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Resumo de MicroImuno Clí nica BL2 1. DSTs: Dentre as DSTs Sífilis, Gonorreia e Clamídia são as mais comuns na clínica. A sífilis apresenta contato exclusivamente direto, enquanto que as demais DSTs podem ser adquiridas com contato indireto. A. GONORREIA: Seu agente etiológico é a Neisseria gonorrhoeae. Pode apresentar coinfecção com Chlamydia trachomatis. e Mycoplasma sp. Neisseria gonorrhoeae é diplococo Gram -, sensível ao ambiente, o que limita a transmissão indireta ao máximo de 5 – 10 min., sendo favorável a transmissão direta. Requer baixo teor de O2 para seu crescimento, o que é diferente da condição de anaerobiose. No homem, promove secreção purulenta, a qual não deve ser coletada no momento da coleta, devendo-se limpar a região e coletar com swab na região da uretra a fim de realizar a bacterioscopia. Na bacterioscopia, quando a amostra é masculina, qualquer diplococo Gram – é diagnóstico de gonorreia, já se a amostra é feminina, o diagnóstico não é fechado. Isso se justifica, pois as mulheres apresentam Neisseria sp. na microbiota. Quando a amostra é ocular, de nasofaringe ou retal, a presença de diplococos também não fecha diagnóstico. Na coleta deve-se coletar 3 swabs: Para bacterioscopia; Para cultura em ágar sangue, ágar chocolate ou Thayer – Martin; Para cultura em baixo teor de O2 para análise molecular, pois o diplococo pode estar no interior de um PMN. Bibliografias antigas indicam que diplococo no interior de PMN configurava um quadro mais grave, mas isso, atualmente, caiu por terra, pois é indiferente, já que em algum momento o diplococo romperá o PMN e estará livre. Utiliza-se duas placas de ágar Thayer – Martin ou ágar chocolate VCN (apresenta Vancomicina, Colistina e Nistatina) além do ágar sangue, a fim de não descartar Streptococcus sp. e Staphylococcus sp. Tais placas devem ser mantidades em microaerofilia (macumba) por 24 horas, após as quais deve-se observar colônias pequenas , opacas, acinzentadas e mucoide. A característica mucoide é mais difícil de visualizar, pois a colônia é pequena e, não é recomendável abrir a placa para observar. As provas bqm para açúcares mostram o seguinte perfil das Neisserias sp.: Glicose Maltose Lactose + - - Neisseria gonorrhoeae + + - Neisseria meningitidis +/- - - Neisseria cinerea Por apresentar a capacidade de fermentar ou não a glicose a Neisseria cinerea pode ser confundida com Neisseria gonorrhoeae. Isso se justifica, pois apesar de fermentar glicose o meio não fica acidificado. Para garantir a identificação deve-se realizar teste de aglutinação com anticorpos específicos para Neisseria cinerea. B. SÍFILIS: Seu agente etiológico é o Treponema pallidum. Há 3 formas de diagnóstico pra sífilis, sendo a identificação direta do Treponema pallidum a forma mais difícil. A sífilis apresenta lesões ulcerativas com borda elevada e indolor, mas em coinfecção com Chlamydia trachomati., outras bactérias e por Herpes simplex, a lesão se apresenta dolorosa. Esse quadro é característico da sífilis primária, sendo este um estágio em que os pacientes quase não procuram os serviços de saúde. A sífilis secundária apresenta petéquias, podendo apresentar alopecia, descamação nas palmas das mãos e dos pés e verrugas, não necessariamente na porta de entrada. Este quadro clínico pode ser confundido com o quadro de lúpus, pois na sorologia o Treponema pallidum apresenta reação cruzada com lúpus. Na sífilis secundária os sintomas são caudados por imunocomplexos, não apresentando utilidade a pesquisa pelo Treponema pallidum. A sífilis congênita apresenta com sinais testa alta, nariz em sela e queixo retraído. Para pesquisa do Treponema pallidum na sífilis primária há 3 formas de identificação: Campo escuro, o qual é uma técnica inespecífica, pois um paciente com menos cuidados de higiene irá apresentar Treponema saprofita. Fontana –Tribondeau, é mais específico que o campo escuro, mais ainda inespecífico. Imunofluorescência direta, é o método mais específico e fecha o diagnóstico para Treponema pallidum. Para que os reagentes do método de Fontana – Tribondeau funcionem, devem ser feitos no momento da pesquisa. Na técnica de campo escuro se observa o Treponema sp.,o qual é um espirilo. Deve-se realizar a pesquisa por anticorpos não treponêmicos a fim de realizar triagem, mas também acompanhamento do tratamento, pois os títulos caem rápido (4X). Deve-se realizar a pesquisa de VRDL ou Louis, e este método é o padrão da OMS, sendo realizado com cardiolipina bovina, a qual aglutina em flocos quando a anticorpos, sejam específicos ou inespecíficos para Treponema pallidum. Há também o teste da Reagina (USR), que utiliza soro não inativado. Há o teste do Vermelho de Toluidina (TQUST), que também é realizado com soro não inativado. Deve-se realizar os testes treponêmincos, caso os testes não treponêmicos não possam emitir mais os resultados positivos. Além disso, os testes não treponêmicos podem estar apresentando resultados positivos advindos de anticorpos inespecíficos, os quais são muito presentes em gestates, em pacientes em hemodiálise, dentre outros. Testes treponêmicos não devem ser utilizados para acompanhamento de tratamento, pois os anticorpos específicos demoram muito tempo para reduzir os títulos. FTA – ABS é um teste de imunofluorescência indireta, sendo o método mais eficaz. Treponema pallidum utilizado é advindo de escroto de coelho estando fixado em lâmina, sobre a qual há a adição do soro do paciente, o qual deve ser tratado para eliminar Treponema saprofita, para então adicionar o anticorpo fluorescente. Deve-se ler a fluorescência na borda da lâmina, pois o Treponema pallidum é bem fino. FTA – ABS com dupla coloração é similar o FTA – ABS, sendo mais caro que este, pois identifica todos. Apresenta FITC para identificação de IgM e FITC com Rodamina para identificação de IgG. Isso é interessante, pois não adiante ver apenas o título de IgM e IgG, pois o título de IgM dura 8 meses. Testede aglutinação (MHA – TP) é um teste que utiliza hemácias de carneiro recobertas de Treponema pallidum. É um teste que pode apresentar falso positivo, caso haja anticorpos autorreativos ou heterofilos. Western Blot é um excelente teste para identificação, porém é extremamente caro, e por conta disto é mais vantajoso realizar testes moleculares que são mais específicos e sensíveis. INNO –LIA é um teste similar ao Western Blot, porém mais barato. Apresenta marcadores para anticorpos do gênero Treponema sp., além dos específicos para Treponema pallidum, como TpN 47,17 e 15, os quais são marcadores de nível de positividade, que se apresentam dessa forma: o Nível +/-, configurando com indeterminado; o Nível 1+ o Nível 3+ Positivos Títulos VDRL (não treponêmico) FTA –ABS (treponêmico) Fase aguda 1:128 1:16 Fase intermediária 1:64 1:16 Fase crônica 1:32 1:128 Na fase aguda há tanto anticorpos específicos quanto inespecíficos, mas os últimos se apresentam em maior quantidade, por isso que os títulos do VDRL são maiores e do FTA –ABS são menores. Na fase crônica os anticorpos inespecíficos vão dando lugar aos anticorpos específicos, por isso que os títulos de VDRL caem e os do FTA –ABS aumentam. Deve-se considerar o teste de aglutinação positivo até apresentar aglutinação máxima sem presença de uma espécie de borda, não devendo-se considerar os títulos que apresente esta espécie de borda. C. CANCRO MOLE: Seu agente etiológico é o Haemophilus ducreyi. As lesões se apresentam com borda amolecidae dolorosa. As amostras devem ser coletas da periferia da lesão com 3 swabs. Pode se apresentar em coinfecção com Herpes simplex. A bacterioscopia com a realização de Gram não oferece grandes informações, pois Haemophilus ducreyi não se cora bem por Gram, devendo então realizar a coloração por Giemsa ou Wright, os quais são corantes hematológicos, nos quais se observará estreptobacilos em forma de cardume. O cultivo deve ser realizado em ágar chocolate e Muller – Hinton com isovitalex, a 5% de CO2 A 33 -35°C em alta umidade por 5 dias em microaerofilia. Apresenta crescimento lento. Após esse período se observará colônias pequenas, não mucoides, amarelo acinzentadas, cuidado para não confundir com Neisseria gonorrhoeae. Para confirmação de que é Haemophilus ducreyi deve-se utilizar anti-soro específico para que aconteça aglutinação, devendo complementar com as provas da porfirina e da catalase, onde Haemophilus ducreyi é duplamente negativo, além da fermentação de açúcares. Pode acontecer de se apresentar catalase positivo, caso se pegue muita amostra. O tubo do teste da porfirina deve-se ser observado com luz U.V com λ 270-280nm, e se o λ usado for muito alto, haverá falso positivo. D. DONOVANOSE: Seu agente etiológico é Calymmatobacterium granulomatis. A amostra deve ser coletada da periferia da lesão, indo do centro para a periferia esfregando para conseguir a célula. Os médicos podem realizar biópsia, raspagem ou curetagem, devendo realizar o diagnóstico diferencial para Herpes simplex e HPV. As amostras devem ser coradas com corantes citopatológicos como Schor, mas é possível corar com H&E, devendo-se evidenciar os corpúsculos de Donovan nos monócitos. Tais corpúsculos são difíceis de serem encontrados, pois os linfócitos TCD8+ e as NK destoem as células, não sendo possível visualizar os corpúsculos. O mais recomendável é realizar métodos moleculares. E. LINFOGRANULOMA VENÉREO: Seu agente etiológico é Chlamydia trachomatis. Promove enfartamento dos linfonodos inguinais e se apresenta positiva para pesquisa para fator reumatoide e proteína C reativa, sendo estes erros de diagnóstico facilmente cometidos. A inflamação decorrente da infecção por Chlamydia trachomatis dificulta engravidar. A inflamação pode inchar a bolsa escrotal. Pode atingir uretra e endocérvice e chegar ao reto, devendo realizar diagnóstico diferencial para câncer, pois no endocérvice pode ser confundido com HPV. O padrão ouro de diagnóstico é a cultura ou a IF direta, os quais são métodos antigos. Nas mulheres a coleta deve ser realizada na uretra e no endocérvice com escova, devendo ser rotacionada 8x, e esse procedimento deve ser realizado na uretra masculina. É um procedimento de coleta muito doloroso. Por isso que, atualmente, se realiza a pesquisa no sedimento urinário, cuja urina é coleta sem desprezar o primeiro jato, o qual apresenta muitas bactérias e células, devendo ser centrifugado e recolhido o sedimento. Com o sedimento urinário pode-se realizar imunocromatografia ou extração de DNA. Com o DNA extraído pode se utilizar as técnicas de PCR específico, Branched DNA, captura híbrida ou NASBA. O paciente que já apresentou clamídia irá apresentar anticorpos para a vida toda e os títulos não caem. F. MICOPLASMA E UREAPLASMA: Os agentes etiológico Mycoplasma genitalium, Mycoplasma meningitidis e Ureaplasma ueralyticum estão envolvidos. Causam uretrite não gonocócica apresentando secreção purulenta similar a da gonorreia. Responsável por casos de infertilidade por causar cervicite e doença inflamatória pélvica. Deve-se coletar a urina total sem desprezar o primeiro jato. Para análise pode- se realizar PCR multiplex e PCR real time, os quais são utilizados para quantificação, mas não é muito significativo, pois não são como os vírus que necessitam de quantificação da carga viral. O swab deve ser guardado. Não é tão útil realizar cultura e isolamento. O PCR real time é o padrão ouro, sendo mais preciso que o PCR convencional. G. HERPES: Seu agente etiológico são os vírus Herpes simplex 2. A lesão se apresenta ulcerada, o diagnóstico é molecular, pois é possível confundir com sífilis, donovanose ou cancro mole. As lesões características da herpes são vesiculares. Os métodos empregados no diagnóstico são PCR, Branched DNA e captura híbrida, além da sorologia para quantificação da carga viral. H. HPV: Seu agente etiológico é o Papilloma Vírus Humano. As lesões são apresentam a forma de verrugas. O diagnóstico é realizado por histopatologia e por métodos moleculares como NASBA, captura híbrida e Branched de DNA. Para lesão plana pode-se realizar o teste do ácido acético 5%, indicando a presença de HPV. I. AIDS Agente etiológico pertence a Família Retroviridae Genero: Lentiviridae. Testes de triagem (Dot Blot, Imunocromatografia ou ELISA). Testes específicos – ELFIA, Western Blot. Sondagem molecular – PCR e NASBA. Carga viral – Amplicor Roche®, NASBA. 2. FAMÍLIA VIBRIONACEAE: DIARREIA SÍNDROME DESINTERIFORME SÍNDROME COLERIFOME Presente na Shigellose Presenta na cólera Diarreia com sangue. Invasão da submucosa pela bactéria - atinge o plexo mioentérico - cólicas Toxigênica, pois a bactéria se liga e libera a toxina – inversão do fluxo de água e eletrólitos. Diarreia aquosa. Os membros da família Vibronaceae são bastonetes Gram -, fermentadores de glicose com produção de ácido, com ou sem produção de gás. Reduzem nitrato a nitrito. São oxidase positivos, o que os difere da família Enterobacteriaceae, os quais são oxidase negativos. Há espécies que promovem infecção intestinal e extraintestinal. A. Vibrio Cholerae: Está em curso a 7º pandemia por Vibrio Cholerae, que está sendo causada pela cepa O1 EITOR, mas que no Brasil apresenta a característica de surto. Biotipo Subtipo Fermenta glicose sem a produção de gás. As sorogrupos O1e O139 são os que se apresentem de modo epidêmico e causam a cólera. O139 não está presente no Brasil. Nem todas as cepas causam cólera, mas causam diarreia mais branda e não espalhável.Os sorgrupos que não O1e não O139 apresentam toxina que são Shiga like, ou a própria toxina colérica, mas que causam diarreia mais branda e não espalhável. O biotipo EITOR apresenta maior capacidade de espalhamento, com isso causa menos casos graves e mais inaparentes, o que favorece a disseminação, já que os indivíduos inaparentes não são tratados. No teste de CAMP a hemólise é sinégica, na qual o doador de β lisina é semeado no meio das amostras, as quais são semeadas em spots, e o teste positivo apresenta hemólise pontual em torno do spot. Apresentam habitar aquático com tendência endêmica, sobrevivendo, principalmente, na superfície ou abaixo de 10ºC no sedimento, resistindo bem em meio aquático. Sobrevive em pH de 5.5 – 10, mas seu pH ótimo é de 7 – 9, ou seja apresenta preferência por pH alcalino e isto é usado no diagnóstico, com a utilização de água peptonada alcalina (APA). Na APA todos os vibrios crescem, mas Vibrio Cholerae cresce primeiro e neutraliza o meio. A cólera apresenta período de incubação de 6h a 5 dias, sendo o crescimento, normalmente encontrado, em 2 a 3 dias. Os sintomas são dores abdominais, náuseas, vômitos, desidratação com grande perda de flúido, a qual pode levar a morte. O tratamento, inicialmente deve se realizado com reposição de água e eletrólitos, o que reduz muito o mortalidade, devendo acontecer rapidamente. A dose infectantesdepende da resistência do indivíduo e do uso de antiácidos e varia em : 106 células viáveis (média), 108 UFC água; 103 UFC alimentos; 102 UFC crianças desnutridas. Vibrio Cholerae é eliminado nas fezes e pelo vômito, podendo ser transmitido via alimentos e água contaminados. Jon Snow identificou a transmissão da cólera pela água (esse sabia de tudo! Hahahh não resisti), pois antes se acreditava na teoria miasmática de trasmissão pelo ar. Na clínica, ao realizar o diagnóstico, se identifica apenas gênero e espécie, onde usando soro anti – O1 se aglutinar é O1, se não aglutinar é não O1. No entanto, ser não O1 não impede de produzir a toxina colérica, bem como outras toxinas como termoestável (NAG – ST) e a Shiga like, além de outros fatores como enzimas. Os sintomas de diarreias por sorogrupos não O1: A coleta de amostra consiste em swab retal, ou inserir o swab no frasco coletor, inserir no meio de transporte e quebrar a ampola. O meio de transporte indicado é o Cary – Blair, mas a amostra pode ser colocada direto na APA, mas sem ignorar a coprocultura tradicional. As amostras podem ser conservadas em APA por 12 h e no Cary – Blair por 24 -72h a temperatura ambiente, ou por 7 dias sob refrigeração. Em outros sítios de infecção, como feridas, olhos e ouvidos deve se coletar com swab, podendo também realizar hemocultura e urinocultura. Pode-se realizar a pesquisa em frutas, verduras, pescado e mariscos, na qual coleta-se 25g de amostra e coloca-se no APA 1% NaCl ou 3% de NaCl, pois pode não ser vibrio. Deve-se realizar o enriquecimento da amostra, o qual é um processo no qual os meios utilizados apresentam substâncias que inibem o crescimento das bactérias da microbiota, favorecendo o crescimento de bactérias patogênicas, mas isso difere de meios ricos. No caso de Vibrio Cholerae, o enriquecimento é feito em APA por 6h a 37ºC e, após as 6h deve-se semear em meio seletivo indicador como o TCBS, pois se retornar com o APA para a estufa haverá o crescimento de outras enterobactérias. Se deixar APA na estufa por 18 – 24h a semeadura deve ser feita no GSP para a pesquisa da família Aeromonadaceae. O meio TCBS apresenta sacarose e, quando fermentar a sacarose (positivo) o meio se tornará amarelo indicando a presença de Vibrio cholerae, no entanto, se não fermentar a sacarose (negativo) o meio se apresentará verde indicando a presença de Vibrio parahaemolyticus ou Vibrio vulnificans. O TCBS apresenta tiossulfato como fonte de enxofre, e o meio ficará preto quando a bactéria o utilizar, apresenta também sais biliares que impede o crescimento de enterobactérias. Quando a amostra é oriunda do APA e foi semeada no TCBS a certeza é maior de que seja Vibrio Cholerae, do que se amostra veio por semeadura direta no TCBS. LIA Provas BQM de identificação conclusiva da espécie : •Produção de gás - glicose Fezes Semeadura direta TCBS 18 - 24 h 37ºC Enriquecimento APA 6 -8h 37ºC Semeadura no TCBS Meio de triagem TSI (3 açúcares) LIA (lisina - ferro) CV KIA (Kliger - Ferro) Ágar nutriente - ver Citocromo oxidase Sorologia aglutina Vibrio Cholerae O1 Não aglutina é Vibrio Cholerae não O1 ou outro vibrio Provas Bqm para identificar qual vibrio • Produção de ácido - glicose, lactose, sacarose, manitol, arabinose , manose • Descarbo xilação - lisina e ornitina • Hidrólise - arginina •Crescimento em caldo nutriente - 0, 3, 6, 8 e 10% NaCl •Produção de acetoína •Sensibilidade O129 (2-4 diamino,6-7 diisopropil pteridine) Não se pode realizar semeadura direta com alça que não for de platina no teste da oxidase, pois se for oxidase + haverá cor e se oxidase – não há cor, para tanto as os padrões + e -. Halofilismo é importante para classificação, devendo-se utilizar caldo com NaCl e semear com agulha e pouco inóculo, para a identificação se observa a tabela para identificar o crescimento correspondente. O129 é um antimicrobiano vibriostático, e para este teste deve-se semear de modo semelhante com o antibiograma. Todos os Vibrios são sensíveis e O129, devendo diferenciar da família Aeromonadaceae, que é resistente. Existem duas vacinas contra o cólera, ambas de uso oral, mas a proteção é relativa e de curta duração. A Dukoral protege em 85% dos casos, somente contra o tipo O1 e só por cerca de quatro a seis meses após a imunização.A Schanchol pode ser administrada em pessoas a partir de um ano de idade, protege também contra a linhagem O139 e tem efeito mais duradouro em crianças entre um e cinco anos.Por não oferecerem 100% de proteção e terem efeito por pouco tempo, as vacinas não são oferecidas pela rede pública no Brasil. Seu uso é recomendado para quem vai visitar locais em que a cólera é endêmica. B. Vibrio minicus: Produz toxina colérica, enterotoxina e outros fatores de virulência. É variante sacarose – de Vibrio cholerae O1, que causa diarreia não epidêmica. Quadro diarréico – consumo de pescado não cozido – ostras. Otite contato com o ambiente marinho em temperatura superior a 22ºC. C. Vibrio parahaemolyticus: Vph/K+ apenas presente nas amostras clínicas e não nas ambientais. Sua ocorrência se dá em águas estuárias e costeiras por todo o mundo. Isolados de crustáceos e pescado, os quais, quando consumidos crus ou cozidos, realizam a contaminação, podendo realizar contaminação cruzada com vegetais. Seu tempo de geração é de 10 min. à 37ºC, apresentando alto índice nos meses de verão. É sacarose -. Promove gastroenterite em indivíduos saudáveis e septicemia em indivíduos imunocomprometidos. Seu período de incubação é de 15h e, é uma infecção autolimitante com severidade moderada. As cepas patogênicas produzem TDH (hemolisina direta termoestável), promovendo hemólise no ágar Wagatsuma, e a realização da hemólise é chamada de Fenômeno Kanagawa, sendo K+. É oxidase +, apresenta flagelo polar, é halofílico ( crescendo em concentração maior que 3% NaCl), glicose +, sacarose – , e urease variável. É anaeróbio facultativo. É realizada a sorotipagem para os antígenos O e K, onde o primeiro é antígeno somático e o segundo capsular, a fim de identificar as cepas. Vibrio mimicus e Vibrio parahaemolyticus são sacarose – diferindo do Vibrio cholerae, que é sacarose +, mas ambos irão crecer sem mudar a cor do TCBS para amarelo, para diferenciar, coleta-se as colônias e semeia no ágar Wagatsuma a fim de evidenciar o Fenômeno Kanagawa. D. Vibrio vulnificus: Causa diarreia branda e autolimitante. Frequentemente causa infecções extra- intestinais, apresentando alta mortalidade. Se apresenta ver no TCBS em função de ser sacarose -. Três síndromes clinicamente distintas: Quadro septicemico – lesões cutâneas – índice de mortalidade de 70% (consumo de pescado, especialmente ostras, sem cocção). Ferimentos X ambiente marinho celulite – ocasionalmente quadro septicemico (evolução pode ser fatal). Gastroenterite autolimitada, embora prolongada condições debilitantes (consumo abusivo de álcool). 3. FAMÍLIA AEROMONADACEAE: São bacilos Gram -, apresentam flagelo polares, não esporulam, são anaeróbios facultativos. Glicose, oxidase e catalase positivos, muitas produzem gás. Resistente a O129. Crescem em temperaturas na faixa de 4 – 45ºC no pH na faixa de 5,5 – 9,0. Apresenta importância econômica, pois arrasa om o cultivo de peixes, uma vez que promove o aumento da mortalidade dos mesmos. Formam biofilme, podendo crescer em sistemas de tratamentode água, resistindo a cloração. São autóctones do ambiente aquático. Como fatores de virulência apresentam hemolisinas, proteases, leucocidinas e fosfatases, Endotoxinas, Enterotoxinas( citotônicas ≈ cólera – perda intensa de líquido; citotóxicas – danos aos enterócitos), Adesinas (aderência às células – Pili tipo IV), Invasinas – (invasão de células HEp-2 e Caco-2), além da mobilidade. Com esses fatores promove agressão das células epiteliais intestinais. Principais infecções em humanos: Infecções de ferimentos: subsequente a exposição à água e/ou solo. Maior incidência nas estações quentes. Infecções diarréicas agudas e crônicas. Septicemia: usualmente associada c/ doenças crônicas (hepatite, cirrose, falência renal, leucemia, anemias etc). Infecções do trato urinário, meningites, endocardites, septicemias secundárias, otites e infecções oculares (desde conjuntivite branda até úlcera de córnea e endoftalmites – normalmente associadas ao uso de lente). Diagnóstico: No ágar GSP: Usa Ágar Sangue Ampicilina, pois Aeromonas spp., são resistentes à Ampicilina. 4. INFECÇÕES SNC 5. INFECÇÕES TGS: São infecções que apresentam a contaminação por via fecal – oral, direta ou por veículo. Saliva, lisozima, fluxo e peristaltismo, pH ácido, muco, microbiota IgA de mucosa e fagocitose são os mecanismos que limitam a fixação das bactérias, a fim de impedir a colonização. Indivíduos que comem grandes quantidades de comida, podem adquirir bactérias no interior desta, sem que as mesmas sofram ação do suco gástrico, por estarem escondidas na comida. Na síndrome desinteriforme os mecanismos de invasão englobam a penetração dos microrganismos nos enterócitos → produção ou não de citotoxina → destruição das células → localização a nível de sub-mucosa. Reação tipo inflamatória (migração de macrófagos e PMN). Região vascularizada. Plexos nervosos. Já na síndrome colerifome os mecanismos são toxogênicos e englobam a ligação da célula bacteriana a receptor dos enterócitos (fator de colonização – CFA I, II, III – pili ou fímbria) → liberação de toxinas → ativação do sistema adenil ciclase e/ou guanil ciclase → inversão do fluxo de absorção e eliminação de água e eletrólitos → aumento de água na luz intestinal. De uma forma compartiva, há diarreia contendo mais sangue e pus, precedida por cólica, e com menor volume de fezes na síndrome desinterifome, enquanto que na síndrome coleriforme, o volume de fezes é maior, bem como a frequência de evacuações e o aspecto aquoso das fezes. Como um teste rápido para diferenciação entre síndrome desinteriforme e coleriforme é a adição de uma gota de fezes em lâmina, sobreposta com lamínula com azul de metileno. Nesse teste não observamos nenhuma célula na síndrome coleriforme, enquanto que observamos piócitos e células descamativas na síndrome coleriforme. A família Enterobacteriaceae é composta por bastonetes Gram -, fermentadores de glicose com produção de ácido, com ou sem produção de gás. Reduzem nitrato a nitrito e são A síndrome desinteriforme afeta os plexo mioentérico e submucoso, promovendo diarreia com cólica, e presença nas fezes de sangue, muco e pus. oxidase negativas. As espécies mais frequentemente encontradas em diarreias são E. coli (EPEC, EIEC, EHEC, ETEC, EAEC), Salmonella, Shigella e Yersinia enterocolitica. Yersinia enterocolitica não é um patógeno clássico, cuja presença na rotina laboratorial não é frequente, por apresentar caráter psicrófilo para o primeiro crescimento, no qual deve acontecer a semeadura e incubação na geladeira. Para o enriquecimento há meio com manitol, que deve ser posto na geladeira a 4ºC. O repique deve ser feito para DCA em 7, 14, 21 e 30 dias a fim de negativar a presença de Yersinia enterocolitica. Após 7 dias na geladeira se repica para o DCA, vendo o crescimento no DCA, a temperatura ambiente, em 14, 21 e 30 dias. Se houver crescimento, devem ser realizada a triagem e as provas bqm. A. E.coli: Algumas cepas intestinais (microbiota) podem causar infecção do trato urinário (Ag K); bacteremias ( a partir do trato urinário) e meningites (responsável por 1/3 em neonatos). Algumas cepas expressam fatores de virulência, provocando infecções no trato gastrointestinal. As cepas que causam doença diarréica apresentam mecanismos patogênicos distintos e diferem em relação às suas características epidemiológicas Acomentem majoritariamente crianças. Por isso que é importante saber a idade das fezes, para direcionar a pesquisa . Ainda não há EHEC no Brasil. a) EAEC: Causa diarréia persistente infantil. Semelhante a ETEC, diferença está relacionada com aderência não uniforme, tendendo a formar agregados. Apresenta a produção de toxina semelhante ST e hemolisina e toxinas. Seus sorogrupos não definidos. b) EPEC: Promove alteração na ultraestrutura das células da mucosa do hospedeiro. Promove a formação de pedestal sob as células e alongamento das microvilosidades. Causa diarréia e outros sintomas:, que são decorrentes da invasão, aumento dos níveis de Ca++ e interferência com absorção de água, determinada pela destruição das microvilosidades. Mais invasivas que ETEC e EAEC, capazes de causar resposta inflamatória. Diarréia se apresenta líquida severa e prolongada com muco, febre e desidratação, elevada taxa de mortalidade. Dose infectante baixa em crianças. c) EIEC: Apresenta invasão de células do cólon e disseminação para adjacentes. Promove diarréia indistinguível da produzida por Shigella sp. Podem produzir SHU (sindrome urêmica hemolítica), principalmente em crianças. Causa doença inflamatória da mucosa intestinal e da submucosa, com diarréia líquida, dor abdominal severa, vômitos, tenesmo, cefaléia, febre, calafrios e mal-estar generalizado. Dose infectante: 101 a 102 células.Período de incubação: 10 a 18h após ingestão do alimento contaminado. d) ETEC: Apresenta quadro clínico semelhante à cólera, porém, com menor severidade. Produção de toxinas LT (Termolábil) e ST (Termoestável). Apresenta capacidade de produção de adesinas (CFA/I e CFA/II). Causa diarréia líquida, dor abdominal, febre baixa, náuseas e mal-estar. Geralmente auto-limitada, durando no máximo 5 dias; crianças e idosos debilitados, reposição hidroeletrolítica. Dose infectante: 107 a 1010 células (crianças, doses menores). Período de incubação: 12 a 24 horas. Suscetibilidade e resistência: imunidade soroespecífica; múltiplas infecções com diferentes sorotipos são necessárias para se desenvolver amplo espectro de imunidade. e) EHEC: Apresenta produção de toxina “Shiga-like” ou verotoxinas. Intimamente relacionadas, em estrutura e atividade, à toxina produzida por Shigella dysenteriae. Produzem SHU. Promove quadro agudo de colite hemorrágica (grande quantidade de toxina, severo dano a mucosa intestinal), apresentando cólicas abdominais intensas e diarréia (inicialmente líquida, se torna hemorrágica na maioria dos casos), ocasionalmente ocorrem vômitos, febre baixa ou ausente. Doença auto- limitada, com duração de 5 a 10 dias. Esta infecção pode desencadear um quadro de Púrpura Trombocitopênica (PTT). A semeadura é direta, sem enriquecimento, pois apresenta grande quantidade, pois E.coli pertence à microbiota, apresentando diferenciação entre as espécies patogênicas e da microbiota apenas na sorologia. A probabilidade de encontrar espéciepatogênica aumenta quando de pegam 10 colônias. Presença de pigmento metálico no EMB. EMB evidencia as colônias lactose +. O pigmento metálico não é exclusivo de E.coli. Com a utilização de meios de enriquecimento há destruição da microbiota, destruindo, portanto, E.coli, sendo inútil a cultura em meio de enriquecimento. B. Shigella sp. Pertence à família Enterobacteriaceae. Bacilos Gram-negativos não produtores de esporos e não fermentadores de lactose. Aeróbio facultativo, imóveis, fermentam glicose s/ gás – exceto certos sorotipos S.flexneri, são acapsulados – exceto certos sorotipos S.flexneri e S.boydii. A transmissão se dá pelo contato direto pessoa-pessoa, alimentos e água contaminados, através de moscas. Dose Infectante: 10¹ – 10² células Portador: <30 dias. Período de Incubação: 1 – 3 dias. O diagnóstico acontece da seguinte maneira: Qualquer colônia com detalhe de cor indica que houve a utilização da lactose do meio, por isso as colônicas lactose + são coloridas e as lactose - são transparentes. Coleta: fezes durante a fase aguda da doença (maior probabilidade de encontrar o patógeno) ou swab retal –Espécime processado rapidamente ou mantido em solução glicerol-salina tamponada ou meio de Cary & Blair (meio de transporte) –Diagnóstico: •Meios: MacConkey, XLD e SS –18 a 24 horas em 37ºC –Colônia lactose negativas – Kligler ou TSI –Provas Bioquímicas •Testes de aglutinação em lâmina com antissoros polivalentes somáticos de grupo. C. Salmonella spp. Bastonetes Gram negativos, anaeróbios facultativos da família Enterobacteriaceae. A patogênse da Salmonelose acontece da seguinte forma: Colonização da face apical, com alteração da superfície das células epiteliais com penetração das salmonelas no vacúolo. A maioria das bactérias se associa e a seguir destrói células M das placas de Peyer. O período de latência é seguido de multiplicação celular intensa, após 12-24h a maior parte das células apresentam grandes vacúolos repletos de salmonelas. Após bacteremia transitória, migram para linfonodos e macrófagos do fígado e baço, órgãos os quais apresentam um tropismo particular; Podem se multiplicar no fígado e baço, disseminando-se a partir daí para a corrente sanguínea. O diagnóstico da Salmonelose é realizado da seguinte maneira: Cultura com identificação de colônias isoladas –Meios de cultura e material clínico: •Sangue – ágar-sangue •Fezes – meios seletivos (ex.:SS, Hektoen, Agar Sulfito de Bismuto) –Identificação em gênero e tipo sorológico •Gênero – provas bioquímicas (SIM, citrato, Lis,etc.) •Sorotipos – sorologia Ágar SS Ágar SB Salmonella thyphi: Febre tifóide: febre, mal-estar, cefaléia, náusea, vômito e dor abdominal, podendo ser acompanhada de erupção cutânea. S.Typhi é bastante resistente ao frio e ao congelamento, resistindo também ao calor de 60ºC por 1 hora. Pouco resistente a luz solar.Bastante sensível ao hipoclorito. Transmissão por via fecal-oral, por comida contaminada por portadores durante o processo de preparação e manipulação do alimentos (geralmente com alto teor de proteínas, saladas cruas, leite, crustáceos). Período de incubação: 1 a 3 semanas em geral, em média 2, podendo ser curto como três dias e longo até 56 dias em função da dose infectante e da facilidade de proliferação do agente em determinados alimentos.Tratamento: Droga de primeira escolha, cloranfenicol. Colicistectomia frequente-mente soluciona o problema de portador permanente. D. Yersinia spp.: São bastonetes Gram -, apresentam flagelos peritríquios (22-30°C), são psicrotróficas (4 a 40°C), anaeróbios facultativos e oxidase negativa. Seu mecanismo de patogenicidade consiste em adentrar pela porta de entrada, que é por via oral, com posterior adesão e colonização do íleo. Promovem febre, dor abdominal e diarréia (apendicite), produzindo ileíte terminal, linfadenite e enterocolite aguda, com manifestações secundárias de eritema nodoso, poliartrite e, com frequência, septicemia e endocardite. Está relacionada com surtos de apendicite. É o meio que realiza a melhor triagem, mas é muito trabalhoso de preparar. Apresenta textura semissólida na parte inferior e sólida na parte superior. Apresenta indicador de Andrade (ácido) e Azul de timol (alcalino), apresenta ambos, pois apresenta ureia, a qual mediante a preseça da urease bacteriana forma amônia e alcaliniza o meio. Como fatores de virulênica Yersinia spp. apresenta, como na Y. enterocolitica, enterotoxina termoestável (Yst) → 25-30°C → patogenicidade nula, proteínas de adesão/invasão → YadA, e excreção de proteínas antifagocíticas → Yops. O teste de Séreny é o teste que detecta a invasão, e por conta da invasão há a síndrome desinteriforme, apesar de ocorrer a produção da enterotoxina, a qual é produzida a baixas tempertaturas. Nos ágar SS e DCA apresenta crescimento em forma de ovo frito. 6. COPROCULTURA: 7. CAMPYLOBACTER: São Bacilos Gram –, finos, curvos ou em forma de S, móveis com único flagelo em 1 ou ambas extremidades (movimento em torno do eixo - saca rolha). Espécies são oxidase + , não fermentam nem oxidam carboidratos. Seu crescimento acontece em microaerofilia (5-7 % de O2 , 10% de CO2 e 85% N2) – atmosfera normal 20,95% de O2 , 0,039% de CO2 e 78,09% N2. Zoonose de distribuição mundial! Período de incubação : 2 a 10 dias . Doença é autolimitante. Período da infecção: 1 a 7 dias. O microrganismo é excretado nas fezes durante várias semanas. Infecção depende dos fatores do hospedeiro e do patógeno. A patogênese acontece da seguinte maneira: 1º coloniza a mucosa intestinal, em seguida invade através da superfície epitelial o tecido subjacente, promovendo inflamação na lâmina própria e abcessos nas criptas, em função disto há presença de hemácias e leucócitos nas fezes. A coleta da amostra pode ser realizada através de swab retal , por evacuação espontânea (Frasco). A amostra deve ser processada + rápido possível (sensível ao O2). Os meios de transporte utilizados são Água Peptonada Alcalina com tioglicolato e cistina , meio de Stuart modificado e meio de Cary & Blair. Nâo há enriquecimento, a amostra é semeada diretamente em meio seletivo para Campylobacter sp. A inclusão dos antibióticos foi crucial para o isolamento, pois: Vancomicina = inibe cocos Gram +, Polimixina B = inibe enterobactérias e Pseudomonas spp, Trimetoprim = inibe Proteus spp e cocos gram +, Cefalosporina = inibe Enterobacter spp, Serratia spp, P. aeruginosa, Proteus spp e Yersinia enterocolitica, Anfotericina B = inibe fungos. A atmosfera de cultivo deve apresentar substituição de uma atmosfera normal por uma mistura apropriada de gases (bomba de vácuo). Para tanto pode-se utilizar geradores de gases comerciais. Ex: BBL, Oxoid, Bio-Meriuex e Probac ou geradores opcionais: Passivação do Cobre. Na bacterioscopia o diagnóstico presuntivo acontece com a visualização dos bacilos em forma de gaivota. São oxidase e catalase positivos. 8. INFECÇÕES TRATO URINÁRIO 9. URINOCULTURA 10. TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS 11. IMUNOENSAIOS A. AGLUTINAÇÃO: Os princípios da reação consistem em: Formação de pontes entre o anticorpo e o antígeno, na eficiência dos anticorpos IgM. Normalmenteaplicadas com antígenos específicos ligados a partículas teoricamente inertes. Tipos de aglutinação: Na aglutinação direta utiliza-se o antigeno e os anticorpos, a fim de que os mesmos se liguem e aconteça a aglutinação. Pode acontecer com antígeno comercial e anticorpos do soro do paciente. Já na aglutinação passiva utiliza-se uma partícula inerte que apresenta antígenos em sua superfície e, quando adicionado os anticorpos haverá a aglutinação. Há uma série de diluições do antígeno ou do soro do paciente, a fim de observar a partir de qual diluição há o início da aglutinação, conferindo o título do teste. A aglutinação passiva reversa consiste no inverso das metodologias acima. A partícula inerte é revestida com anticorpos e quem será adicionado são os antígenos, ou seja, o complexo partícula inerte - anticorpo é comercial e se adiciona o soro do paciente contendo os antígenos, os quais quando realizarem a reação antígeno anticorpo irão promover a aglutinação. Na inibição da aglutinação há anticopos ou antígenos comerciais e antígenos ou anticorpos do soro do paciente, os quais se entratem em contato irão aglutinar. Contudo, com a finalidade de não aglutinar há a adição de partícula inerte revestida com antígenos que irão se ligar aos anticorpos impedindo a reação antígeno – anticorpo. Os anticorpos deslocados da ligação com seu antígeno podem ser ligar ao antígeno da partícula inerte e promover uma aglutinação negativa. Ou seja, o resultado será positivo quando não ocorrer aglutinação. As partículas usadas nas reações de aglutinação podem ser hemácias (hemoaglutinação), bactérias, gelatina, partículas de carvão, polímeros ou látex. Na aglutinação com látex, há os anticorpos aderidos a partícula de látex e quando o soro do paciente, contendo os antígenos for adicionado haverá a aglutinação. B. TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA : São ensaios que utilizam a dispersão da luz. Ensaios de turbidimetria com partículas de látex medem a quantidade de luz perdida com auxílio de um espectrofotômetro. Os ensaios de dispersão da luz são baseados nas características coloidais das soluções, respeitando o efeito Tyndal, no qual o comprimento de onda se mantém e o efeito de Dispersão de Rayleigh-Debye – tamanho da partícula. Na Nefelometria o tubo contendo a amostra é submetido a luz, sem filtro, e tal luz é dispersar ao se encontrar com o tubo, podendo ser detectada pelo fotodetector, o qual está acoplado ao analisador que fornecerá as informações acerca da amostra. A Turbidimetria apresenta um esquema semelhante. C. FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO: É um ensaio antigo, servindo de padrão ouro para o desenvolvimento de novos testes, pois se conhece todos os seus problemas e como resolve-los. Consiste na determinação do consumo ou não do complemento. Para saber se há anticorpo para determinado antígeno deve-se inativar o complemento presente no soro do paciente, com o aquecimento a 56ºC por 30 min., a fim de identificar se o paciente apresenta tal anticorpo, testando isso com a utilização de antígeno conhecido e titulado. Nesse teste se usa complemento titulado de cobaia. O complemento deve ser titulado a fim de evitar quantidades deficiêntes ou em excesso. O complemento adicionado irá destruir o imunocomplexo construido com o antígeno titulado e os anticorpos do soro do paciente. Os imunocomplexos e o complemento são solúveis, e para que haja a visualização do teste se adiciona o sistema de hemolisina, que consiste em hemácias de carneiro com anti-soro de carneiro e, se restar complemento haverá a lise da hemácia, ou seja, será dado como teste positivo se não ocorrer lise, indicando que todo o complemento foi consumido na reação com o imunocomplexo contendo o anticorpo do paciente e, teste negativo, quando houver lise, em qualquer quantidade, indicando que o complemento não foi totalmente consumido e atuou no sistema hemolisina de carneiro. A sensibilidade do teste depende da qualidade do complemento, do sistema hemolisina e de quem esteja realizando a técnica. D. CH50 e CH100: São testes mais ultrapassados, facilmente substituídos por ELISA e quimioluminescência. São testes que avaliam a atividade da cascata do complemente do indivíduo. Pacientes com muitas infecções purulentas e furúnculos, apresentam complemento pouco funcionante ou não funcionante. As proteínas do complemento são lábeis e, após duas horas da coleta, se o soro não for processado haverá 30% de redução em função da ação da via alternativa do complemento. A coleta da amostra deve ser do sangue total e sem anticoagulante, com adição no banho maria e os primeiros 300µL de soro obtidos já são suficientes para a realização da análise. Gelo seco é bom para conservar contra a redução do complemento, mas é bem difícil de conseguir, além do ácido formado no vapor promover a ativação do complemento, se o frasco não estiver bem fechado. Nitrogênio líquido também é uma opção, mas também não é fácil de conseguir. Esses testes devem ser realizados em duplicata e com controles positivo e negativo, pois o sobrenadante e o material do paciente serão lidos no espectrofotômetro. Nesse teste a pipetagem é um fato limitante, devendo ser realizada no máximo 5 amostras de uma só vez. O objetivo é observar se o complemento causa lise no sistema hemolisina. Inicialmente foi criado para ver a atividade da via clássica do complemente, pois não se conhecia a via alternativa, mas acaba por avaliar a atividade de todas as vias. E. AH50: É um teste desenvolvido para avaliar a atividade da via alternativa do complemento e, supõe-se que também avalia a atividade da via das lectinas. Não é um teste muito requisitado. Sua diferença para o CH50 é o fato de que o tampão utilizado é GVB + EGTA. EGTA é empregado, pois a via alternativa trabalha em pH “ácido” (7,1). Se utilizam hemácias de carneiro puras e não com sistema hemolisina. É mais utilizado em testes para pacientes com câncer e doenças autoimunes, a fim de observar se o tratamento está apresentando ações deletérias sobre o complemento. Tanto AH50 quanto CH50 se apresentarão positivos quando acontecer a lise, e negativos quando não apresentar lise, diferente do teste de fixação do complemento. F. ANTI-ESTREPTOLISINA O: Só é válida quando há a comparação dos títulos, fora isso é melhor realizar a procura com anticorpos contra DNAse, os quais indicam melhor se a infecção está em curso. O teste consiste em adição do soro do paciente com anticorpos em matriz com estreptolisina O comercial,haverá a formação do imunocomplexo. Esses imunocomplexos serão adicionados em sistema com hemácias O- (mas se o paciente apresentar Rh +, deve-se utilizar O+), o qual será o sistema revelador. Se ocorrer lise, o teste será negativo, indicando que o paciente não apresenta anticorpos contra estreptolisina O e esta hemolisou as hemácias, mas se não ocorrer lise, indica o teste como positivo, pois o paciente apresenta anticorpos anti – estreptolisina O, não permitindo que esta hemolise as hemácias. É um teste que não identifica a classe do anticorpo. O teste deve ser repetido a fim de avaliar se o título aumentou ou diminuir. O grande erroé o fato de que os médicos não comparam os títulos e vendo os títulos altos sem comparar, prescrevem sempre antibióticos. G. ELISA: É um teste que emprega 3 controles: 2 controles positivos e 1 controle negativo, principalmente os testes da segunda geração em diante, os quais são realizados em microplacas. Proteínas são borrifadas na placa, com posterior adição do antígeno que se deseja testar, constituem a base dos testes de primeira geração. Nos teste de segunda geração em diante se direciona o epítopo para a região que se deseja. O conjugado apresenta uma enzima ligada, e esse conjugado é um anticorpo, cuja porção FC apresenta a enzima ligada, a qual pode se soltar com agitação e com o tempo. A enzima trabalha com substrato, o qual, também é facilmente perdido. Já o material de captura presenta na placa dura mais tempo, sendo mais estável. Nos ensaios homogêneos se adiciona os reagentes um sobre o outro, sem realização de lavagem para retirar o que restou. Com isso há mudança da carga iônica e a resposta enzimática é alterada em função da resposta imune. Nos ensaios heterogêneos a cada incubação há lavagem para retirada do que restou a cada etapa, podendo realizar lavagem por no mínimo 3 e por no máximo 6 vezes. Com isso a reação enzimática não está diretamente envolvida com a resposta imune. A enzima peroxidase é utilizada em testes de triagem, pois reagem apenas com determinada quantidade de substrato, e nos testes de quarta geração há menor erro na avaliação da leitura. Até a quarta geração, os testes são usados para diagnóstico. No entanto, para o MS, no Brasil todo teste de ELISA é de triagem. A fosfatase alcalina é uma enzima submetida a menos interferência, sendo utilizada em testes de diagnóstico, independente da geração. A fosfatase alcalina sofre interferência apenas em meio ácido, sendo muito utilizada em kits para pesquisa de marcadores tumorais. A β – D –Galactosidase também quase não apresenta interferência. Problema da reação de Elisa: Ligação não específica à fase sólida Alta absorbância do controle negativo Resultados abaixo do esperado para a amostra em estudo Presença de anticorpos heterófilos Presença do Fator Reumatóide Na reação cruzada irá depender qual é o antígeno ou anticorpo, por isso que na hora que vai comprar um kit peça a bula, se o fabricante não deu a bula é um mau sinal, é regra estabelecida por mim. (Exemplo sobre o gasto dele sobre o kit para a pesquisa.)(risos) A não especifica é com anticorpo heterofilo? Também, o anticorpo heterofilo é outro que fará a reação não especifica é a famosa reação cruzada. Não especifica pode ser anticorpo heterofilo, pode ser o kit de má qualidade por não ter o anticorpo de boa qualidade ou não tem o antígeno de boa qualidade, por isso antes de comprar o kit verifica o material que tem nele, qual o tipo de anticorpo, o controle de qualidade, o fabricante. Absorbância do controle negativo alta, isso é típico quando a placa é mal lavada ou quando o kit está com a famosa peroxidase que começou a ativar antes então muito colorido torna-se positivo. O mais comum para verificar que acontece é realizar uma lavagem (Entre cada etapa de incubação há uma lavagem = ensaio heterogêneo (bota o soro do paciente, incuba, lava para remover o não ligado)). O resultado abaixo do esperado ou o paciente está com problema de pré-zona ou pró-zona, se está procurando antígeno é pré-zona, se é anticorpo é o pró-zona. Os ensaios que mais possuem problema são: Sífilis, toxoplasmose, anticorpo autoimune, gestante (apresenta pró-zona, pré-zona e anticorpo heterofilo até dizer chega). Sífilis e Toxoplasmose produzem anticorpo até dizer chega, a Hepatite B também na janela imunológica. Sempre que uma mulher chegar ao laboratório perguntar se já menstruou, para adequar o ensaio que irá utilizar, perguntar também qual o ciclo. Muito anticorpo heterofilo quando o ciclo for irregular. Se houver tantos dias de atraso, desconfia de gravidez, utilizar um ensaio mais especifico para evitar os problemas da pré-zona e pró-zona, principalmente no primeiro trimestre de gravidez. Na fase de produção de estrogênio é a fase de mais anticorpo heterofilo. Padrão de fluorescência chamado citoesqueleto é típico de doença autoimune por fator reumatoide, o padrão centroamérico é típico de escleroderma, padrão pontilhado ou fino é típico de lúpus erimatroso, mas não sistêmico, se é só no núcleo é o sistêmico. O único que sabemos que é lúpus sistêmico é o padrão chamado luma, só encontra anticorpos do centrômero. Anticorpo heterofilo sempre necessita de cuidado principalmente se o paciente acabou de apresentar uma melhora na doença, acabou de ter uma gripe, decorrente da resposta imunológica primaria. Não utiliza kit de triagem. Anticorpo reumatoide, outro que dá problema, porém trata a amostra antes com antireumatoide e o heterofilo. Se a reação permitir ou irá aumentar o tempo de incubação, pois os anticorpos e os antígenos específicos irão se encontrar ou aumenta em meio grau a temperatura de incubação, ativava mais as enzimas e não atrapalha o trabalho. São problemas que só se resolvem com base química, porém se o kit não permite modificar o parâmetro não adianta. O fator reumatoide no final do processo infeccioso é um IgM, se tem um método de pesquisa de IgM ou seja captura de anticorpo da classe IgM primária possui um sério risco de ter um alto titulo, por isso que assim doenças infecciosas que irá procurar IgA, IgM, quer procurar uma classe de anticorpo prefiro que tenha o antígeno para a classe do anticorpo se ligue. ELE FALOU QUE NÃO IA SE ATER A UM SLIDE POIS É ASSUNTO DE CONCURSO E ENCONTRA-SE EM LIVRO. TABELA QUE FALA DE IMUNOENSAIO E QUE OS LIVROS SEMPRE COPIAM. (ELE FALOU MAL, FALOU QUE TEM MUITA BABOSEIRA E A SOLUÇÃO SEMPRE É A DILUIÇÃO. E SEM DADO DO PACIENTE NÃO SE REALIZA NADA). Valor baixo para tudo a solução é o pH tampão. (FEZ UM COMENTÁRIO SOBRE A VIGILÂNCIA SANITARIA SOBRE A VALIDADE DO KIT.). E amostra não condizente é o famoso anticorpo heterofilo. Uma reação de Elisa que não tem enzima, o único problema a mais é que o anticorpo que teremos é necessário titular o conjugado obrigatoriamente, se for automatizado não precisa, terá o problema do tampão. Variações do ELISA: a) IMUNOBLOT ou SPOTBLOT: Na placa há Ig humana e 2 tipos de antígenos. Quando adicionamos o soro do paciente, se este apresentar antígeno, cuja Ig é contra, haverá a ligação, mas se o soro contém anticorpos contra um dos dois antígenos haverá a ligação com estes. Então se adiciona o conjugado, lava-se e adiciona-se o substrato, o qual irá conferir cor. É um teste para diagnóstico, apenas conferindo a informação se há presença ou ausência, não funcionando para quantificação. b) IMUNOCROMATOGRAFIA: É um teste utilizado para diagnóstico, mas como o Imunoblot, não funciona para quantificação. É semelhante ao teste de gravidez de farmácia, mas este não apresenta sistema de filtração da amostra Na imunocromatografia, a amostra é filtrada por carga elétrica, permitindo a passagem apenas dos anticorpos desejados. Há o anticorpo de captura e o conjugado composto de enzima e substrato. Quando o antígeno se liga ao anticorpo de captura ativa o sítio da enzima e esta promove a emissão de cor. No entanto, deve-se atentar ao fato de que a zona de controle também deve acender. H. IMUNOFLUORESCÊNCIA: Fluorescência é uma reação de Elisa que não tem enzima,apresenta o fluorofilo. O principio é o mesmo, você terá o conjugado, só que no lugar da enzima do conjugado, teremos uma molécula fluorescente. Podem-se fazer ensaios iluminescente via microscópio, via aparelho. Os principais problemas do kit estão no conjugado. Principio básico da fluorescência, a molécula quando está conjugada irá emitir um comprimento de onda maior, quando o elétron pula de orbita e volta. Não confunda fluorescência com fosforescência, pois essa exige excitação elétrica (baixa amperagem elétrica), a fluorescência exige a excitação luminosa. Só depois que acaba a excitação luminosa que exibe a fluorescência. Dois tipos de fluorescência: 1)Direta: Coleta o material do paciente e fixa na lâmina, agora pega o conjugado com a molécula fluorescente e incuba, lava para remover o que não ficou preso e levar ao microscópio que emite a luz no comprimento de onda que irá excitar, pois depende do fluorofilo. Problemas: Cada antígeno para pesquisar necessita ter um conjugado diferente, por exemplo, um conjugado para toxoplasma, um para herpes, um para micobacteria tuberculose, um para zika. É um método fácil para fazer, curto, mas é caro. Usamos um contra corante com intuito de inibir fluorescência inespecífica do material do paciente da lâmina, exemplo: azul de hevans (rendimento alto) e azul de metileno, faz só o fluorofilo emitir luz, não deixa emitir luz as demais células presentes. 2)Indireta: A lâmina já apresenta o antígeno fixado, logo é uma busca do anticorpo por aquele antigeno. Por exemplo, quero saber se meu paciente tem anticorpos para toxoplasmose, compro a lâmina com o toxoplasma fixado nela, jogo o soro do paciente em cima, incubo, lavo e jogo o conjugado (anticorpos para imunoglobulina humana), incubo, lavo e levo ao microscópio. O que eu tenho a mais aqui? Uma etapa. O que eu ganho com essa etapa a mais? Meu ensaio fica mais barato, pois meu conjugado usado é secundário, única coisa que muda é minha lâmina com material fixado. Essa reação por mais que seja demorada, é mais barata que a imunofluorescência direta. HOMOLOGADA EM PADRÃO OURO. O anticorpo para imunoglobulina já é marcado com fluorofilo, mas para marcar é fácil, só misturar o anticorpo e o marcador e passar em cargas em coluna que fará a ligação. A indireta e a direta apresentam o mesmo nível de especificidade, depende do conjugado, do material e também da experiência em ler. O que se espera de um marcador? (Tabela no slide) Ser estável por longo período, a maioria não dura muito tempo, em uma hora o fluorofilo se perde; Alta capacidade de absorção e rendimento, isso a maioria tem; Não interferir com a reação de anticorpo, quanto maior o tamanho do fluorofilo menor a interação com o anticorpo, está mexendo com a carga iônica do anticorpo. Os dois mais usados: Fluoresceína, não dura por muito tempo, mas é barato; Rodamina. Os menos usados: Proteínas: (azul) aplica em doenças virais por direta principalmente, mas também indireta, emite luz 30x mais que a Fluoresceína; Fosforecente: não necessita energia eletrica para emitir luz (nome mal dado), extremamente sensível, métodos por fish; Umberiferona (substituto da Fluorescína): é instável, rápido, método automatizado, barato. Microscópio hipofluorescente: Luz vem debaixo, mas tem um problema dependendo do fluorofilo que estiver utilizando, pois a luz que vem debaixo como ela é excitada passa por um filtro de comprimento de onda, tem que ter lentes de quarts permite o comprimento de onda adequado se não perde muita resolução, a luz passa pelo condensador, pela objetiva e vai para o olho. Filtro azul é proteção para o olho. O microscópio confocal é totalmente automatizado, só imagem eletrônica. Microscópio epifluorecente: Luz vem de cima. Quando a objetiva está alinhada com o papel, a luz irá bater e quando tira a objetiva não haverá luz. (SEGURO, FILTRO PARA EVITAR A LUZ NA RETINA.). Como problemas da IF, temos: Sensibilidade do ensaio Operador experiente na leitura das lâminas Lâmpada no final da vida útil Alta concentração de partículas coloidais e proteínas na amostra Alteração do pH do tampão usado ou da glicerina Presença de anticorpos heterófilos e auto anticorpos Conjugado necessita ser titulado I. ELFIA: ELFIA: Usa as mesmas enzimas, só modifica o substrato que irá emitir fluorescência; fosfatase alcalina, peroxidase, só apresenta esses substratos por ser mais baratos e mais específicos. A enzima precisa quebrar esse substrato para ele produzir luz. Esse método se baseia em que? Fará duas leituras: colorimétrica e fluorimétrica, dependendo do fabricante da maquina irá aceitar um desvio máximo de cor e luz para validar aquele resultado. Geralmente quando a maquina não valida resultado, quer dizer que maquina produziu cor demais e luz de menos, logo o aparelho identifica que algo ativou demais a enzima antes, ou seja, a enzima começou a trabalhar sem mais nem menos, principalmente a peroxidase. O que pode ter ativado? O material do paciente alterado, caiu sabão, algo aconteceu. Vantagem em relação ao Elisa: Mais especifico na positividade da reação e na quantificação, ou seja, na precisão. Mais utilizado em laboratórios grandes. Problemas: Os mesmo do Elisa e os mesmo da fluorescência. Quase sempre é: pH do tampão, tempo de incubação e o anticorpo heterofilo. GARANTE MAIOR SENSIBILIDADE. Método permitiu mais parâmetros para garantir precisão. J. QUIMIOLUMINESCÊNCIA: LUMINESCÊNCIA: Enzimoquimoiluminescência. Enzima quebra a molécula para emitir luz por excitação química por pouco tempo (segundos). Antigamente precisava de ativação química, por exemplo, peróxido de hidrogênio, cobre, paládio, níquel. (catalisadores). Atualmente são utilizadas enzimas tais elas: peroxidase, galactoxidase. E a molécula que será quebrada pelas enzimas é: acridina, e o resto (mais caros). Inventaram sistema de transferência de energia: você tem anticorpo de captura marcado com o elemento fluorescente, faz ensaio competitivo onde tem a amostra do paciente e uma equivalente a do paciente marcada com luminol. Quando o anticorpo marcado com a fluoresceína se liga a molécula com o luminol e tem a ativação enzimática, emite luz em um comprimento de onda bem maior, e o aparelho detecta os dois comprimentos de onda. ENSAIO COMPETITIVO COM PRECISÃO E EXATIDÃO. Totalmente automatizado. Enzimas utilizadas: fosfatase alcalina, peroxidase, galactoxidase. K. CAMADA FINA: ENSAIO DE CAMADA FINA: Ensaio onde você gasta menos água no laboratório, Jonhson conseguiu e domina o mercado. Associou-se com a Kodak. Problemas: Como estabilizar o anticorpo de captura, o sistema não é confiável, utiliza a quimioluminescência, mas apresenta essa plataforma que a capacidade filtrante não funciona bem. (SÓ FALOU ISSO) = SISTEMA DE QUIMICA SECA: Cromatografia associada à quimioluminescência. A leitura se baseia em luz emitida, em contato com a placa e contagem. Variação do Elisa. L. WESTERN BLOT: WESTERN BLOT: Método mais específicos. Quando compra o kit, tem o fracionamento todo das proteínas do antigeno. Quebra do antigeno é melhor com enzima, pois será uniforme, o ultrassom e carga elétrica irão gerar partículas diferentes, o que leva a menos especificidade. Separação em gel de acrilamida, a trama é sempre uniforme, após o fracionamento realiza a transferência. Temos dois tipos de transferência: 1)Úmida: A membrana é colocada com o gel de acrilamida na cuba para fazer a transferência elétrica (os antígenos da acrilamida para o suporte por carga eletrica) e está banhadaem solução tampão. NÃO OCORRE DESNATURAÇÃO DAS ENZIMAS. 2)Seca: Acrilamida, membrana e papel de filtro embebido em solução tampão. Coloca um eletrodo em cima e outro embaixo e transfere. Método muito rápido, mas a carga elétrica é alta, quando separa saí vapor e as proteínas menores ou termolábeis desnaturam. NÃO TÃO ESPECIFICO. Enzimas: peroxidase, fosfatase alcalina, galactoxidase. SE FOR POR TRANSFERÊNCIA SECA MELHOR NÃO REALIZAR, NÃO DETECTA TUDO DEVIDO AS PROTEINAS INATIVADAS POR DESNATURAÇÃO.
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