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DIAGNÓSTICO MOLECULARDIAGNÓSTICO MOLECULAR AULA 8AULA 8 PROFESSORA MARIA CRISTINA PAMPLONA DA SILVA Ao final desta aula, você será capaz de: �Definir diagnóstico molecular; �Descrever as etapas da técnica de PCR;PCR; �Relacionar técnicas moleculares com sua utilização para o diagnóstico. O DIAGNÓSTICO MOLECULAR �É uma poderosa ferramenta capaz de proporcionar informações fundamentais sobre a condição do paciente e seu prognóstico, podendo também em muitos casos auxiliar o médico na escolha do melhor tratamento paramédico na escolha do melhor tratamento para o paciente. �Além disso, em muitos casos, o diagnóstico molecular pode indicar quais indivíduos são portadores de um determinado alelo mutante, mesmo que o indivíduo em questão não apresente qualquer sintoma. Análise molecular em doenças genéticas tem como objetivo �Ocorrência e frequência de mutações em determinadas populações �Localização da mutação;�Localização da mutação; �Características específicas do gene em questão; �Tipo de mutação (mutação pontual, grandes deleções, inserções, etc.), entre outras. Alelos diferentes podem resultar em fenótipos diferentesAlelos diferentes podem resultar em fenótipos diferentes Nos bovinos, o loco P é um dos genes relacionados com a cor da pelagem. Neste caso, o alelo P determina a produção de um pigmento de cor preta na pelagem (devido a produção da eumelanina) e o alelo p, um pigmento de cor vermelha (devido a produção da feomelanina). MUTAÇÃO PONTUAL MUTAÇÃO PONTUAL -- ANEMIA FALCIFORMEANEMIA FALCIFORME EXPANSÃO DA REPETIÇÃO CGG SÍNDROME DO XSÍNDROME DO X--FRÁGILFRÁGIL Dependendo do número de repetições CGG, os indivíduos podem ser classificados em 4 categorias: �normais (apresentam de 6 a 40 repetições CGG), �zona gray (41 a 60), �pré-mutados (61 a 200) �e afetados (mais de 200) Em doenças não genéticas tem como objetivo � Diagnosticar doenças infecciosas; � Identificar o agente infeccioso (vírus, bactérias, protozoários, fungos) através dabactérias, protozoários, fungos) através da detecção do seu material genético; � Estudar o agente infeccioso em questão; � Avaliar a resposta ao tratamento. TÉCNICAS MOLECULARES TÉCNICAS MOLECULARES � Amplificação enzimática do DNA (PCR). � Digestão da fita de DNA genômico ou produto de PCR com enzimas de restrição. � Separação eletroforética do DNA ou do produto de PCR. � Hibridação do DNA ou fragmentos de PCR com sondas oligonucleotídicas. Amplificação enzimática do DNA (PCR)Amplificação enzimática do DNA (PCR) Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase (PCR)(PCR) � Consiste na replicação do DNA in vitro. � É uma técnica que revolucionou a genética molecular, permitindo muitos avanços na área, como a clonagem, a produção de alimentos transgênicos, e etc.transgênicos, e etc. � É considerada uma técnica altamente sensível, por ser capaz de detectar e amplificar DNA a partir de uma pequena quantidade na amostra. � Além disso, é altamente específica, pois é capaz de detectar sequências específicas de DNA, que sejam o alvo do estudo. EXTRAÇÃO DE DNA Preparo da reação de PCR � DNA polimerase (Taq – Thermus aquaticus) � Primers ou iniciadores � Nucleotídeos (A, T, G e C) � Tampão de pH � DNA (ou RNA) � Mg++ MÁQUINA DE PCR MÁQUINA DE PCR (reação em cadeia da polimerase) O princípio básico da PCR está na capacidade de, a partir de quantidades mínimas de DNA, multiplicar uma determinada sequência, de modo que estasequência, de modo que esta se torne majoritária na amostra. Numa reação de PCR, o fragmento de DNA que desejamos multiplicar (ou amplificar) é chamado de fragmento alvo ou DNA molde e constituí um pedaço do gene que se pretende estudar . CLONAGEM CLONAGEM DO DO DNADNA A técnica de PCR se baseia em três etapas.A técnica de PCR se baseia em três etapas. DESNATURAÇÃO: 94ºC a 96ºC O molde de DNA passa a ser dupla fita sobre desnaturação, ou seja, as pontes de hidrogênio se quebram e as fitas se separam, formando duas fitas simples. ANELAMENTO: 37ºC a 65ºCANELAMENTO: 37ºC a 65ºC Quando a temperatura abaixa, os iniciadores (primers) se unem nos sítios de ligação específicos nas fitas simples de DNA para iniciarem a cópia. EXTENSÃO: 72ºC Agora a DNA polimerase termoestável (Taq DNA polimerase) utiliza os dNTPs disponíveis na reação para adicioná-los nas fitas em crescimento, de acordo com a regra de pareamento entre as bases (A-T; G-C); polimerização. TÉCNICA DE PCR TÉCNICA DE ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE TÉCNICA DE ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE A técnica consiste na passagem de fragmentos de DNA em um gel de agarose ou poliacrilamida. O gel possui poros que filtram os fragmentos dependendo do seufragmentos dependendo do seu tamanho ou peso molecular, ao serem submetidos a um campo elétrico. Como o DNA possui carga negativa, decorrente do fosfato de sua estrutura, ele tende a migrar para o polo positivo do campo elétrico. Aplicações da PCR � Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas; � Amplificação de genes para posterior clonagem e estudos de sua expressão;clonagem e estudos de sua expressão; � Determinação de variabilidade genética e identificação; � Detecção de OGMs � Sexagem e diagnóstico de doenças em embriões. OUTRAS TÉCNICAS � Southern blotting: Esta técnica pode ser utilizada em análises de DNA em algumas doenças como Prader Willi e Angelman. � Northern blotting: detecção de sequências de RNA, permite observar o padrão de expressão deRNA, permite observar o padrão de expressão de um determinado gene em diversos tecidos ou a expressão de genes em células tumorais. � Western Blotting: transferência de proteínas, usado nos testes de mal da vaca louca (encefalite espongiforme bovina), em testes de confirmação de Hepatite B e outros. Análise com enzimas de restrição Análise com enzimas de restrição ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO � Endonucleases, também chamadas enzimas de restrição, são proteínas bacterianas que cortam em fragmentos a longa molécula linear de DNA.longa molécula linear de DNA. � As enzimas de restrição são as principais ferramentas da tecnologia do DNA recombinante, usadas pelos biólogos moleculares na manipulação do DNA. A análise com enzimas de restrição é indispensável nas seguintes tarefas: 1. Análise da estrutura dos cromossomos 2. Sequenciamento de DNA 3. Isolamento de genes 4. Criação de moléculas novas de DNA que podem ser clonadas 5. Técnicas como RFLP (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição, é uma técnica bastante utilizada para o estudo do genoma) Teste de paternidadeTeste de paternidade SEQUENCIAMENTO O sequenciamento de DNA corresponde à determinação da ordem dos ordem dos nucleotídeos adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA. SEQUENCIAMENTO
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