo de Memphis, a capital do Egito antigo, elaborado em cerca de 3700 aC, que descreve um sacerdote do templo mostrando sinais clínicos típicos de poliomielite paralítica. O faraó Ramsés V, que morreu em 1196 aC e cujo extraordinariamente bem preservado corpo mumificado  está agora em um museu do Cairo, acredita-se ter sucumbido à varíola - uma comparação entre as lesões pustulosas na face da múmia e dos pacientes mais recente é surpreendente.
A varíola era endêmica na China em 1000 aC. Em resposta, a prática de “variolação” foi desenvolvida. Reconhecendo que os sobreviventes dos surtos de varíola foram protegidos da infecção posterior, os chineses inalaram as crostas secas de lesões de varíola como rapé ou, em modificações posteriores, inocularam o pus de uma lesão em um arranhão no antebraço. Variolação era praticada há séculos e foi mostrado ser um método eficaz de prevenção da doença, embora arriscada, porque o resultado da inoculação nunca foi determinado. Edward Jenner foi quase morto por variolação aos sete anos de idade! Não surpreendentemente, essa experiência estimulou-o para encontrar um tratamento alternativo mais seguro. Em 14 de maio de 1796, ele usou material infectado com varíola bovina obtido da mão de Sarah Nemes, uma leiteira de sua aldeia natal de Berkeley, em Gloucestershire, Inglaterra, para com sucesso vacinar James Phipps de 8 anos de idade. Embora inicialmente controversa, a vacinação contraa varíola foi quase universalmente adotada em todo o mundo durante o século XIX. 
Este sucesso inicial, apesar de um triunfo da observação científica e do raciocínio, 
não foi baseado em qualquer compreensão real da natureza dos agentes infecciosos que 
surgiram separadamente de outra linha de raciocínio. Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), um comerciante holandês, construiu o primeiro microscópio simples e com este identificou bactérias como "animaizinhos" que viu em seus espécimes. No entanto, não foi até que Robert Koch e Louis Pasteur em 1880 propusessem conjuntamente a “teoria do germe" da doença que o significado destes organismos se tornou aparente. 
Koch definiu os quatro critérios famosos agora conhecidos como postulados de Koch, que são ainda geralmente considerados como a prova de que um agente infeccioso é responsável por uma doença específica:
O agente deve estar presente em todos os casos da doença.
O agente deve ser isolado do hospedeiro e cultivado in vitro.
A doença deve ser reproduzida quando uma cultura pura do agente é inoculada em um hospedeiro suscetível saudável.
O mesmo agente deve ser recuperado, mais uma vez, do hospedeiro infectado experimentalmente.
Posteriormente, Pasteur trabalhou extensivamente sobre a raiva, que ele identificou como sendo causada por um "vírus" (do latim para "envenenar"), mas apesar disso ele não discriminou entre as bactérias e outros agentes da doença. Em 1892, Dimitri Iwanowski, um botânico russo, mostrou que extratos de plantas de tabaco doentes podem transmitir a doença para outras plantas, após a passagem através de filtros de cerâmica fina o suficiente para reter a menor bactéria conhecida. Infelizmente, ele não sabia o significado desses resultados. Alguns anos mais tarde (1898), Martinus Beijerinick confirmou e extendeu os resultados de Iwanowski sobre vírus do mosaico do tabaco (TMV) e foi o primeiro a desenvolver a idéia moderna do vírus, que ele chamou de contagium fluidum vivum (“germe vivo solúvel”). Freidrich Loeffler e Paul Frosch (1898) mostraram que um agente semelhante foi responsável pela febre aftosa em bovinos, mas, apesar da percepção de que esses agentes recém-descobertos causaram doenças em animais bem como em plantas, as pessoas não aceitaram a idéia de que eles poderiam ter alguma coisa a ver com doenças humanas. Essa resistência foi finalmente dissipada em 1909 por Karl Landsteiner e Erwin Popper, que mostraram que a poliomielite foi causada por um “agente filtrável”, a primeira doença humana a ser reconhecida como sendo causado por um vírus.
Frederick Twort (1915) e Félix d'Herelle (1917) foram os primeiros a reconhecer vírus que infectam bactérias, que d'Herelle chamou de bacteriófagos ("comedores de bactérias"). Na década de 1930 e décadas subseqüentes, virologistas pioneiros como Salvador Luria, Max Delbrück, e muitos outros usaram estes vírus como sistemas modelo para investigar vários aspectos da virologia, incluindo a estrutura do vírus (Capítulo 2), genética (Capítulo 3), e replicação (Capítulo 4). Estes agentes relativamente simples têm provado ser muito importantes para a nossa compreensão de todos os tipos de vírus, incluindo os dos seres humanos que são muito mais difíceis de propagar e estudar. A história adicional da Virologia é a história do desenvolvimento experimental de ferramentas e sistemas com os quais os vírus podem ser examinados e que abriu novas áreas de biologia, incluindo não só a biologia do vírus, mas também inevitavelmente a biologia das células hospedeiras das quais estes agentes são inteiramente dependentes.
SISTEMA DE HOSPEDEIROS VIVOS
Em 1881, Louis Pasteur começou a estudar a raiva em animais. Durante vários anos, ele desenvolveu métodos de produção de preparações de vírus atenuados progressivamente por secagem da medula espinhal de coelhos experimentalmente infectados com a raiva que, quando inoculado em outros animais, protegeriam do desafio com isolados virulentos do vírus da raiva. Em 1885, ele inoculou uma criança, Joseph Meister, com esse, o primeiro vírus da vacina produzido artificialmente (como a antiga prática de variolação e o uso de Jenner do vírus da varíola bovina para a vacinação a partir de vírus que ocorriam naturalmente). Plantas inteiras têm sido utilizadas para estudar os efeitos do vírus de plantas após a infecção, desde que o vírus do mosaico do tabaco foi descoberto por Iwanowski. Normalmente, esses estudos envolvem esfregar preparados contendo partículas do vírus nas folhas ou caule da planta. 
Durante a Guerra Espanhola-Americana do século XIX e da subseqüente construção do Canal do Panamá, o número de mortes americanas devido a febre amarela foi colossal. A doença também parece ter se espalhado lentamente para o norte nos Estados Unidos continentais. Em 1990, através da transmissão experimental para ratos, Walter Reed demonstrou que a febre amarela era causada por um vírus transmitido por mosquitos. Esta descoberta permitiu finalmente para Max Theiler em 1937 propagar o vírus em embriões de galinha para produzir uma vacina atenuada, a Estirpe 17D-que ainda está em uso hoje em dia. O sucesso desta abordagem levou muitos outros investigadores, de 1930 a 1950, a desenvolver sistemas animais para identificar e propagar vírus patogênicos.
Células eucarióticas podem ser cultivadas in vitro (cultura de tecidos) e os vírus podem ser propagados nestas culturas, mas estas técnicas são caras e tecnicamente bem exigentes. Alguns vírus se replicam nos tecidos vivos de embriões em desenvolvimento de ovos de galinha, como o vírus da gripe. Linhagens “adaptadas ao ovo” do vírus da gripe replicam bem em ovos e titulações bem altas de vírus podem ser obtidas.  Ovos de galinhas embrionados foram utilizados pela primeira vez para propagar vírus nas primeiras décadas do século XX. Este método provou ser altamente eficaz para o isolamento e cultura de muitos vírus, particularmente das linhagens do vírus da gripe e poxviruses diversos (por exemplo, o vírus vaccinia). A contagem das “pústulas” na membrana corioalantóica de ovos produzidos pela replicação do vírus vaccinia foi o primeiro ensaio quantitativo para qualquer vírus. Sistemas de hospedeiros animais ainda tem seus usos em virologia:
Para produzir vírus que não podem ser efetivamente estudados in vitro (por exemplo, o vírus da hepatite B) 
Para o estudo da patogenia de infecções por vírus (por exemplo, coxsackievirus)
Para testar a segurança da vacina (por exemplo, a vacina oral poliovírus)
No entanto, eles estão cada vez mais sendo descartados pelas seguintes razões:
Criação e manutenção de animais infectados com vírus patogênicos são caras.
Animais inteiros são sistemas complexos em que às vezes é difícil discernir
eventos.
Os resultados obtidos nem sempre são reprodutíveis devido à variação do hospedeiro.
Utilização desnecessária ou desperdício de animais de experimentação é moralmente repugnante.
Eles estão sendo rapidamente ultrapassados pela ciência moderna (cultura de células e biologia molecular).
O uso de plantas inteiras como organismos hospedeiros não dá origem às mesmas objeções morais como a utilização de animais vivos e continua a desempenhar um papel importante no estudo de vírus de plantas, embora tais sistemas sejam muitas vezes lentos para entregar resultados e caros de manter. 
Nos últimos anos, uma tecnologia totalmente nova tem sido empregada para estudar os efeitos dos vírus no organismo hospedeiro. Ela envolve a criação de animais e plantas transgênicos, pela inserção de todo ou parte do genoma do vírus no DNA do organismo experimental, resultando na expressão de RNAm do vírus e proteínas em células somáticas (e às vezes nas células da linhagem germinal). Deste modo, os efeitos patogênicos das proteínas virais, individualmente e em várias combinações, podem ser estudados em hospedeiros vivos. 'Camundongos SCID-hu' foram construídos a partir de linhagens imunodeficientes  de animais transplantados com tecido humano. Estes camundongos formam um modelo interessantepara o estudo da patogenia do vírus da imunodeficiência humana (HIV), já que não há  alternativa real para estudar as propriedades desse vírus importante in vivo. Embora estes técnicas levantem muitas vezes as mesmas objeções morais da “antiquada” infecção experimental  por vírus de animais, elas são novas ferramentas imensamente poderosas para o estudo da patogenicidade dos vírus. Um número crescente de genes de vírus de plantas e animais tem sido analisado desta forma, mas os resultados nem sempre foram como esperado, e em muitos casos tem-se revelado difícil de igualar as observações obtidas com aqueles coletados de infecções experimentais. No entanto, este método irá, sem dúvida, se tornar muito mais amplamente utilizado assim que as dificuldades técnicas relacionadas com a construção de organismos transgênicos sejam resolvidas.
MÉTODOS DE CULTURA CELULAR
A cultura celular começou no início do século XX, com culturas de órgãos totais, em seguida, evoluindo para práticas que envolvem células individuais, ou culturas de células primárias (células somáticas de um animal experimental ou retiradas de um paciente humano que podem ser mantidas por um curto período de tempo em cultura) ou linhagens de células imortalizadas, que, dadas as condições adequadas, continuam a crescer indefinidamente em cultura. Em 1949, John Enders e seus colegas foram capazes de propagar o poliovírus em culturas primárias de células humanas. Esta conquista inaugurou o que muitos consideram a “Era de ouro da Virologia” e levou à identificação e isolamento durante as décadas de 1950 e 1960 de muitos vírus e sua associação com doenças humanas; por exemplo, muitos enterovírus e vírus respiratórios, tais como adenovírus. O isolamento amplamente difundido dos vírus levou à constatação de que infecções subclínicas de vírus foram muito comuns; por exemplo, mesmo em epidemias das estirpes mais virulentas do poliovírus existem cerca de 100 infecções subclínicas para cada caso paralítico da poliomielite. 
Renato Dulbecco em 1952 foi o primeiro a quantificar com precisão os vírus de animais usando um ensaio de placa. Nesta técnica, diluições do vírus são utilizadas para infectar uma monocamada de células cultivadas, que é então coberta com ágar macio para restringir a difusão do vírus, resultando na morte celular localizada e o aparecimento de placas após a monocamada ser corada (Figura 1.1). A contagem do número de placas diretamente determina o número de partículas virais infecciosas aplicadas à placa. A mesma técnica também pode ser usada para clonar biologicamente um vírus (ou seja, isolar uma forma pura de uma mistura de tipos). Esta técnica já tinha sido usada por algum tempo para quantificar o número de partículas de vírus infecciosos nas suspensões de bacteriófago aplicados a confluentes “gramados” de células bacterianas em placas de ágar, mas a sua aplicação a vírus de eucariotos permitiu avanços no estudo da replicação viral. 
Ensaios de placa em grande parte substituíram técnicas anteriores de diluições de ponto final como o ensaio de dose infecciosa de cultura de tecidos (TCID50), que são métodos estatísticos de medição de populações de vírus em cultura, no entanto, as técnicas de ponto final podem ainda ser utilizadas em determinadas circunstâncias, por exemplo, a existência de vírus que não se replicam em cultura ou não são citopáticos e não produzem placas (por exemplo, do vírus da imunodeficiência humana).
MÉTODOS IMUNOLÓGICOS/SEROLÓGICOS
À medida que a disciplina de virologia foi emergindo, as técnicas de imunologia foram também sendo desenvolvidas, e, com a biologia molecular, mais recentemente, as duas disciplinas têm sempre sido muito estreitamente ligadas. A compreensão dos mecanismos de imunidade a infecções por vírus, é claro, foi muito importante. Recentemente, o papel que o próprio sistema imune desempenha na patogênese tornou-se conhecido (ver Capítulo 7).  Imunologia como uma disciplina de direito próprio contribuiu com muitas das clássicas técnicas de virologia (Figura 1.2). 
George Hirst, em 1941, observou hemaglutinação de hemácias por vírus da gripe (ver Capítulo 4). Isto provou ser uma ferramenta importante no estudo não só da gripe, mas também de vários outros grupos de vírus, por exemplo, vírus da rubéola. Além de medir o título (ou seja, quantidade relativa) de vírus presentes em qualquer preparação, esta técnica também pode ser usada para determinar o tipo antigênico do vírus. Hemaglutinação não irá ocorrer na presença de anticorpos que se ligam e bloqueiam a hemaglutinina do vírus. Se um anti-soro é titulado contra um determinado número de unidades hemaglutinantes, o título de inibição da hemaglutinação e especificidade do anti-soro podem ser determinados. Além disso, se soros de especificidade conhecida são usados para inibir a hemaglutinação, o tipo antigênico de um vírus desconhecido pode ser determinado. Na década de 1960 e anos subsequentes, muitos métodos de detecção melhorados para vírus foram desenvolvidos, tais como: 
 Testes de Fixação de Complemento 
Radioimunoensaios
Imunofluorescência (detecção direta de antígenos do vírus nas células infectadas ou tecido) 
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 
Precipitação Radioimune 
Western blot 
Estas técnicas são sensíveis, rápidas e quantitativas. 
Em 1975, George Kohler e Cesar Milstein isolaram os primeiros anticorpos monoclonais de clones de células selecionadas in vitro para a produção de um anticorpo de especificidade única dirigido contra um alvo específico antigênico. Isto capacitou os virologistas para poder olhar não apenas o vírus inteiro, mas em regiões específicas –epitopos- de antígenos de vírus individuais  (Figura 1,3). Essa capacidade aumentou consideravelmente a nossa compreensão da função de proteínas dos vírus individuais. Os anticorpos monoclonais também estão encontrando cada vez mais ampla aplicação em outros tipos de testes serológicos (por exemplo, ELISA) para aumentar a sua reprodutibilidade, sensibilidade e especificidade. 
Não seria apropriado aqui dedicar muita discussão muito para detalhes técnicos sobre o que é também um campo de expansão muito rápida do conhecimento. 
ESTUDOS ULTRAESTRUTURAIS 
Os estudos ultraestruturais podem ser considerados em três áreas: métodos físicos, métodos químicos, e microscopia eletrônica. Medições físicas de partículas de vírus começaram em 1930 com as primeiras determinações de suas proporções por filtração através de membranas coloidais de diferentes tamanhos de poros. Experimentos dessa espécie levaram às primeiras (e imprecisas) estimativas do tamanho das partículas do vírus. A precisão dessas estimativas foi muito melhorada pelos estudos das propriedades de sedimentação do vírus em ultracentrífugas em 1960 (Figura 1.4). Centrifugação diferencial provou ser de grande utilidade na obtenção de preparações purificadas e altamente concentradas de muitos vírus diferentes, livres de contaminação dos componentes da célula hospedeira, que podem ser submetidas a análises químicas. A densidade relativa de partículas virais, medida em soluções de sacarose ou de CsCl, também é um aspecto característico, revelando informações sobre as proporções de ácido nucléicos e proteínas nas partículas. As propriedades físicas do vírus podem ser determinadas por espectroscopia, usando ou luz ultravioleta para examinar o conteúdo de ácidos nucléicos da partícula ou luz visível  para determinar suas propriedades de dispersão de luz. A eletroforese de partículas do vírus intacto rendeu alguma informação limitada, mas a análise eletroforética de cada proteína de um vírion por eletroforese em gel e, em particular também genomas de ácidos nucléicos  (capítulo 3), tem sido muito mais valioso. Entretanto, de longe o mais importante método para a elucidação de estruturas de vírus tem sido o uso de difração de raios-X por formas cristalinas de vírus purificados. Esta técnica permite a determinação da estrutura de vírions em um nível atômico. 
As estruturas completasde muitos vírus, representantes de muitos dos principais grupos, já foram determinadas em uma resolução de poucos angstrons (Å) (ver Capítulo 2). Este avanço tem melhorado nossa compreensão das funções da partícula do vírus consideravelmente, no entanto, um número de vírus tem se mostrado resistente a este tipo de investigação, um fato que destaca alguns dos problemas inerentes a essa técnica tão poderosa. Um problema é que o vírus deve primeiro ser purificado até um grau elevado, caso contrário, informações precisas sobre o vírus não podem ser recolhidas. Isso pressupõe que as quantidades adequadas do vírus podem ser propagadas em cultura ou obtidas a partir de tecidos infectados ou doentes, e que um método está disponível para purificar partículas do vírus, sem perda da integridade estrutural. Em um número de casos importantes, as regras exigem um estudo mais aprofundado (por exemplo, vírus da hepatite C). O vírus purificado também deve ser capaz de formar arranjos paracristalinos grandes o suficiente para causar difração significativa da fonte de radiação. Para alguns vírus, isso é relativamente simples, e cristais grandes o suficiente para ver a olhos nus e que difundem fortemente são facilmente formados. Isto é particularmente verdadeiro para um número de vírus de plantas, tais como o vírus do mosaico do tabaco (que foi cristalizado por Wendell Stanley em 1935) e vírus do mosaico amarelo do nabo (TYMV), estruturas que estavam entre as primeiras a ser determinadas durante a década de 1950. É significativo que estes dois vírus representem os dois tipos fundamentais de partículas virais: helicoidal no caso do TMV e icosaédrica para TYMV (ver Capítulo 2). Em muitos casos, entretanto, somente cristais microscópicos podem ser preparados. Uma resposta parcial para esse problema é usar sempre as fontes de radiação mais poderosos que permitem que os bons dados possam ser coletados a partir de pequenos cristais. Poderosas fontes de superprótons que geram intensos feixes de radiação foram construídas durante as últimas décadas e agora são amplamente utilizadas para esse fim, no entanto, há um limite além do qual este brutal vigor de abordagem deixa de produzir benefícios adicionais. Um número de vírus importantes firmemente recusam a se cristalizar, este é um problema particularmente comum com vírus de forma irregular (por exemplo, aqueles que têm um envelope lipídico externo) e até esta data nenhuma estrutura completa de alta resolução atômica foi ainda determinada para muitos vírus deste tipo (por exemplo, HIV). Modificações da técnica de difração básica (como o espalhamento de elétrons por matrizes de proteína associada a membrana e criomicroscopia eletrônica) podem ajudar a fornecer mais informações no futuro, mas é pouco provável que essas variações resolverão este problema completamente. Uma outra limitação é que algumas das maiores partículas virais, como poxvírus, contém centenas de proteínas diferentes e são, atualmente, demasiado complexas para serem analisadas utilizando estas técnicas. 
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é cada vez mais utilizada para determinar a estrutura atômica de todos os tipos de moléculas, inclusive proteínas e ácidos nucléicos. A limitação deste método é que apenas moléculas relativamente pequenas podem ser analisadas antes que os sinais obtidos tornem-se tão confusos que é impossível de decifrar com a tecnologia atual. Atualmente, o limite de tamanho máximo para essa técnica limita seu uso a moléculas com um peso molecular de menos de cerca de 30.000 a 40.000, bem menos do que até mesmo as menores partículas de vírus. No entanto, este método pode muito bem vir a ser de valor no futuro, certamente, pela análise isolada de proteínas do vírus, se não para vírions intactos. Investigação química pode ser usada para determinar não só a composição global do vírus e da natureza do ácido nucléico que compreende o genoma do vírus, mas também a construção da partícula e da forma como os diferentes componentes se relacionam entre si no capsídeo. Muitos estudos clássicos de estrutura de vírus  tem sido baseados na ruptura progressiva e gradual das partículas por uma lenta alteração do pH ou a adição gradual de agentes desnaturantes de proteínas, como uréia, fenol, ou detergentes. Sob estas condições, informações valiosas podem às vezes ser obtidas a partir de experimentos relativamente simples. Por exemplo, quando a uréia é gradualmente adicionada às preparações purificadas de partículas de adenovírus, elas quebram em um modo ordenado, passo a passo, que libera conjuntos de proteína subvírus, revelando a composição das partículas. No caso da TMV, estudos semelhantes de organização do capsídeo foram realizados por renaturação da proteína capsidial em vários condições (Figura 1,5). Em termos simples, os reagentes utilizados para desnaturar capsideos dos vírus podem indicar a base das interações estáveis entre seus componentes. Proteínas unidas por interações eletrostáticas podem ser eluídas pela adição de sais iônicos ou alteração do pH; aquelas unidas por interações hidrofóbicas não-iônicas podem ser eluídas por reagentes como a uréia, e proteínas que interagem com componentes lipídicos podem ser eluídas por detergentes não-iônicos ou solventes orgânicos. Além de revelar a estrutura fundamental, a desnaturação progressiva pode também ser usada para observar a alteração ou a perda de sítios antigênicos na superfície das partículas, e desta forma uma imagem do estado físico da partícula pode ser desenvolvida. Proteínas expostas na superfície do vírus podem ser marcadas com diferentes compostos (por exemplo, iodine), para indicar quais as partes da proteína são expostos e quais são protegidos no interior da partícula ou por membranas lipídicas. Reagentes de Cross-linking, como psoralenos ou reagentes sintéticos mais recentes com braços laterais de comprimentos específicos  são utilizados para determinar a relação espacial das proteínas e acidos nucléicos em vírus intactos.
Desde 1930, microscópios eletrônicos têm superado a limitação fundamental de microscópios de luz: a incapacidade de decifrar as partículas de vírus individuais, devido a restrições físicas causadas por comprimentos de onda da iluminação da luz visível e a ótica dos instrumentos. A primeira micrografia eletrônica de um vírus (TMV) foi publicada em 1939. Durante os anos seguintes foram desenvolvidas técnicas que permitiram o exame direto do vírus em ampliações de mais de 100.000 vezes. Os dois tipos fundamentais de microscopia eletrônica são o microscópio eletrônico de transmissão (TEM) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) (Figura 1,6). Embora bonitas imagens com o aspecto de três dimensões são produzidas pela MEV, para as investigações práticas da estrutura do vírus ampliações realizáveis com o TEM provaram ser da maior valor. Dois tipos fundamentais de informação podem ser obtidos por microscopia eletrônica de vírus: o número absoluto de partículas de vírus presentes em qualquer preparação (contagem total) e da aparência e estrutura dos vírions (veja abaixo). A microscopia eletrônica pode fornecer um método rápido de detecção de vírus e de diagnóstico, mas, por si só pode dar informações enganosas. Muitos componentes celulares (por exemplo, os ribossomos) podem assemelhar-se a 'partículas tipo vírus', particularmente em preparações brutas. Essa dificuldade pode ser superada usando anti-soros específicos para determinados antígenos virais conjugados a marcadores elétron-densos tais como a proteína ferritina contendo ferro ou suspensões de ouro coloidal. Esta técnica altamente específica, conhecida como microscopia imunoelerônica, está ganhando terreno como um método rápido para diagnóstico. A evolução da microscopia eletrônica tem permitido a investigação da estrutura de vírus frágeis que não pode ser determinada por cristalografia de raios-x. Esta inclui microscopia crio-eletrônica, na qual as partículas virais são mantidas em temperaturas muito baixas em estágios de refrigeração modelo; exame de partículasincorporadas em gelo vítreo, que não rompe as partículas pela formação de cristais de gelo; microscopia eletrônica de baixa irradiação, o que reduz os bombardeamentos destrutivos da amostra com elétrons; e análise de imagens sofisticada e técnicas de reconstrução de imagem que permitem precisão, imagens tridimensionais para serem formadas por várias imagens que, individualmente, apareceriam como de pobre qualidade. Microscopia eletrônica convencional pode resolver as estruturas abaixo de 50 a 70 Å de tamanho (diâmetro atômico é típico 2-3 Å; uma proteína α-hélice, 10 Å, um DNA dupla hélice, 20 Å). Usando estas novas técnicas, é possível resolver as estruturas de 25 a 30 Å. 
Na década de 1950, Sydney Brenner e Robert Horne (entre outros) desenvolveram sofisticadas técnicas que permitiram a utilização de microscopia eletrônica para revelar muitos dos detalhes finos da estrutura das partículas do vírus. Uma das técnicas mais valiosas mostrou ser o uso de corantes elétron-densos, como ácido fosfotúngstico  ou acetato de uranila para examinar partículas virais através da coloração negativa. Os pequenos íons metálicos em tais corantes são capazes de penetrar as fendas mínimas entre subunidades de uma proteína do capsídeo do vírus para revelar a estrutura fina da partícula. Usando esses dados, Francis Crick e James Watson (1956) foram os primeiros a sugerir que capsideos de vírus são compostos de várias subunidades protéicas idênticas arranjadas em simetria helicoidal ou cúbica (icosaédrica). Em 1962, Donald e Caspar Aaron Klug prolongaram estas observações e elucidaram os princípios fundamentais de simetria, que permitem protômeros repetidos formar cápsídeos virais, com base no princípio da quase-equivalência (ver Capítulo 2). Esta abordagem teórica e prática combinada tem resultado na nossa atual compreensão da estrutura das partículas do vírus. 
BIOLOGIA MOLECULAR 
Todas as técnicas de investigação acima são elas próprias "biologia molecular" no sentido original do termo; no entanto, o termo biologia molecular assumiu um significado novo e diferente de 'engenharia genética' ou 'manipulação genética".  Estas técnicas de manipulação de ácidos nucléicos in vitro (isto é, fora de células vivas ou organismos) não incluem uma nova disciplina, mas são uma conseqüência dos desenvolvimentos anteriores em bioquímica e biologia celular nos últimos 50 anos. Esta nova tecnologia poderosa revolucionou a virologia e, em grande medida, tem deslocado o foco da atenção para longe da partícula do vírus, no genoma do vírus.
A infecção viral tem sido muito utilizada para investigar o trabalho das “normais” (isto é, não infectadas) células, por exemplo, para olhar a síntese macromolecular. Isso é verdade, por exemplo, das aplicações de bacteriófagos em genética bacteriana e, em muitos casos em que o estudo dos vírus eucarióticos tem revelado informações fundamentais sobre a biologia celular e a organização do genoma de organismos superiores. Em 1970, John Kates observou pela primeira vez que mRNAs do vírus vaccinia foram poliadenilados na sua extremidade terminal 3´. No mesmo ano, Howard Temin e David Baltimore identificaram conjuntamente a enzima transcriptase reversa (DNA polimerase RNA-dependente) em células infectadas por retrovírus. Este achado quebrou o chamado "dogma central" da biologia que há um fluxo unidirecional de informações de DNA através do RNA em proteínas e revelou a plasticidade do genoma eucarioto. Posteriormente, a purificação desta enzima a partir de partículas de retrovírus permitiu a clonagem de cDNA, que foi acelerou bastante o estudo de vírus com genomas de RNA, uma boa ilustração da natureza catalítica de avanços científicos. Em 1977, Richard Roberts e, independentemente, Phillip Sharp reconheceram que mRNAs de adenovírus foram emendados para remover  seqüências intervenientes (splicing), indicando as semelhanças entre o vírus e genomas celulares.  
 	Pelo menos inicialmente, o efeito desta nova tecnologia foi a mudança da ênfase da investigação, de proteínas a ácidos nucléicos. Com o poder das técnicas desenvolvidas, rapidamente tornou-se possível determinar as seqüências de nucleotídeos de genomas virais inteiros, começando com os menores bacteriófagos em meados de 1970 
e trabalhando até o maior de todos os genomas de vírus, os do herpes e poxvírus, muitos dos quais já foram determinados. 
Esta tecnologia centrada em ácidos nucléicos, além da sua última conquista do seqüenciamento de nucleotídeos e de manipulação artificial de genomas de vírus, também tem oferecido avanços significativos na detecção de vírus e infecções por vírus que envolvam técnicas de hibridização de ácidos nucléicos. Existem muitas variantes desta idéia básica, mas, essencialmente, uma sonda de hibridação, marcada de alguma forma para facilitar a detecção, reage com uma mistura bruta de ácidos nucléicos. A interação específica da seqüência da sonda com seqüências complementares codificadas pelo vírus, onde 
se liga pela formação de pontes de hidrogênio entre os pares de bases complementares, revela a presença do material genético do vírus (Figura 1,7). Esta abordagem tem sido tomada em uma nova fase do desenvolvimento de vários procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos in vitro , tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR), que é uma técnica ainda mais sensível, capaz de detectar apenas uma única molécula de ácido nucléico do vírus  (Figura 1,8). 
 	Mais recentemente, também tem havido um interesse renovado em proteínas virais com base em uma nova biologia que é ela própria dependente de manipulação de ácidos nucléicos in vitro e avanços na detecção de proteínas resultantes da imunologia. Métodos para 
síntese in vitro e expressão de proteínas de DNA clonado molecularmente têm avançado rapidamente, e muitas novas técnicas de análise estão agora disponíveis. Estudos de interações proteína-ácidos nucléicos estão revelando-se particularmente valiosos para a compreensão da estrutura do vírus e expressão gênica. Avanços em eletroforese tem tornado possível estudar simultaneamente todas as proteínas em uma célula infectada por vírus, chamado o proteoma da célula (por analogia com o genoma). 
Os biólogos moleculares têm mais um truque na manga. Devido à natureza repetitiva e digitalizada de seqüências de nucleotídeos, os computadores são o meio ideal de armazenamento e processamento dessa massa de informações. 'Bioinformática' é um termo amplo cunhado na década de 1980 para abranger toda a aplicação de computadores para a biologia. Este pode significar qualquer coisa de inteligência artificial e robótica a análise do genoma. Mais especificamente, o termo se aplica a manipulação por computador de dados de seqüências biológicas, incluindo a análise estrutural de proteínas. A bioinformática permite a inferência de função a partir da seqüência linear e, portanto, é central para todas as áreas da biologia moderna. 
Devido ao fluxo crescente de informações de novas seqüências, os computadores estão sendo utilizados cada vez mais para fazer previsões com base em seqüências de nucleotídeos (Figura 1,9). Estes incluem detectar a presença de fases abertas de leitura, as seqüências de aminoácidos das proteínas codificadas por eles, as regiões de controle dos genes, como promotores e sinais de splice, bem como a estrutura secundária de proteínas e ácidos nucléicos. No entanto (particularmente no caso do RNA), a estrutura secundária assumida pelas moléculas é quase tão importante quanto a seqüência de nucleotídeos primária na determinação das reações biológicas  que a molécula pode sofrer. É necessária cautela na interpretação como previsto, em vez de informações fatuais, e a validade de tal previsões não devem ser aceitas sem questionamento, salvo se confirmadas por dados bioquímicos e/ou genéticos. No entanto, quando a estrutura de uma proteína foi determinada por cristalografia de raios X ou RMN, a forma pode ser precisamente modelada e explorada em três dimensões em computadores (Figura 1.10). 
 	Enquantoo genoma é o ácido nucléico compreendendo toda a informação genética de um organismo, por extensão, "genômica" é o estudo da composição e função do material genético de um organismo. Genômica de vírus começou com o primeiro sequenciamento completo do genoma de um vírus (bacteriófago fX174 em 1977). Grandes bases de dados internacionais de informações de seqüências de nucleotídeos e de proteínas já foram compilados, e estes podem ser rapidamente acessados por computadores para comparar as seqüências recém determinadas  com aquelas cuja função pode ter sido estudado em grande detalhe. No momento da publicação, o seqüenciamento completo do genoma de quase 1500 vírus diferentes tinham sido publicados, com mais aparecendo quase semanalmente (Tabela 1.1).
Assim, temos, em certo sentido, uma volta completa em nossas investigações de vírus - de partículas através de genomas de volta às proteínas novamente, e surgiram com uma medida de compreensão mais profunda desses organismos, entretanto, o ritmo atual de pesquisa em virologia nos diz que ainda há muito mais que precisamos saber.